全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (4): 337~342 337
收稿 2012-11-09　　修定 2013-03-20
资助 安徽省级自然科学研究重大项目(KJ2011ZD08)和安徽省
自然科学基金项目(1208085MC47)。
* 通讯作者(E-mail: jiangli@ustc.edu.cn; Tel: 0551-62919366)。
拟南芥抗旱突变体vem1对NaCl和ABA胁迫的响应
杨杰2, 江力1,*, 张娇娇1, 陈子平1
1合肥工业大学生物与食品工程学院, 合肥230009; 2合肥师范学院生命科学系, 合肥230601
摘要: 我们从拟南芥突变体库中筛选获得一抗旱突变体vem1。本文通过观察突变体表型, 测定其脯氨酸、可溶糖、叶绿素
含量和相对电导率等抗逆相关的生理指标, 研究突变体vem1对NaCl和ABA胁迫的响应。NaCl胁迫下, 突变体vem1比野生
型(WT)积累更多的脯氨酸和可溶性糖, 而相对电导率、叶绿素含量均比WT低。ABA胁迫下, vem1积累的脯氨酸、可
溶糖和叶绿素含量均低于WT, 而相对电导率和胁迫相关基因RD29A表达量高于WT。结果表明, vem1对NaCl胁迫具有一定
的抗性, 对ABA胁迫表现敏感。研究为抗旱基因VEM1克隆及功能分析奠定基础。
关键词: 拟南芥; 抗旱突变体vem1; 甘露醇; NaCl胁迫; ABA胁迫
Responses of the Drought-Resistent vem1 Mutant to NaCl and ABA Stress in
Arabidopsis
YANG Jie2, JIANG Li1,*, ZHANG Jiao-Jiao1, CHEN Zi-Ping1
1School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2Department of Life Sci-
ence, Hefei Normal University, Hefei 230601, China
Abstract: We have isolated a drought-resistent mutant vem1 from the Arabidopsis mutant pool. In this work,
wild-type (WT) and vem1 phenotypes were observed, and resistance-related physiological indexes, including
proline content, soluble carbohydrate, chlorophyll content, and relative conductivity were measured to study re-
sponse of mutant vem1 to NaCl and ABA stress. Under NaCl stress, vem1 mutant plants showed higher proline
and soluble sugar levels but lower relative conductivity and chlorophyll content compared with WT plants . Un-
der ABA stress, contents of proline and soluble sugar as well as chlorophyll in vem1 mutant plants were lower
than those of WT plants; however, relative conductivity and the expression level of related stress-responsive
gene RD29A in the vem1 mutant were higher than those in WT. These results suggest that the vem1 mutant was
more resistant to NaCl stress but sensitive to ABA stress. This study provides a basis for cloning and functional
analysis of the drought-resistant gene VEM1.
Key words: Arabidopsis thaliana; drought-resistent mutant vem1; mannitol; NaCl; ABA
干旱是影响植物生长和发育的主要环境因子
之一, 全球干旱、半干旱地区约占耕地面积的一
半, 全世界由于干旱导致减产超过其他因素造成
的减产的总和(Neumann 2008)。植物在长期的逆
境条件下形成一系列生理或发育的机制来响应环
境中的这种胁迫。植物抗旱机制存在多种调控途
径并可能发生交叉(Zhu 2002; Qin等2008; Pose等
2009; Alexandersson等2010; Yoshida等2010; 胡守
景等2008): 如依赖于脱落酸(ABA)的途径; 被
DREB2A转录因子调控的途径; 通过ERD1基因调
控的途径; 通过SIZ1介导的途径等。渗透调节和
ABA调节, 能够使植物抵御干旱胁迫所造成的伤
害(刘琳等2009)。
在前期工作中, 我们利用正向遗传学途径, 采
用不同浓度的甘露醇模拟干旱胁迫, 以发芽率为
筛选指标, 从购自美国拟南芥种质资源中心(The
Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)的
拟南芥突变体库中筛选抗旱突变体, 得到一个功
能获得性抗旱突变体vem1 (张娇娇等2012)。该
研究报告 Original Papers
植物生理学报338
突变体为本实验室首次获得, 基因未知。在此基
础上, 本文进一步对突变体vem1表型进行鉴定, 分
析突变体特征; 通过观察突变体表型, 测定其脯氨
酸、可溶糖、叶绿素含量和相对电导率等抗逆相
关的生理指标以及胁迫相关基因表达, 研究突变
体对NaCl和ABA胁迫的响应 , 为该抗旱基因克
隆及功能分析奠定基础。
材料与方法
1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型(WT)种子
(Columbia生态型), 购自美国拟南芥种质资源中心
(The Arabidopsis Biological Resource Center,
ABRC; Ohio State University, Columbus, OH)。抗
旱突变体(vem1)为本实验室从拟南芥突变体库
(ABRC)中筛选得到。
2 材料培养
2.1 培养基培养
种子经0.1%HgCl2消毒3~5 min后, 用无菌水
冲洗3~5次, 然后将种子点种在加入1.5%蔗糖、
0.8%琼脂和一定含量NaCl或ABA的MS培养基中;
并用封口膜封装, 于4 ℃条件下处理3 d后转至光
周期16 h光/8 h暗、光照强度为100 μmol·m -2·s -1
的培养室内培养。
2.2 土壤培养
种子播种于装有灭菌营养土(蛭石:黑土:珍珠
岩=9:3:0.5)的盆钵中, 置于光周期16 h光/8 h暗、
光照l00 μmol·m-2·s-1、温度22~23 ℃的培养室内培
养, 播种和开花时各浇一次土培营养液, 并根据植
株生长需要浇以适量水。
3 实验处理
3.1 干旱处理
将WT和vem1播种于不同盆钵中, 取4周大的
WT和vem1植株进行干旱处理。处理前吸水充足, 干
旱处理7 d、14 d, 再复水处理7 d, 观察表型并拍照。
3.2 vem1 对NaCl胁迫响应
分别将WT和vem1种子点种在含有0、50和
100 mmol·L-1 NaCl的MS培养基中, 竖直培养3周,
观察表型并拍照。取幼苗(分别用0、100 mmol·L-1
NaCl处理)用于测定脯氨酸含量、叶绿素含量、可
溶性糖含量和相对电导率, 各项测定重复3次。
3.3 vem1 对ABA胁迫响应
分别将WT和vem1种子点种在含有0、0.5、1
和2 μmol·L-1 ABA的MS培养基中, 竖直培养3周, 观
察表型并拍照。取幼苗(分别用0、2 μmol·L-1 ABA
处理)用于测定脯氨酸含量、叶绿素含量、可溶性
糖含量和相对电导率。取MS培养基中3周大WT
和vem1幼苗, 分别置于0、2 μmol·L-1 ABA溶液中
处理12 h, 进行干旱相关基因RD22和RD29A表达
量的检测。各项测定重复3次。
4 测定方法
脯氨酸含量采用酸性茚三酮显色法(职明星
和李秀菊2005)测定, 可溶糖含量采用蒽酮比色法
(林炎坤1989) 测定, 叶绿素含量采用常温浸提比色
法测定, 相对电导率采用浸泡法(陈爱葵等2010)测
定。相关基因表达采用qRT-PCR方法进行检测
(Wang等2011)。Trizol法提取总RNA, 利用Re-
verseAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit进
行反转录, 利用Oligo (dT)引物合成cDNA第一
链。设计引物三步法PCR扩增进行了荧光定量
PCR检测。引物序列见表1。
表1 qRT-PCR检测引物序列
Table 1 Sequences of primer pairs used for
qRT-PCR detection
基因 引物序列(5′→3′)
RD22 fw: TAGGAGTCGGTAAAGGCGGT
rv: CATCGGTGCGTTCTTCTTAGC
RD29A fw: GAGGAACCACCACTCAACAC
rv: TCCAGAAAGCAGAGAGACCG
ACTIN fw: GATTTGGCATCACACTTTCTACAATG
rv: GTTCCACCACTGAGCACAATG
实验结果
1 干旱处理下WT和vem1的生长
干旱处理7 d, WT和vem1生长尚可; 干旱处理
14 d, WT和vem1都呈萎蔫状, 但WT萎蔫更严重; 复
水7 d后, vem1恢复活力, 而野生型仍然萎蔫, 不能存
活(图1)。表明突变体vem1相对WT具有抗旱性。
2 拟南芥抗旱突变体vem1对NaCl胁迫的响应
2.1 NaCl胁迫下WT和突变体vem1生长
图2所示, 在MS培养中WT和vem1生长状况无明
显差异, 50、100 mmol·L-1 NaCl胁迫下, vem1和WT
杨杰等: 拟南芥抗旱突变体vem1对NaCl和ABA胁迫的响应 339
生长均受到的抑制, 根长变短叶片发黄。但vem1比
WT长势稍好, 尤其是100 mmol·L-1 NaCl胁迫下。
2.2 NaCl胁迫下WT和突变体vem1生理指标
分析NaCl胁迫下几个抗逆相关的生理指标
(图3)。在无NaCl胁迫(MS)下WT和vem1积累的脯
氨酸含量、可溶糖含量、叶绿素含量以及电导率
基本相同; 而100 mmol·L-1NaCl胁迫下, vem1脯氨
酸含量、可溶糖含量分别比WT增加了73.0% (图
3-A)、22.4% (图3-B), 叶绿素含量、相对电导率分
别比WT降低了7.52% (图3-C)、16.2% (图3-D)。
NaCl胁迫下, vem1增加了较多的脯氨酸含量和可
溶性糖含量, 且相对电导率较低, 说明突变体vem1
具有一定的耐盐性, 叶绿素含量下降与NaCl胁迫
下WT和vem1的表型相一致。
3 拟南芥抗旱突变体vem1 对ABA胁迫的响应
3.1 ABA胁迫下WT和vem1生长
图4可见, 在MS培养基中WT和vem1生长状况
无明显差异。随着ABA浓度的增加, 至2 μmol·L-1
时, vem1根长明显减小, 说明突变体vem1对ABA胁
迫敏感。
3.2 ABA胁迫下WT和vem1生理指标
在无ABA胁迫(MS)下WT和vem1积累的脯氨
酸含量、可溶糖含量、叶绿素含量以及电导率基
本相同(图5); 而2 μmol·L-1 ABA胁迫下, vem1脯氨
酸含量、可溶糖含量、叶绿素含量分别比WT降
低了35.8% (图5-A)、18.0% (图5-B)、46.8% (图
5-C), 相对电导率增加了1.3% (图5-D)。数据进一
步说明了vem1对ABA胁迫敏感。
3.3 ABA胁迫下WT和vem1相关基因的qRT-PCR
分析
qRT-PCR分析了ABA胁迫下RD22和RD29A表
达量(图6)。RD22和RD29A为胁迫应答基因, 分别
图1 干旱胁迫下WT和突变体vem1表型
Fig.1 Phenotype of WT and mutant vem1 under drought stress
图2 NaCl胁迫下WT和突变体vem1表型
Fig.2 Phenotype of WT and mutant vem1 under NaCl stress
植物生理学报340
编码胁迫响应蛋白RD22和RD29A, 响应ABA、干
旱、低温等胁迫。无ABA胁迫(MS)下2种基因在
WT和vem1中的表达量一致; 2 μmol·L-1ABA胁迫
下RD22在WT和vem1中表达相差无几(图6-A), 而
vem1中RD29A的表达量显著高于WT (图6-B), 显
示突变体vem1的抗旱性一定程度上与RD29A基因
激活有关。
讨　　论
我们利用正向遗传学途径, 筛选获得抗旱突
变体vem1。进一步研究耐盐(NaCl)胁迫, 发现突
变体vem1对NaCl的耐受性比野生型强。ABA胁
迫下, 表型分析和生理指标结果都表明, 突变体
vem1对ABA胁迫敏感, 相关基因表达分析推测突
图3 NaCl胁迫下WT和突变体vem1的生理指标
Fig.3 Physiological indexes of WT and mutant vem1 under NaCl stress
图4 ABA 胁迫下WT和突变体vem1 表型
Fig.4 Phenotype of WT and mutant vem1 under ABA stress
杨杰等: 拟南芥抗旱突变体vem1对NaCl和ABA胁迫的响应 341
变体vem1的抗旱性与RD29A的表达量显著增加有
关, 说明突变体vem1的抗旱调控途径可能是ABA
依赖型。干旱信号转导过程中胁迫相关基因的
表达存在ABA依赖和ABA非依赖型两种调控途
径。ABRE和DRE/CRT分别是ABA依赖和ABA不
依赖途径中基因表达对干旱胁迫做出反应的顺式
作用元件(Xiong等2002; Shinozaki等2003)。依赖
ABA的基因表达有两种途径: 一条途径是ABA通
过一种具有亮氨酸拉链结构域的调节蛋白AREB、
ABA结合因子ABF与具有ACGT或G盒的ABA保
守顺式作用元件ABRE特异结合, 引起抗旱功能基
因的表达(Uno等2000; Shinozaki等2003; Yoshida等
2010)。另一途径是ABA通过逆境诱导合成的蛋白
转录因子和顺式作用元件特异结合, 从而引起相
应的抗旱功能基因的表达(Shinozaki等2000; Lee等
2012)。
图5 ABA胁迫下WT和突变体vem1的生理指标
Fig.5 Physiological indexes of WT and mutant vem1 under ABA stress
图 6 ABA胁迫下WT和突变体vem1中相关基因的qRT-PCR分析
Fig.6 qRT-PCR analysis of stress-responsive genes in WT and mutant vem1plants under ABA stress
植物生理学报342
逆境条件下, 植物体内脯氨酸和可溶糖含量
在一定程度上反映了植物的抗逆性。研究表明,
植物脯氨酸和可溶糖含量的升高有利于细胞水势
的降低, 提高保水能力, 对盐胁迫下的拟南芥幼苗
有显著渗透调节作用(陈吉宝等2010; Ashraf和
Foolad 2007); 植物受到离子毒害, 过量的Cl-离子
渗入细胞后, 使原生质凝聚, 叶绿素破坏, 叶绿素
含量显著降低(许兴等2002)。此外, 逆境下植物细
胞膜容易破裂, 膜蛋白受伤害因而使胞质液外渗
而相对电导率增大。因此相对电导率被用来作
为逆境对植物的伤害程度的一个重要指标, 也是
鉴定植物抗逆性的一个指标。在NaCl胁迫下 ,
突变体vem1中脯氨酸、可溶性糖含量均比WT
高, 而相对电导率、叶绿素含量均比WT低。说
明突变体vem1对于NaCl胁迫具有一定的耐受
性 , 且这种耐盐抗旱性很可能是与渗透胁迫以
及离子平衡都有关。而在ABA胁迫条件下 , 突
变体vem1中脯氨酸、可溶性糖、叶绿素含量均
低于WT, 而相对电导率明显高于WT。一定浓
度的外源ABA能够调节植物气孔关闭 , 影响气
体交换, 并降低了植物的脱水能力, 此外, 影响
叶绿体的超微结构, 使叶绿体的外膜破裂, 影响
植物的光合作用 , 从而使得植物的生长受到抑
制(谭云等2001)。
拟南芥抗旱突变体vem1对NaCl胁迫耐受 ,
对ABA胁迫敏感, 进一步克隆VEM1基因, 转基因
互补验证, 研究VEM1基因调控抗旱的信号途径及
分子机理。
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