全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (4): 351~356 351
收稿 2013-01-05　　修定 2013-02-27
资助 转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08009-121B)。
* 通讯作者(E-mail: yhmbjbj@ibcas.ac.cn, fhuang@ibcas.
ac.cn; Tel: 010-62836546)。
集胞藻sbtA基因具有提高水稻旗叶叶绿素含量及株高的功能
杨浩萌*, 薛哲勇, 赵乐, 漆小泉, 黄芳*
中国科学院植物研究所, 北京100093
摘要: SbtA是蓝藻特有的碳酸氢盐转运蛋白, 在蓝藻二氧化碳浓缩机制中起重要作用。本研究以水稻‘中花11’为材料, 采用
农杆菌介导的转化方法将集胞藻的sbtA基因导入水稻胚性愈伤组织中, 再经诱导分化获得转基因幼苗。通过PCR、GFP荧
光检测及Western blot检测筛选单拷贝插入的转基因阳性株系, 并对其表型进行比较分析。结果表明, 转基因水稻株高和旗
叶的叶绿素含量显著提高, 与野生型相比分别增加了11.9%和27%。后一表型暗示sbtA基因可能在延缓灌浆期水稻旗叶衰
老及改善水稻农艺性状方面具有潜在的应用价值。
关键词: 集胞藻; sbtA; 水稻; 叶绿素含量; 株高
Increased Chlorophyll Content and Plant Height of Transgenic Rice Express-
ing sbtA of Synechocystis sp. PCC 6803
YANG Hao-Meng*, XUE Zhe-Yong, ZHAO Le, QI Xiao-Quan, HUANG Fang*
Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
Abstract: SbtA is a cyanobacterial protein involved in CO2 concentrating mechanism (CCM). In this work,
sbtA gene was cloned from Synechocystis sp. PCC6803 and introduced into rice (Oryza sativa subsp. japonica
cv. ‘Zhonghua 11’) using Agrobacterium-mediated transformation. The transformants were verified by PCR and
Western blot analysis. Transgenic seeds of rice were selected based on GFP reporter signal followed by pheno-
typic analysis of the progeny. Our results showed that the transgenic plants were 11.9% taller than wild type.
The data also showed that chlorophyll (a+b) content in the flag leaf of transgenic plants was 27% higher than
that of wild-type plants. The latter phenotype observed provides a new perspective of sbtA gene towards rice
improvements.
Key words: Synechocystis; sbtA; Oryza sativa; chlorophyll content; plant height
水稻是最重要的粮食作物之一, 其生产状况
与国计民生和社会稳定密切相关。在我国农业资
源人均占有量较低、可耕地面积日益减少的情况
下, 如何有效地提高单产水平是水稻育种与生产
追求的主要目标(国家粮食安全中长期规划纲要
(2008~2020年) (http://www.gov.cn/jrzg/2008-11/13/
content_1148414.htm)。发掘新的重要基因资源及
有利用价值的基因新功能, 对实现该目标具有重
要意义(吴键等2011)。蓝藻是地球上唯一能够进
行类似于植物光合作用的原核生物类群, 与叶绿
体在进化上密切关联(Gray 1989)。蓝藻细胞所具
有的二氧化碳浓缩机制(CO2 concentrating mecha-
nism, CCM), 能够显著提高碳素同化关键酶Rubis-
co所在羧化体区域的CO2浓度, 克服该酶对CO2的
低亲和力, 促进羧化/加氧酶促反应向着羧化反应
进行, 以获得最大光合同化速率(Badger和Price
2003; Price等2008)。新近有观点认为, 将蓝藻
CCM相关功能基因转入高等植物, 可能改善后者
的光合生产力。有研究报道, 将相关的蓝藻基因
转入高等植物拟南芥中, 能够提高转基因植株在
低湿度条件下的生长(Lieman-Hurwitz等2003)。台
湾学者尝试将该基因转入‘台农67’ (‘Tainoung 67’)
及‘Kitaake’水稻品种中, 导致了不同的表型(王逸
非1999)。这些现象一方面说明该基因有一定的应
用价值, 另一方面也暗示该基因的转入可能在不
同种植物或品种间引起不同的性状。因此, 本研
究利用蓝藻基因组序列信息(Kaneko等1996), 从光
合作用研究的模式蓝藻——集胞藻6803中克隆
sbtA (sodium-dependent bicarbonate transport A,
植物生理学报352
slr1512)基因全长序列, 采用农杆菌介导的遗传转
化方法将该基因转入水稻品种‘中花11’中, 并对转
基因株系的表型进行分析, 初步揭示了该基因具
有提高水稻旗叶叶绿素含量及株高的新功能。
材料与方法
1 实验材料
集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)、水
稻‘中花11’ (Oryza sativa L. subsp. japonica cv.
‘Zhonghua 11’)种子、农杆菌(Agrobacterium tume-
faciens)菌株EHA105、大肠杆菌(Escherichia coli)
菌株DH5α均为本实验室保存的材料。集胞藻培
养基为BG11 (Allen 1968), 液体培养条件及细胞收
集方法按照文献(Zhang等2009)。水稻幼苗在温室
中的培养条件为自然光照12 h·d-1, 白天30 ℃/夜间
25 ℃。
2 实验方法
2.1 DNA提取及基因克隆
集胞藻基因组DNA提取参考Williams (1988)
的方法。跟据Cyanobase数据库(http://genome.ka-
zusa.or.jp)中集胞藻sbtA序列(slr1512), 采用Primer
3.0软件设计用于基因扩增的上下游引物。提取对
数生长期集胞藻的基因组DNA, 以其为模板, 用
PCR扩增获得目的基因。扩增引物: F, 5-ATG-
GATTTTTTGTCCAATTTCTTGACG-3 ; R ,
5-TTAACCTGCACCAAGGGTCTG-3。PCR扩增
使用rTaq酶及其反应体系(TaKaRa)。反应程序为:
94 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 30个
循环; 72 ℃ 10 min。将目的条带电泳回收后连接
到pCR8/GW/TOPO载体(Invitrogen)上, 转化大肠
杆菌DH5α。将筛选到的阳性克隆进行测序(上海
生工)验证, 挑选正确的克隆载体pCR8/GW/TOPO-
sbtA用于转化农杆菌。
2.2 表达载体构建及水稻遗传转化
采用Gateway技术中的LR ClonaseTM II En-
zyme Mix试剂盒及方法(Invitrogen)构建表达载
体。将克隆载体pCR8/GW/TOPO-sbtA的目的基因
整合到表达载体pH7WG2D的重组位点, 测序验证
后得到重组表达载体pH7WG2D-sbtA。水稻遗传
转化按照Toki等(2006)的方法进行。抗性愈伤组
织在含50 mg·L-1潮霉素和400 mg·L-1羧苄青霉素的
N6培养基(Hiei等1994)上筛选。诱导分化并获得完
整植株后炼苗5~7 d, 移至温室培养。
2.3 转基因再生植株的PCR检测
取温室培养的T0代转基因水稻的新鲜叶片,
提取基因组DNA (Murray和Thompson 1980)并通
过PCR对外源基因进行分子检测。用于PCR扩增
的特异性引物对为: F, 5-CGGAAGATAATCG-
GGTCAAA-3, R, 5-GGCAGATGGGATACCT-
GCTC-3, PCR扩增体系同2.1节, 循环次数增加到
35。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, EB染色
后观察结果。
2.4 多克隆抗体的制备
集胞藻sbtA基因编码蛋白的抗体由上海艾比
玛特生物医药有限公司制备。用SEALTM软件获得
两个抗原决定簇多肽序列 : 序列1 , K R K R K -
S A A A S I E E S F S K Q P VA A G D Y G D Q T D Y-
PRTRQEYLSQQEPEDNRVKIWPIIEESLQGPAL-
SAMLLGLALGIFTKPESVYEGFYDPLFRGLL-
S I L M L I M G M E AW S R I G E L R K VA ; 序列2 ,
ESKISYEAWAGALYPFMDIPALVTAIVVANI-
YLNKRKRKSAAASIEESFSKQPVAAGDYGDQT-
DYPRTRQEYLSQQEPEDNRVKIWPIIEESLQG-
PALSAMLLGLALGIFTKPESVYEGFYDPL-
FRGLLSILMLIMGMEAWSRIGELRKVA。重组蛋
白原核表达及纯化按照Zhou等(2008)的方法进
行。获得的重组蛋白混合后免疫兔子, 制备多克
隆抗体, 取抗血清经特异性验证, 再用于样品的
Western blot检测。
2.5 转基因再生植株的Western blot检测
按照Cui等(2009)的方法提取抽穗期T0代水稻
叶片中的蛋白质。SDS-PAGE及Western blot分析
参考Huang等(2004)进行。分离胶浓度12%, SbtA
及热激蛋白HSP抗体(华大基因)浓度为1:500。采
用ECL Plus Western Blotting检测试剂盒(GE
Healthcare)进行检测。
2.6 转基因水稻幼芽GFP荧光检测及拷贝数分析
种子萌发、GFP荧光检测及外源基因拷贝数
分析参考Toki等(2006)方法进行。选取PCR检测为
阳性的T1代转基因种子, 置于含无菌水的滤纸上,
在黑暗条件下于30 ℃培养箱中萌发。待幼芽长约
0.5 cm时, 置于荧光体视显微镜(德国Leica MZ10F)
下进行观察统计, 激发光波长400 nm, 发射光波长
470 nm。
杨浩萌等: 集胞藻sbtA基因具有提高水稻旗叶叶绿素含量及株高的功能 353
2.7 水稻旗叶叶绿素含量测定
参考Arnon (1949)方法测定水稻旗叶叶绿素
含量。取灌浆期水稻旗叶中段, 沿叶脉方向剪成5
mm×10 mm的小片, 混匀后称取2 g, 在80%丙酮中
研磨提取2次, 合并上清液, 用分光光度计(Smart-
SpecTM Plus, Bio-Rad, 美国)进行测定。野生型及T0
代和T1代转基因水稻各取3个独立株系, 每个株系
培养30~50棵植株, 随机选取10株的旗叶, 剪碎混
匀后分成3份(3次平行)。结果以3次重复平均值±
标准差表示(n=9), 差异显著性用t-检验进行分析。
2.8 水稻农艺性状分析
选取生长一致的T0代转基因株系3个, 测定灌
浆期水稻的株高、分蘖数、旗叶长度等性状指
标。在采收期调查抽穗率(抽穗率=抽穗数/分蘖数×
100%)、穗长、穗粒数及百粒重等。每个株系取
30株进行测定。实验重复3次。结果以3次重复的
平均值±标准偏差(n=3, means±SD), 差异显著性用
t-检验进行分析。
实验结果
1 sbtA基因克隆及序列分析
根据Cyanobase (http://genome.kazusa.or.jp)中
集胞藻6803的sbtA基因(slr1512)序列, 设计并合成
特异性引物, 以基因组DNA为模板, PCR扩增得到
特异扩增产物。测序结果显示, 该序列与Cyanobase
数据库中目标基因DNA序列完全一致, 预测的蛋
白分子量为39.7 kDa。在NCBI蛋白数据库中进行
搜索, 没有发现高等植物中存在sbtA的同源基因,
但在蓝藻中高度保守, 同源蛋白之间的序列相似
性很高(图1)。与聚球藻(Synechococcus elongates
PCC 7942, Synpcc7942_1475)、铜绿微囊藻(Micro-
cystis aeruginosa NIES-843, MAE62090)、鱼腥藻
(Anabaena sp. PCC 7120, All2134)及原绿球藻
(Prochlorococcus marinus MIT 9313, PMT1213)同
源蛋白的序列相似性分别为91.2%、90.6%、89.3%
及40%, 表明sbtA为蓝藻特有基因。
2 表达载体构建及遗传转化
农杆菌介导的转基因方法具有转化频率高,
再生植株可育率高, 可转移较大片段的外源DNA,
无需原生质体培养技术, 导入外源基因拷贝数低
等优点(Chang等1994)。我们采用该方法成功地将
sbtA导入水稻‘中花11’基因组中。图2为采用Gate-
way技术构建的目的基因表达载体, 携带有潮霉素
(Hyg)抗性基因和GFP报告基因(EgfpER)为转基因
植株筛选标记。从农杆菌侵染的270个水稻愈伤
组织块中, 筛选到50个具有抗性。通过诱导发芽
图1 蓝藻SbtA蛋白的氨基酸序列比对
Fig.1 Multiple sequence alignment of cyanobacterial SbtA proteins
植物生理学报354
和生根, 获得T0代转基因再生植株25棵, 用于进一
步的分子验证。
3 转基因植株的PCR和Western blot检测
提取经抗性筛选获得的25个T0代转基因植株
叶片中的基因组DNA, 并用基因特异性引物进行
PCR, 扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测分
析。由图3-A可见, 转基因植株中有407 bp的特异
性目的基因片段, 而野生型中没有, 表明sbtA基因
已整合到转基因株系的基因组中。为了进一步验
证转基因的有效性, 我们选取了8株PCR检测阳性
的转基因植株, 提取叶片中的总蛋白进行Western
blot分析。结果显示, 在转基因株系sbtA-2~9中检
测到分子量大小约为40 kDa的蛋白条带, 而在野生
型中仅有微弱的本底条带, 与多克隆抗体的特异
图2 转基因水稻表达载体的结构示意图
Fig.2 Schematic structure of expression
vector for transgenic rice
性有关(图3-B)。由此可见, SbtA蛋白在转基因株
系中得到了表达。
4 转基因植株GFP检测及外源基因拷贝数分析
为了考察转基因植株中外源基因的遗传稳定
性, 我们将经Western blot验证的8个转基因株系进
行自交, 获得T1代转基因水稻种子。将种子萌发后
获得的幼苗置于荧光体视显微镜下观察可见, 转
基因水稻中有绿色荧光蛋白GFP信号, 而野生型中
没有(图4), 表明GFP所在的T-DNA区已整合到转
基因株系的T1代基因组中。
外源基因的拷贝数常常会影响其遗传和表达
的稳定性(Toki等2006)。我们从上述株系中各选
取了200粒种子进行GFP荧光检测, 统计发出荧光
种子所占的比例。由表1可以看出, 大部分转基因
株系(sbtA-2、sbtA-3、sbtA-4、sbtA-5、sbtA-8)卡
方值(自由度df=1)<3.84的概率(P)>0.05。说明性状
分离比为3:1的假设与实际观察之间没有显著差
异, 该外源基因多为单拷贝插入, 获得的转基因植
株可以用于靶标基因功能研究。
5 转基因植株旗叶的叶绿素含量分析
为了分析sbtA基因对水稻农艺性状的影响, 我
图3 转基因水稻植株的PCR和Western杂交分析
Fig.3 PCR and Western blot analysis of transgenic rice
A: PCR。M: 标准分子量; WT: 野生型; 1~25: 转基因株系。B: Western blot。M: 标准分子量; WT: 野生型; 2~9: 转基因株系。
图4 水稻萌发种子的GFP荧光检测
Fig.4 GFP fluorescence detection of germinating seeds of rice
A: 野生型; B: 转基因株系。
杨浩萌等: 集胞藻sbtA基因具有提高水稻旗叶叶绿素含量及株高的功能 355
们测定了T0代和T1代转基因植株灌浆期旗叶的叶
绿素含量。结果表明, T0代3个转基因株系(sbtA-
2、sbtA-3和sbtA-4)的总叶绿素(a+b)含量分别为
2.7、2.3及1.9 mg·g-1 (FW), 比野生型至少提高了
27% (P<0.05); 转基因水稻T1代3个株系平均总叶
绿素含量为2.1 mg·g-1 (FW), 是野生型的1.4倍
(P<0.01) (图5)。对叶绿素a/b的分析结果表明, 该
比值在野生型和转基因株系中分别为2.5和2.8, 但
二者之间的差异并不显著(P>0.05)。
6 转基因植株的农艺性状分析
检测转基因T0代植株灌浆期的株高、旗叶长
度、分蘖数以及采收期的抽穗率、穗长、穗粒数
及百粒重, 结果表明, 转基因株系的株高均高于野
生型, 其他农艺性状无显著变化; 3个株系平均株
高分别为89、86及89 cm, 平均比野生型提高11.9%
(P<0.01) (图6, 表2)。
讨　　论
前人在蓝藻中的研究发现, sbtA基因的编码产
物可能作为Na+/HCO3
-同向转运蛋白在蓝藻二氧化
碳浓缩机制中起重要作用(Shibata等2002; Zhang等
2004)。但是, 作为外源基因sbtA在高等植物拟南
芥及水稻中引起的表型变化有所不同(Lieman-
Hurwitz等2003; 王逸非1999)。因此, 在不同受体
材料或品种中的功能验证很有必要。本研究首先
通过PCR扩增获得集胞藻sbtA基因全长序列, 然后
采用Gateway技术构建了含有sbtA目的基因的重组
表达载体, 并通过农杆菌介导的遗传转化, 将该基
因导入转化效率较高的水稻品种‘中花11’基因组
中, 获得了一系列单拷贝插入的转基因株系(图
2~4, 表1)。利用这些实验材料, 我们对野生型和转
基因株系与农艺性状相关的表型进行了比较分
析。结果表明, 将sbtA基因转入水稻引起了农艺性
状相关表型的变化。特别明显的是, 与相同发育
时期的野生型对照相比, T0代和T1代转基因株系灌
表1 转基因水稻中外源基因的拷贝数
Table 1 T-DNA copy numbers in transgenic rice
转基因株系 有荧光数 无荧光数 推测分离比 拷贝数 χ2*
sbtA-2 160 40 3:1 单拷贝 2.41
sbtA-3 151 49 3:1 单拷贝 0.01
sbtA-4 147 53 3:1 单拷贝 0.17
sbtA-5 146 54 3:1 单拷贝 0.33
sbtA-6 160 40 3:1 单拷贝 2.41
sbtA-7 170 30 3:1 未知 10.1
sbtA-8 150 50 3:1 单拷贝 0.01
sbtA-9 177 23 3:1 未知 18.7
　　*χ2<3.84, P>0.05 (df=1)。
图5 转基因水稻旗叶的叶绿素(a, b)含量
Fig.5 Chlorophyll (a, b) content in flag leaf of transgenic rice
*差异显著(P<0.05); **差异极显著(P<0.01)。
表2 转基因水稻的农艺性状
Table 2 Agronomic traits of transgenic rice
水稻类型 分孽数 抽穗率 旗叶长度/cm 穗长/cm 穗粒数 百粒重/g
野生型 5.7±1.5 76% 25.6±3.1 18.5±1.9 71.4±7.9 2.5±0.06
转sbtA基因 6.2±1.9 77% 26.3±3.9 20.0±2.2 74.1±6.5 2.5±0.05
图6 转基因水稻的株高分析
Fig.6 Plant height of transgenic rice
**差异极显著(P<0.01)。
植物生理学报356
浆期旗叶的叶绿素含量(a+b)均有提高(图5), 暗示
该外源基因可能在延缓灌浆期水稻旗叶衰老方面
有一定作用。由于旗叶是灌浆期稻穗的主要光合
功能叶片, 我们推测该外源基因的这一功能, 可能
也与转基因株系所表现的株高增加的性状有关(图
6, 表2)。进一步利用已获得的目的蛋白专一性抗
体对T2代纯合转基因株系中该蛋白的细胞定位、
时空表达谱及相关生理生化指标进行系统分析,
将有助于阐明sbtA基因引起上述农艺性状变化的
分子基础, 为该基因在水稻分子育种中的应用提
供重要的理论依据。
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