全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (8): 1255~1258　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0243 1255
收稿 2014-05-22　　修定 2014-07-07
资助 国家自然科学基金(81373963和30925004)。
* 通讯作者(E-mail: nanpeng@fudan.edu.cn; Tel: 021-
65642957)。
两种提取蒙古黄芪miRNA方法的比较
吕帝瑾, 陈婧, 钟扬, 南蓬*
复旦大学生命科学学院, 生物多样性与生态工程教育部重点实验室, 上海200433
摘要: 通过对两种miRNA提取方法——一步法和多步法进行比较研究, 以期获得较高质量的蒙古黄芪不同器官的miR-
NA。实验结果表明, 两种方法均可用于蒙古黄芪miRNA提取, 二者存在着不同的优缺点, 多步法提取成功率较高但步骤繁
琐, 相比之下一步法实验条件要求严苛但步骤简单、快捷省时, 提取的蒙古黄芪miRNA完整性好, 可以满足荧光定量PCR
等进一步实验需要。
关键词: miRNA提取; 蒙古黄芪; 一步法; 多步法
Compare with Two Protocols for microRNA Extraction from Astragalus mem-
branaceus var. mongholicus
LÜ Di-Jin, CHEN Jing, ZHONG Yang, NAN Peng*
Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering, Ministry of Education, School of Life Sciences, Fudan Uni-
versity, Shanghai 200433, China
Abstract: In order to obtain better quality miRNA in different parts of Astragalus membranaceus var. mong-
holicus, two miRNA extraction methods (one-step method and multi-step method) were compared. The results
showed that these two methods had different advantages and disadvantages, but both of them could be used for
miRNA extraction. Multi-step method had higher success rate with cumbersome steps, one-step method needed
strict experimental conditions but fast and time-saving, the miRNA isolated with one-step method had high in-
tegrity which could be used for quantitative RT-PCR and so on.
Key words: miRNA extraction; Astragalus membranaceus var. mongholicus; one-step method; multi-step
method
黄芪是植物黄芪和中药黄芪的统称, 中药黄
芪为豆科植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceus
var. mongholicus)或膜荚黄芪(A. membranaceus)的
干燥根, 具有补气固表、利尿脱毒、敛疮生肌的
功效, 黄芪的有效药用成分包括毛蕊异黄酮、黄
芪皂甙、黄芪多糖等多种代谢产物以及锌、钼、
硅等多种微量元素, 在医学上常用于预防治疗人
类的乳腺癌、骨质疏松症、心血管及肝肾系统相
关疾病(刘星堦和喻正坤1995)。
miRNA是一种长度为21~26个核苷酸(nt)的非
编码内源性小分子RNA, 近年来受到科学家们广
泛的关注。提取miRNA作为实验研究的基础步骤,
其提取质量的优劣与整体实验的成功与否息息相
关。目前研究领域针对不同的实验样本和实验目
的已经开发出相应的不同试剂盒产品。
对于普通细胞及组织miRNA的提取主要采用
两种方法: 一种是根据不同类别的RNA在不同浓
度乙醇中溶解度的差异进行沉淀分离, 随后利用
特殊硅基质吸附材料特异性吸附小片段R N A
(<200 nt); 另一种是先提取样品中的总RNA, 通过
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将总RNA中的小片段
RNA割胶分离, 再对其进行沉淀回收。对于从甲
醛固定石蜡包埋(FFPE)样品中提取miRNA, 则通
常先采用二甲苯脱蜡、乙醇洗涤之后再用裂解液
和蛋白酶处理, 后期处理与普通组织相同。对于
血液中miRNA的提取则需使用专用的过滤柱来分
离白细胞, 期间需加入RNAlater稳定剂确保分离的
白细胞RNA不被降解掉。
目前随着分子生物学技术在药用植物领域应
用研究的日益深入, 获取高质量的miRNA样本逐
渐成为进行分子生物学研究的重要前提, 黄芪中
多糖成分及次生代谢产物含量较高, 给miRNA的
植物生理学报1256
提取带来了一定难度。本研究比较分析了应用于
普通组织miRNA提取的两种提取试剂法(盒), 以期
获得一种较为理想的提取方法, 为黄芪的分子生
物学研究打好基础。
材料与方法
本实验采用经过16 ℃恒温, 每日14 h光照和
10 h黑暗条件处理条件下, 盆栽培养100 d以上的蒙
古黄芪[Astragalus membranaceus var. mongholicus
(Bunge) P. K. Hsiao], 分别采用每棵植株的根、
茎、叶3个部分作为研究材料。
1 一步法
采用天根公司的miRcute miRNA提取分离试
剂盒(DP501), 分别取0.1 g蒙古黄芪根、茎、叶组
织在研钵中用液氮迅速研磨成粉末, 每0.1 g植物组
织加1 mL裂解液, 用匀浆仪进行匀浆处理, 将匀浆
样品在室温放置5 min, 使得核酸蛋白复合物完全
分离。加入200 μL氯仿, 盖好管盖, 剧烈振荡15 s,
室温放置5 min。4 ℃13 400×g离心15 min, 样品分
为3层: 下层为黄色有机相, 中间层和上层为无色
水相, RNA主要存在于水相中。将水相转移到新
管中, 准确量取转移液的体积, 缓慢加入转移液体
积0.43倍的无水乙醇, 混匀, 将得到的溶液和沉淀
一起转入过滤柱中, 室温13 400×g离心30 s, 离心后
保留流出液。量取流出液的体积, 缓慢加入流出
液体积0.75倍的无水乙醇, 混匀, 将得到的溶液和
沉淀再次转入吸附柱中, 室温13 400×g离心30 s, 弃
流出液, 保留吸附柱。向吸附柱中加入500 μL去蛋
白液, 室温静置2 min, 室温13 400×g离心30 s, 弃废
液。向吸附柱中加入700 μL漂洗液室温静置2 min,
室温13 400×g离心30 s, 弃废液。向吸附柱中加入
500 μL漂洗液, 室温静置2 min, 室温13 400×g离心
30 s, 弃废液。将吸附柱放入2 mL收集管中, 室温
13 400×g离心1 min, 去除残余液体。将吸附柱转
入一个新的1.5 mL离心管中, 加15~30 μL RNase-
free ddH2O, 室温放置2 min, 室温13 400×g离心2
min, 即可获得miRNA。将所得miRNA溶液置
于–70 ℃冰箱保存备用。
2 多步法
2.1 蒙古黄芪总RNA提取
采用普通植物组织总RNA提取方法, 本实验
中使用的是天根植物总RNA提取试剂盒(DP432)。
2.2 小RNA分离
本实验试剂盒采用Balancer NGS Library
Preparation Kit for small microRNA (K02420), 取第
一步提取的总RNA 1 μg, 加入3′Adaptor和RNase
free H2O配成5 μL RNA混合体系, 70 ℃下加热2
min立即放在冰上冷却。依次加入Ligation Buf-
fer、100 mmol·L-1 MgCl2、Ligation Enhancer
Mix、RNase Inhibitor Cocktail、3′Adapter Ligation
Enzyme Mix配成总体积10.5 μL的3′接头混合体系,
22 ℃预热1 h。向上述体系中加入1 μL RT Primer,
混匀后依次置于75 ℃ 5 min, 37 ℃ 30 min, 25 ℃
15 min。期间将20×5′Adapter置于70 ℃下2 min, 然
后立即置于冰上配制成5’接头连接体系。依次加
入3 ′Adapter Ligation Mix, 10 mmol·L-1 ATP,
5′Adaptor, 5′Adapter Ligation Enzyme Mix, 配成
14.5 μL的混合体系后, 置于20 ℃下1 h, 放入4 ℃下
冷藏。
取14 μL接头混合体系依次加入5×First Strand
Buffer, 10 mmol·L-1 dNTP, 100 mmol·L-1 DTT,
RNase Inhibitor Cocktail, Reverse Transcriptase, 配
成24 μL的体系后置于42 ℃ 1 h。
依次加入10 μL上述反应的cDNA混合液 ,
2×High Fideli ty PCR Mix, 50×Primer G×1,
50×Primer G×2, RNase free H2O配成50 μL的PCR
反应体系, 按照98 ℃ 30 s; 94 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 72
℃ 15 s, 12个循环; 72 ℃ 10 min的反应步骤扩增, 4
℃保存。
用6%琼脂凝胶电泳PCR产物, 将110~125 bp
的条带部分割下纯化。将0.5 mL的离心管底部用
针穿4~5个圆孔, 把割下待回收的胶放入其中, 将
0.5 mL离心管放入2 mL离心管中13 400×g离心2
min, 加入100 μL稀释后的洗脱液, 轻柔翻转2 h洗
脱。将洗脱液和胶碎块混合物转移到过滤柱上,
室温下13 400×g离心过滤柱2 min, 将所得miRNA
溶液置于–70 ℃冰箱保存备用。
实验结果
1 高通量测序结果分析
对两种方法提取的小RNA分别进行文库构建
及高通量测序, 将获得的数据通过Blast与miRBase
20.0 (http://www.mirbase.org/)中的已知miRNA序
列(193个物种, 25 141条成熟miRNA)进行比对, 匹
吕帝瑾等: 两种提取蒙古黄芪miRNA方法的比较 1257
表2 一步法与多步法综合比较
Table 2 Comprehensive comparison between one-step and multi-step
类别 一步法 多步法
提取价格/元·样品-1 约50 约50
提取时间/h 2 8~9
提取miRNA含量检测/ng·μL-1 360 240
OD260/OD280比值 1.92 1.89
提取成功率/% 30 80
实验条件要求 极为严格 严格
优点 步骤简单、省时快捷, 提取结果完整性高 成功率高、第一步提取产物可应用于多类实验
缺点 实验条件严格导致成功率低 步骤繁琐、耗时
配度达到90%的序列作为已知miRNA (表1)。数据
结果显示多步法提取的miRNA含量少 , 效率较
低。根、茎、叶中可比对出的已知miRNA序列分
别只有39、25和17条。而利用一步法提取的
miRNA效果良好, 根、茎、叶中可比对出的已知
miRNA序列分别达到172、93和354条(表1)。将一
步法提取的经高通量测序所得的蒙古黄芪miRNA
数据分别与大豆和苜蓿miRNA数据库进行比对,
获得相匹配的miRNA条数为大豆中164、78、164
条, 苜蓿中150、64、110条。将两种方法的结果进
行比较, 一步法所测得的数据是多步法的近4倍,
并且包含了多步法测得的全部数据。
2 两种提取方法的综合比较
通过对两种方法的综合比较(表2), 我们可以
发现一步法与多步法分别存在各自的优缺点: 一
步法提取的miRNA单位含量约为多步法的1.5倍;
在操作时间上一步法的用时仅为多步法的1/4, 操
作步骤及所需器材均大幅度简略; 在提取质量方
面, 一步法的OD260/OD280比值略高于多步法, 表明
表1 高通量测序数据与miRBase中已知miRNA比对所得两
种方法中已知miRNA条数
Table 1 The deep sequencing result of two methods which
were aligned with the mature sequences of all Viridiplantae
miRNAs in miRBase
组织
已知miRNA条数
一步法 多步法
根 172 39
茎 93 25
叶 354 17
提取的RNA纯度更高; 二者在价格方面相差不多,
提取单个样品的miRNA价格均在50元左右。在实
验过程中, 一步法操作所需的实验条件极为严苛,
在实验过程中必须严格控制实验用品与外界的接
触, 需勤换实验手套确保无RNA酶干扰实验结果;
同时在2次加入无水乙醇的步骤中, 需要准确量取
转移液的体积, 计算无水乙醇的加入量, 如误差较
大则会严重影响miRNA的提取数量和质量; 多步
法虽步骤繁琐但所需条件并不严苛, 与一步法相
比实验成功率更高。以10次实验的数据结果来看,
一步法成功率仅为30%, 多步法则为80%; 一步法
获得的结果仅为片段在200 nt以下的小RNA, 而多
步法的第一步为提取实验材料的总RNA, 亦可应
用于多类其他实验, 例如mRNA的克隆等。总结而
言, 一步法与多步法均存在不同优缺点, 一步法优
点在于步骤简单、节省时间和实验资源, 小RNA
提取数量多、完整性好, 实验结果可信度高; 缺点
在于实验过程对操作条件要求十分严格, 从而导
致实验的成功率不高; 多步法的优点在于对整个
实验过程的操作条件要求较为宽松, 从而使得提
取成功率更高, 第一步总RNA的提取产物亦可应
用于其他实验, 拓展性强; 缺点在于实验步骤繁琐,
所需实验仪器及实验耗材较多, 耗费时间, 且最后
收集产物中miRNA种类数量较少, 可参考数据量
有限。
讨　　论
蒙古黄芪为中医药中常用的名贵药材,含多种
黄酮类及多糖类化合物、氨基酸和微量元素。在
提取miRNA的过程中, 微量的内源或外源RNA酶
就会使miRNA降解, 而且细胞水溶性次生代谢物
植物生理学报1258
如多糖、多酚等在提取过程中易与RNA结合形成
粘稠难溶的胶状物而导致miRNA的大量损失, 或与
RNA形成褐色复合物导致RNA完全丧失生物活性
(赵成萍等2012)。随着近年来对miRNA研究的逐
渐深入, miRNA实验相关的技术和工具也越来越
多。本文中提到的两种方法相比而言, 多步法属于
miRNA研究中早期广泛应用的一种方法, 采用快速
回收细胞或者组织样本中的总RNA, 包括miRNA,
再对小RNA进行富集和纯化; 一步法则是技术不断
改进的产物, 首先用变性裂解液裂解样品, 稳定
RNA, 随后用氯仿来萃取, 再通过改良的玻璃纤维
滤膜来进行纯化, 由于一步法快捷省时, 省去了繁
琐耗时的步骤, 提取效率更高, 应用也愈加广泛。
在本实验中我们采用了多种方法来检验提取
效果, 对于miRNA结果检测来说, 测OD260/OD280值
是最常用的方法, 但该方法准确性不足, 可靠性不
够。Agilent 2100 Bioanalyzer也是一类常用的工具
(Weber等2010; Taylor和Gercel-Taylor 2008; Tissot
2008), 该生物分析仪具备了微量、快速、自动化
的特点, 只需1 μL的样品量和手工上样, 无需更多
操作。近来最引人注目的检测方案是RNA Integri-
ty number (RIN) (Mueller等2004), 作为安捷伦特有
的专利, 用来检测RNA完整性指数, 它能够全面考
虑各项影响RNA质量的因素, 最后经专利函数计
算得出。目前已有80%以上的用户将其视为RNA
质控标准, 它正逐步扩展成为全球公认的RNA质
控金标准, 相信未来会得到更多人的青睐。
参考文献
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