全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 9期, 2010年 9月 871
收稿 2010-04-27 修定 　2010-07-26
资助 国家自然科学基金(30 6 60 0 9 4)、国家高技术研究发展
计划(“863”计划) (AA10A104)、广西科学基金(桂科自
0832088)和广西科技攻关项目(桂科攻 0815008-1-4)。
致谢 Collard BCY博士(Plant Breeding, Genetics and Biotech-
nology Division, International Rice Research Institute,
Metro Manila, Philippines)提供文献技术资料和有益探
讨。
* 共同通讯作者(E-mail: tronghua@163.com, zhuangwj@
pub2.fz.fj.cn; Tel: 0771-3276055)。
两种新型目标分子标记技术——CDDP与PAAP
熊发前 1, 蒋菁 1, 钟瑞春 1, 韩柱强 1, 贺梁琼 1, 李忠 1, 庄伟建 3,*, 唐荣华 1,2,*
1广西农业科学院经济作物研究所, 南宁 530007; 2广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室, 南宁 530007; 3福建农林大
学作物科学学院, 福州 350002
提要: 本文介绍了CDDP和PAAP这两种新型目标分子标记技术的产生原理、引物设计、PCR扩增、PCR产物检测手段、
分子标记特征及带型模式, 在此基础上对它们的技术特点和技术优势进行了概括, 最后, 对它们的应用前景进行了展望。
关键词: 来源保守DNA序列多态性; 启动子锚定扩增多态性; 目标分子标记; DNA保守序列; 启动子
Two Novel Targeted Molecular Marker Techniques—CDDP and PAAP
XIONG Fa-Qian1, JIANG Jing1, ZHONG Rui-Chun1, HAN Zhu-Qiang1, HE Liang-Qiong1, LI Zhong1, ZHUANG Wei-Jian3,*,
TANG Rong-Hua1,2,*
1Cash Crops Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China; 2Guangxi Crop Genetic
Improvement and Biotechnology Laboratory, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China; 3College of Crop
Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: This article describes principles, primer design, PCR amplification, detection methods of PCR products,
characteristics of molecular markers and band patterns of two types of targeted molecular marker techniques
(CDDP and PAAP). Then their technical features and technical advantages were summarized. Finally, their
applications in the future were discussed.
Key words: conserved DNA-derived polymorphism; promoter anchored amplified polymorphism; targeted
molecular marker; DNA conserved sequence; promoter
分子标记技术被广泛应用于遗传多样性分
析、种质资源鉴定、遗传连锁图谱构建、Q TL
定位、基因差异表达分析、基因克隆、比较基
因组学研究、转基因植物鉴定及分子标记辅助育
种等多个领域。其中RAPD、SSR、ISSR和AFLP
是应用最为广泛的 4种分子标记技术, 但是它们都
是传统意义上的随机DNA分子标记, 或是扩增非编
码区域, 或是随机在基因组中扩增, 得到的位点一
般与目标性状基因距离较远, 不能很好地与目标性
状连锁, 因而限制了它们的应用(Williams等 1990;
Zietkiewicz等 1994; Vos等 1995)。目标分子标记
技术是一类随着功能基因组学及大规模测序的深入
发展而产生的新型分子标记技术, 不需要目的基因
标记和功能型标记的基因及其等位基因序列信息,
偏向于基因编码功能区或调控区扩增, 偏向产生候
选功能标记, 所得标记可能是目的基因的一部分或
与目的基因紧密连锁, 并且该类技术在不同物种间
可以通用, 不需要或需要很少的基因组序列信息, 因
而越来越受到研究者的重视(Van Tienderen等2002;
Andersen和Lübberstedt 2003; Gupta和Rustgi 2004;
Pang等 2009; 赵雪等 2007; 陆才瑞等 2008; 郑靓等
2008; 杨景华等 2008; 宋伟等 2009; 熊发前等
2009)。
近几年, 目标分子标记技术被广泛开发应用, 它
们的建立或是利用保守功能基序(Hayes和 Saghai
Maroof 2000; Van der Linden等 2004; Soriano等
2005; Liu和Ekramoddoullah等2007; Zhang等2007),
或是利用真核生物基因序列的特点(Li和 Quiros
2001; Yang等 2007; Collard和Mackill 2009a; 陆才
瑞等 2008; 郑靓等 2008), 或是利用表达序列标签
(EST) (Hu和 Vick 2003; Wang等 2009)。
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最近, Collard和Mackill (2009b)以及 Pang等
(2009)分别开发出了基于DNA保守序列和启动子
保守核心序列的来源保守 D N A 序列多态性
(conserved DNA-derived polymorphism, CDDP)和启
动子锚定扩增多态性(promoter anchored amplified
polymorphism, PAAP)两种分子标记技术。下面分
别详细介绍这两种新型分子标记技术的原理、检
测技术等, 便于读者应用到相关研究中去。
1 原理与方法
1.1 原理 CDDP标记是一种基于DNA保守序列的
新型分子标记方法。在过去的 20年中, 植物基因
组学和功能基因组学得到迅速发展, 重要基因或基
因家族被大量克隆鉴定, 其功能得到验证, 这些基
因或基因家族中的保守氨基酸序列是典型的保守结
构功能域, 起着重要的作用。其对应的DNA保守
序列在不同物种间也是相当保守的。
PAAP标记技术则是一种专门将调控元件启动
子区域考虑在内开发出来的分子标记技术。迄今,
还没有其他专门来自调控序列的多态性标记技术,
Li和Quiros (2001)开发出的SRAP标记系统虽然能
覆盖调控序列, 但针对性不强。近年在 EST序列
基础上开发分子标记被广泛开展, ESTP、EST-
SSR、EST-AFLP、EST-SNP和 TRAP等标记都
是基于 EST基础上的分子标记方法。但是 EST序
列绝大部分不含启动子保守核心序列, 不能产生来
自启动子序列的多态性标记, 进而限制了对启动子
序列的深入利用。PAAP标记技术可以在全基因
组范围内产生来自启动子序列的分子标记, 鉴定和
定位启动子区域, 但并不需要特异启动子序列, 只
需要根据普遍存在的启动子保守核心序列来设计简
并引物, 与 RAPD标记的随机引物配对, 不同的引
物组合达到全基因组覆盖。PAAP标记技术用的
都是短的引物, 今后可以对PAAP-RAPD标记技术
加以改进, 可以在引物设计上对根据启动子保守核
心序列设计的简并引物加以延长, 并跟SRAP标记
技术或AFLP标记技术的引物组合使用。图 1为
CDDP和 PAAP标记技术的示意图。
1.2 引物设计 分子标记技术的引物设计都是核心,
直接反映其原理。CDDP分子标记技术是基于单
引物扩增反应的方法。设计要求有: (1)利用多重
比较软件(Clustal W、Genedoc和DNAman等)对
来自不同物种的功能蛋白质序列或功能基因序列进
图 1 CDDP及 PAAP标记技术示意图
Fig.1 The schematic representation of CDDP and PAAP marker technique
根据 Collard和Mackill (2009b)以及 Pang等(2009)文献中所陈述的原理画出。CGS: 保守基因序列; PPBS: 结合启动子位点引物;
PR: 随机结合在基因组内任意序列上的引物。
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行多重比较, 找出在不同物种同时存在的保守蛋白
质或DNA序列, 从而为引物的设计提供锚定位点;
(2)引物的长度范围为 15~19 bp。由于外显子通常
是GC含量丰富区, 引物GC含量范围为大于 60%,
有利于结合外显子基因区, 大于60%的GC含量的
引物重复性好; (3)一般选择与生物和非生物胁迫以
及植物发育有关的基因或基因家族的保守DNA序
列作为引物开发的锚定位点, 大多数这些基因是多
基因家族, 因此, 所设计的引物在基因组内有很多
结合位点, 从而使单引物进行 PCR扩增成为可能。
Collard和Mackill (2009b)将转录因子WRKY、
MYB、ERF、KNOX和开花控制MADS-BOX及
生长素结合蛋白ABP1作为引物的锚定序列。
PAAP分子标记技术使用双引物进行 PCR扩
增, 一条引物结合在已知启动子核心保守序列区, 另
一条随机结合在基因组任意位点。利用双引物来
达到两个目的: (1)覆盖基因组新的位点以产生新的
分子标记; (2)特异产生和调控区启动子有关的分子
标记, 从而弥补迄今都没有特异覆盖调控区的分子
标记的缺陷。虽然 SRAP标记技术能覆盖调控区,
但不是针对调控区开发的分子标记方法。文献报
道中的根据启动子核心保守序列设计的引物序列如
下: 根据G box设计的G-1为GCC-ACSTGTC; 根
据GC box设计的GC-1为NNNGGG- CGGN; 根据
CAAT box设计的CA-1为YRRCCA- ATWSR; 根据
TATAAT box设计的TA-1为CTATA- WAWASM。
1.3 PCR扩增 总体积为10 μL的CDDP-PCR反应
体系一般含有 1.5 mmol·L-1 MgCl2、0.8 μmol·L-1引
物、0.96 mmol·L-1 dNTPs、0.5 U Taq DNA聚合
酶和 25 ng基因组 DNA。反应条件是 94 ℃预变
性 3 min; 94 ℃变性 1 min, 50 ℃ (统一温度)退火 1
min, 72 ℃延伸 2 min, 共 35个循环; 72 ℃最后延伸
5 min。CDDP标记技术采用普通标准三步法PCR,
在统一温度 50 ℃下进行退火, 从而确保了反应稳
定性和重复性及产物的特异性。
总体积为20 μL的PAAP-PCR反应体系一般含
有 1.875 mmol·L-1 MgCl2、0.825 μmol·L-1引物、
0.25 mmol·L-1 dNTPs、2 U Taq DNA聚合酶和 10
ng基因组DNA。反应条件是 94 ℃预变性 2 min;
94 ℃变性15 s, 40 ℃ (统一温度)退火30 s, 72 ℃延
伸 1.5 min, 共 45个循环; 72 ℃最后延伸 5 min。
1.4 扩增产物检测 CDDP-PCR扩增产物在 1.2%
的琼脂糖凝胶上电泳分离, EB染色。PAAP-RAPD
扩增产物在 5%非变性聚丙烯酰胺胶上电泳分离,
硝酸银染色。可根据实验条件来选择最佳的操作
方式。
1.5 标记特征及带型模式 两种分子标记技术产生
的标记大部分是显性标记(引物结合位点的点突变),
也会产生少量由于插入-缺失突变引起的长度多态
性共显性标记, 但这要通过对所得到的多态性片段
进行进一步测序和遗传群体分析来确定。CDDP
标记技术所得带型模式和RAPD标记的差不多, 大
小在 200~1 500 bp之间, 3末端最后一个碱基的变
化都会得到不同的带型模式。PAAP标记技术在
一个反应当中, 根据引物的不同组合能产生6~17条
带(非变性聚丙烯酰胺胶检测), 大小在50~1 000 bp
之间, 最后所得条带是由三种类型组成, 一是根据
启动子设计的单引物扩增产生的条带, 二是RAPD
单引物扩增产生的条带, 三是两者结合产生的新条
带。在遗传多样性分析中, 无需对两条单引物进行
单独扩增, 可以对两条引物最终扩增产物进行统一
计带。若需要确定两条单引物结合是否有效扩增
出新条带, 可以在同一个PCR体系条件和程序下进
行扩增, 最终通过凝胶电泳观察是否有新带的产
生。
2 技术特点和优势
CDDP分子标记技术具有的特点和优势有: (1)
和 RAPD、ISSR等传统随机或匿名性分子标记技
术一样, CDDP也是一种基于单引物扩增反应的分
子标记方法, 扩增产物在琼脂糖胶上分离, 操作简
单, 但它是一种目标分子标记技术, 能有效产生和
目标性状连锁的功能性分子标记, 在遗传多样性分
析和分子标记辅助育种中有重要的应用价值。 (2)
引物长度为 15~19 bp, 长度较 RAPD更长, GC含
量更高, 稳定性和重复性更好。 (3)与AFLP标记技
术不同, 无需对DNA模板进行酶切、连接、预扩
增和选择性扩增, 直接对基因组DNA进行 PCR扩
增, 操作简单、可靠。 (4)与 SRAP和 TRAP标记
技术相比, 无需使用复性变温法进行 PCR, 常规标
准三步(变性、退火和延伸)法进行 PCR, 使用的退
火温度都是 50 ℃, 产物不需要用聚丙烯酰胺胶来
分离。 (5)引物设计相对简单, 标记开发费用少。 (6)
植物生理学通讯 第 46卷 第 9期, 2010年 9月874
为那些没有基因组全序列的植物提供了一种可供选
择的分子标记方法。
PAAP 分子标记技术的特点和优势: ( 1)和
RAPD、ISSR等传统随机或匿名性分子标记技术
相比, PAAP是一种目标分子标记技术, 两种类型引
物的结合可以产生由启动子附近序列变异引起的分
子标记, 所得分子标记主要来自启动子序列变异, 可
能与目标性状连锁。因为这些变异会导致转录因
子等反式作用因子的结合亲和力和结合效率的降
低, 从而影响基因的表达水平, 进而影响植物的生
长和发育, 因此, PAAP标记技术把DNA序列突变
和QTLs间联系起来。 (2)同RAPD一样, 使用了短
的引物长度, 重复性较差, 但通过聚丙烯酰胺胶来
分离扩增产物, 重复性和条带统计准确性得以提
高。 (3) PAAP标记技术较之传统AFLP标记技术,
步骤少, 易于掌握。 (4) PAAP标记技术较之 SRAP
和TRAP标记技术, PCR只需要变性, 退火, 延伸常
规标准过程, 退火温度统一为 40 ℃。 (5)引物设计
相对简单, 标记开发费用少。启动子序列研究的较
多, 启动子中的保守序列也研究的较清楚, 只要将
根据启动子核心保守序列设计的引物和RAPD引物
结合起来就可以使用了, 且可以在不同植物间通
用。
3 基于CDDP分子标记技术的启示
已克隆的大部分抗病基因存在着保守结构域
(如 P-LOOP、NBS、GLPL和 LRR), 这为未知物
种抗病基因序列的克隆提供了一种思路。1996年
Kanazin等和Yu等几乎同时报道, 根据已克隆抗病
基因中存在的保守序列设计引物来扩增所研究物种
基因组, 扩增产物经琼脂糖胶分离并回收测序, 测
序结果发现在琼脂糖上呈现的单一条带, 实际上是
杂合带, 是很多序列的混合体, 且所得序列含有上
述保守序列, 和已知的抗病基因同源性很高, 并将
这些片段序列称之为抗病基因类似物。Chen等在
1998年提出抗病基因类似物多态性(resistance gene
analogues polymorphism, RGAP)标记技术, 该技术
在当时主要的改进之处在于将根据保守序列设计的
上下游引物扩增产物在高分辨率的聚丙烯酰胺胶上
进行分离, 可以同时克隆和定位这些RGAs。 RGAP
技术是用一对引物扩增, 而本文介绍的CDDP分子
标记技术是单引物扩增, 引物是根据基因家族(多为
转录因子家族)的保守序列设计。既然 RGA序列
也是基因家族序列, 且在植物中广泛存在, 这启示
我们除了根据R基因和RGA设计双引物对基因组
进行扩增外, 也可以根据R基因和RGA中的保守序
列设计单引物, 对基因组进行扩增而产生像CDDP
分子标记技术的带型模式, 但这需要实验的进一步
验证。
4 应用前景展望
由于CDDP标记的引物是根据不同物种的保
守序列设计的, 因此具有引物通用性, 当然也可以
根据所研究物种设计物种特异引物。PAAP标记
技术是一种专门针对调控序列启动子核心保守序
列开发的分子标记技术, 可以研究启动子侧翼序列
的序列变异, 更为启动子序列的克隆提供了一条途
径。
总之, 作为目标分子标记技术的CDDP和PAAP
为人们提供了两种能跟踪性状的新型分子标记技
术, 可作为其他目标分子标记技术的有效补充。相
信这两种分子标记技术可以被广泛应用于物种遗传
多样性分析、指纹图谱建立、启动子研究、遗
传连锁图谱构建、QTL定位及分子标记辅助育种
等研究中。
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