全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 2期，2010年 2月120
收稿 2009-10-15 修定 　2009-11-30
* 通讯作者(E-mail : wbshenh@nja u.edu.cn; Tel: 0 25-
8 4 3 9 5 7 7 3 )。
外源一氧化碳对铁胁迫下的离体水稻叶片氧化伤害的缓解作用
吴亭亭, 徐晟, 孙永刚, 吴洪洪, 沈文飚 *
南京农业大学生命科学学院, 生命科学实验中心, 南京农业大学 -贝克曼离心机合作示范实验室, 南京 210095
提要: 不同饱和度的外源 CO水溶液预处理离体水稻叶片, 可以浓度依赖性地缓解铁胁迫引起的硫代巴比妥酸反应物质
(TBARS)含量的上升, 并诱导铁蛋白基因表达。此外, 50%饱和度的CO水溶液还能不同程度地逆转由于柠檬酸铁胁迫引
起的叶中抗坏血酸过氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的上升。
关键词: 离体水稻叶片; 铁胁迫; 一氧化碳; 氧化伤害; 铁蛋白
Alleviation of Exogenous Carbon Monoxide on Iron-Induced Oxidative Da-
mage in Detached Leaves of Oryza sativa L.
WU Ting-Ting, XU Sheng, SUN Yong-Gang, WU Hong-Hong, SHEN Wen-Biao*
College of Life Sciences, Laboratory Center of Life Sciences, Cooperative Demonstration Laboratory of Centrifuge Technique,
Nanjing Agricultural University and Beckman Coulter Ltd. Co., Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: In this report, pretreatment with different exogenous carbon monoxide (CO)-saturated aqueous
solutions was not only able to dose-dependently alleviate the increase of thiobarbituric acid reactive substances
(TBARS) content in Fe-citrate-stressed detached rice leaves, but also to induce the expression of ferritin genes.
Further research also showed that 50% CO-saturated aqueous solution could block differentially the enhance-
ment of ascorbate peroxidase (APX) and superoxide dismutase (SOD) activities.
Key words: detached rice leaves; iron stress; carbon monoxide; oxidative damage; ferritin
作为一种过渡金属元素, 铁是细胞色素及氧化
还原依赖性蛋白必需的辅助因子, 参与植物的光合
作用、呼吸作用以及氮代谢等生命活动(Guerinot
和Yi 1994)。研究表明, 植株体内铁过量积累会发
生 Fenton反应(Fe2++H2O2→ Fe3++·OH+OH-), 诱发
羟基自由基(hydroxyl radical, ·OH)的产生, 从而加
剧细胞膜的氧化伤害, 破坏其完整性, 最终导致细
胞死亡(Guerinot和Yi 1994)。Pekker等(2002)报
道, 过量铁引起的抗氧化机制与其他金属离子引起
的抗氧化机制不同, 铁可以作为酶的辅基, 促进抗
坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)的合
成。已知, 铁蛋白是细胞内游离铁的 “储存库 ”, 能
够有效存储体内过量游离铁, 降低 Fenton反应, 从
而减少过量铁对植物造成的损伤(Briat和Lobréaux
1997)。Majerus等(2007)的研究揭示, 过量硫酸亚
铁(500 mg·L-1)胁迫可以提高非洲水稻根、鞘和叶
片内APX和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,
SOD)的活性, 并可诱导脂质过氧化以及具有抗氧化
特性的铁蛋白表达。Fourcroy等(2004)的研究结
果也支持 Pekker等(2002)的观点, 并认为铁引起的
APX基因的表达不受过氧化氢(H2O2)的影响。同
时, 他们还认为铁诱导的铁蛋白能与细胞内过量的
游离铁离子结合, 从而降低铁通过Fenton反应产生
的 ·OH, 减轻其对植物细胞的氧化伤害。
另有研究表明, 过量铁能够引起一氧化氮(NO)
的积累, 进而诱导铁蛋白的表达(Murgia等 2002)。
与NO相类似, 由血红素加氧酶(heme oxygenase,
HO)催化产生的一氧化碳(CO)也是动植物细胞内的
信号分子, 能够调节细胞内多种新陈代谢过程
(Dawson和 Snyder 1994; Dulak和 Józkowicz 2003;
陈坚等 2009)。Otterbein等(2003)的工作揭示, 低
浓度的 CO可以缓解老鼠肺部的氧化伤害。近年
来的研究表明, CO也参与植物的各种生理代谢过
程。例如, 外源 CO可以缓解盐胁迫下水稻悬浮细
胞的死亡进程, 并与其对抗氧化防护的调节有关(王
智等 2009)。此外, 我们实验室最近的研究(Xie等
2008)表明, 盐胁迫可以诱导小麦幼苗叶中的CO释
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放, 外源 CO可以通过上调NO提高小麦幼苗的耐
盐性。Han等(2008)的结果表明, CO预处理不仅
降低镉胁迫引起的紫花苜蓿根部APX活性及其表
达量的上升, 而且还可通过调节谷胱甘肽的代谢提
高其抵抗重金属镉胁迫的能力。据此, 本文以离体
水稻叶片为材料, 研究 CO预处理对铁胁迫下离体
水稻叶片硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituric acid
reactive substances, TBARS)含量、抗氧化酶活性
以及铁蛋白编码基因表达的影响。
材料与方法
实验材料选择中晚熟水稻品种 ‘武育粳 3号 ’
(Oryza sativa L. cv. Wuyujing 3), 由江苏省农业科学
院提供。5 0 mmol · L - 1的柠檬酸铁母液由 1 0 0
mmol·L-1硫酸亚铁(用 0.06 mol·L-1 HCl溶解)和 200
mmol·L-1柠檬酸钠等体积混合而成, 然后用去离子
水稀释至实验所需要的浓度(50、100、500和 1 000
µmol·L-1)。根据Xie等(2008)文中的方法, 用浓硫酸
与甲酸共热制备CO气体[ H2SO4 (液)+HCOOH (液)→
CO (气)+ H2SO4·H2O (液)], 得到的 CO气体通入盛
有去离子水的玻璃烧杯中, 持续 15 min, 以确保溶
液达到饱和, 然后用去离子水稀释至实验所需要的
浓度(1%、10%和 50%), 现用现配。CO清除剂
血红蛋白(haematoglobin, Hb)购自南京基天生物技
术有限责任公司。
水稻种子表面用 5%次氯酸钠消毒 30 min, 清
水洗净, 转入 30 ℃暗处催芽培养 2 d。挑取大小
一致的露白种子排放于浮板上, 在光照培养箱[光照
周期为 14 h (光)/10 h (暗), 温度为 30 ℃, 光照强度
约为 300 μmol·m-2·s-1]中培养 12 d。取两叶一心期
水稻幼苗叶片, 从茎端 1 cm处剪去根, 将剪下的茎
端及其上部置于去离子水中静置 1 h, 以尽量缓解
伤害胁迫; 然后置于不同浓度的柠檬酸铁(0、50、
100、500和 1 000 µmol·L-1)中处理 9 h或 24 h。
为了进一步深入研究, 进行如下处理, 各处理代号
和处理方法分述如下: (1) Con→ Con, 去离子水处
理 3 h后, 用去离子水继续处理 9 h; (2) Con→ Fe,
去离子水处理 3 h后, 用 500 µmol·L-1柠檬酸铁再
处理 9 h; (3) CO 1%→Fe, 1% CO饱和水溶液处理
3 h后, 用 500 µmol·L-1柠檬酸铁再处理 9 h; (4) CO
10%→ Fe, 10% CO饱和水溶液处理 3 h后, 用 500
µmol·L-1柠檬酸铁再处理9 h; (5) CO 50%→Fe (CO
→ Fe), 50% CO饱和水溶液处理 3 h后, 用 500
µmol·L-1柠檬酸铁再处理 9 h; (6) CO 100%→ Fe,
100% CO饱和水溶液处理 3 h后, 用 500 µmol·L-1
柠檬酸铁再处理 9 h; (7) CO→ Con, 50% CO饱和
水溶液处理3 h后, 用去离子水再处理9 h; (8) Hb→
Con, 0.1 g·L-1 Hb处理 3 h后, 用去离子水再处理9 h;
(9) Hb→ Fe, 0.1 g·L-1 Hb处理 3 h后, 用 500 µmol·L-1
柠檬酸铁再处理 9 h。上述所用处理液的 pH值均
用NaOH/HCl调至 5.4。
膜脂质过氧化(以TBARS为指标)根据Han等
(2008)文中方法测定, APX和过氧化氢酶(catalase,
CAT)活性参照Huang等(2006)和 Sa等(2007)文中
方法测定, SOD活性按照 Beauchamp和 Fridovich
(1971)文中方法测定。以牛血清白蛋白为标准蛋
白测定蛋白含量(Bradford 1976)。
处理后离体水稻叶片用液氮研磨, 按照 Trizol
Reagent (Invitrogen, Gaithersburg, MD)说明书提取
总RNA, 并进行RT-PCR分析。cDNA第一条链合
成的反应体系为 20 μL, 含有1.5 μL RNA样品和2.5
U 鸟类成髓细胞性白血病病毒逆转录酶(AMV反转
录酶, TaKaRa)。PCR反应体系为 25 μL, 含有 1
μL cDNA, 10 pmol·L-1终浓度的引物, 1 U TaqTM 聚
合酶; 反应循环参数为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变
性30 s, 50~56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸40 s, 25~30个
循环; 72 ℃延伸 10 min。实验中针对各目的基因
使用的引物分述如下。OsFer-1 (GenBank登录号
为AF519570), 上游引物为5 ACGAGCAGATCAA-
TGTGGAGTAC 3, 下游引物为 5 ATGGATGGA-
AGAAACGAAACC 3, 扩增片段长度为 529 bp。
OsFer-2 (GenBank登录号为AF519571), 上游引物
为 5 CCTTGACAGAGTTCGACCAT 3, 下游引物
为5 CATTGCTACTGCGTGCTT 3, 扩增片段长度
为 4 0 4 b p。水稻 A c t i n ( G enB a nk 登录号为
NM_001057621), 上游引物为 5 CTTCGTCTC-
GACCTTGCTGGG 3, 下游引物为5 GAGAAACA-
AGCAGGAGGACGG 3, 扩增片段长度为 667 bp。
以 Actin基因mRNA的相对含量为内参, 对目的基
因的转录本水平进行 RT-PCR半定量分析。凝胶
电泳结束后, 用溴化乙锭染色后检测, 并克隆测序
验证。采用Quantity One软件对相应基因相对表
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达进行条带定量分析, 为便于比较, 设定相应对照
处理(0 µmol·L-1柠檬酸铁处理 9 h或Con→Con)的
OsFer表达量为 1。
实验结果至少是 3次独立实验的平均值, 用
SPSS 8.0软件作统计分析。选择Duncan’s multiple
test作显著性统计分析。
结果与讨论
1 柠檬酸铁对离体水稻叶片脂质过氧化的影响
氧化应激发生的活性氧(reactive oxygen species,
ROS)能氧化生物膜, 产生大量脂质过氧化产物。
其中, TBARS涵盖了大部分氧化伤害产生的醛酮类
物质, 因此, 常用来作为衡量脂质过氧化的指标
(Umbach等 2005)。图 1结果显示, 柠檬酸铁胁迫
下离体水稻叶片TBARS含量的上升具有浓度梯度
和时间诱导效应。与去离子水(0 µmol·L-1柠檬酸
铁)相比, 500和1 000 µmol·L-1 柠檬酸铁处理9 h后,
表 1 不同浓度柠檬酸铁处理 9 h后对离体水稻叶片中APX、SOD和CAT活性的影响
Table 1 Effects of different concentrations of Fe-citrate (continuance of stress for 9 h) on
APX, SOD, and CAT activities in detached rice leaves
柠檬酸铁浓度 /μmol·L-1 APX/μmol·mg-1(蛋白)·min-1 SOD/U·mg-1(蛋白) CAT/μmol·mg-1(蛋白)·min-1
0 0.40±0.003c 5.28±0.191b 0.25±0.005b
5 0 0.43±0.013c 5.36±0.862b 0.27±0.001a
100 0.46±0.017b 5.88±0.328b 0.28±0.002a
500 0.55±0.005a 8.68±0.509a 0.29±0.009a
1 000 0.57±0.026a 9.49±0.905a 0.29±0.012a
同一列数字旁字母不同表示在 P<0.05水平差异显著。
叶片内TBARS含量分别上升了55.2%和63.6 %。此
外, 用去离子水处理 24 h的水稻叶中 TBARS含量
变化相对较小, 而 500 µmol·L-1柠檬酸铁处理的
TBARS含量则随着处理时间的延长而呈上升趋势
(24 h内, P<0.05)。
2 不同浓度柠檬酸铁对离体水稻叶中抗氧化酶活
性及铁蛋白基因表达的影响
表 1和图 2结果显示, (1)柠檬酸铁胁迫 9 h离
体水稻叶片中APX、SOD和 CAT酶活性随柠檬
酸铁浓度的增加呈不同程度的上升趋势。与去离
子水处理相比, 500和1 000 μmol·L-1柠檬酸铁胁迫
的各种酶活性均达到显著水平( P< 0 . 0 5 )。5 0 0
μmol·L-1柠檬酸铁处理后的APX、SOD和CAT活
性分别上升 37.5%、64.4%和 16.0% (表 1); (2)柠
檬酸铁还明显诱导铁蛋白编码基因的表达。其中,
500 μmol·L-1柠檬酸铁处理9 h的OsFer-1和OsFer-
2转录本的诱导表达效果较明显, 且OsFer-1基因诱
图 1 不同浓度柠檬酸铁对离体水稻叶片中 TBARS含量及其时间进程变化的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of Fe-citrate on TBARS contents in detached rice leaves and its time-course
数据中不同的字母表示差异达到 P< 0 . 0 5 水平。
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导表达丰度较高; 与 500 μmol·L-1柠檬酸铁处理相
比, 1 000 μmol·L-1柠檬酸铁处理则下调了OsFer-1
和OsFer-2基因的表达(图 2)。
图 2 不同浓度柠檬酸铁处理 9 h后对离体水稻叶片中铁蛋
白基因表达的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of Fe-citrate
(continuance of stress for 9 h) on OsFer gene transcripts
in detached rice leaves
3 外源CO对柠檬酸铁胁迫下离体水稻叶中脂质
过氧化和铁蛋白基因表达的影响
图 3结果表明, 与单加柠檬酸铁处理(Con→
Fe)相比, 不同饱和度的CO水溶液预处理能不同程
度缓解 500 μmol·L-1柠檬酸铁胁迫 9 h对水稻叶片
的脂质伤害。其中, 50%和 100% CO饱和水溶液
图 3 不同饱和度CO溶液预处理对柠檬酸铁胁迫 9 h 后离
体水稻叶片中 TBARS含量的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of CO-saturated
aqueous solution pretreatment on TBARS contents in 9-hour-
Fe-citrate-stressed detached rice leaves
处理的缓解效果最明显, 其叶片中TBARS含量分别
下降 30.8%和 37.4%。
半定量 RT-PCR的结果显示, 不同饱和度的
CO水溶液预处理柠檬酸铁胁迫9 h后的水稻叶片,
能进一步诱导OsFer-1基因的表达(图4)。相反, 对
OsFer-2基因表达的诱导效果较小。 鉴于铁蛋白具
有抗氧化的特性(Murgia等 2002; Pekker等 2002;
Fourcroy等 2004; Majerus等 2007), 推测铁蛋白
OsFer-1可能参与了 CO抗柠檬酸铁的胁迫。
图 4 不同饱和度CO溶液预处理对柠檬酸铁胁迫下离体
水稻叶片中铁蛋白基因表达的影响
Fig.4 Effects of different concentrations of CO-saturated
aqueous solution pretreatment on OsFer gene transcripts in
Fe-citrate-stressed detached rice leaves
4 外源CO对柠檬酸铁胁迫下离体水稻叶片中抗
氧化酶活性的影响
表 2结果显示, 50% CO饱和水溶液可以阻断
柠檬酸铁胁迫9 h引起的离体水稻叶中APX和SOD
活性的增高趋势, 前者与我们最近的结果(Han等
2008)是一致的。其中, 柠檬酸铁胁迫叶片经 50%
CO饱和水溶液预处理(CO→Fe)后, APX活性接近
对照处理(Con→Con)的数值; SOD的活性则比柠檬
酸铁胁迫下(Con→Fe)叶片中的降低19.7%。不过,
50% CO饱和水溶液对CAT活性的影响则较小。值
得注意的是, CO的清除剂Hb预处理(Hb→ Fe)后,
APX和SOD的活性均显著超过柠檬酸铁单独处理
(Con→Fe)的数值(P<0.05), 这暗示柠檬酸铁还可能
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表 2 CO溶液(50%)预处理对柠檬酸铁胁迫 9 h后离体水稻叶片中APX、SOD和CAT活性的影响
Table 2 Effects of CO-saturated aqueous solution (50%) pretreatment on APX, SOD, and CAT
activities in 9-hour-Fe-citrate-stressed detached rice leaves
处理 APX/μmol·mg-1(蛋白)·min-1 SOD/U·mg-1(蛋白) CAT/μmol·mg-1(蛋白)·min-1
Con→ Con 0.45±0.013c 5.70±0.226d 0.27±0.002bc
Con→ Fe 0.57±0.009b 8.85±0.154b 0.30±0.009a
CO→ Con 0.43±0.009c 5.70±0.174d 0.25±0.006c
CO→ Fe 0.47±0.012c 7.11±0.098c 0.29±0.006ab
Hb→ Con 0.43±0.021c 6.20±0.126d 0.26±0.007c
Hb→ Fe 0.62±0.020a 9.69±0.131a 0.31±0.008a
　　同一列数字旁字母不同表示在 P<0 .0 5 水平差异显著。
导致HO基因表达的诱导以及内源 CO的释放。
综上所述, 我们认为, 外源 CO预处理能缓解
因柠檬酸铁胁迫所引起的TBARS含量的上升, 逆转
APX、SOD和 CAT活性的上升, 并可能通过调节
离体水稻叶中铁蛋白的基因表达来缓解过量柠檬酸
铁胁迫所导致的叶片氧化伤害。
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