全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (2): 147~155 147
收稿 2011-11-10　　修定 2011-11-30
资助 国家自然科学基金面上项目(30971739)、上海市科委重点
科技攻关项目(09391912200)和上海市农委“水稻产业技术
体系建设”专项。
致谢 张豪和刘捷在Wx蛋白结构生物信息学软件分析方面给予
帮助。
* 对本文贡献相同。
** 通讯作者(E-mail: zyuan@sjtu.edu.cn; Tel: 021-34204869)。
优质稻米‘青香软粳’低直链淀粉含量形成分子机制的初步研究
李凌1,*, 田麟1,*, 王涛涛1, 蒋其根2, 罗治靖1, 陈明姣1, 张建中3, 张大兵1, 袁政1,**
1上海交通大学生命科学技术学院, 上海200240; 2上海市青浦区农业技术推广服务中心, 上海201700; 3上海市农业技术推广
服务中心, 上海201103
摘要: Waxy (Wx)基因在调控直链淀粉含量形成过程中起着重要的作用, 是稻米蒸煮食味品质的一个关键决定因素。在本
项研究中, 我们以直链淀粉含量为8.7%和10.2%的优质稻品种‘青香软粳’和‘南粳46’为主要研究对象, 初步分析并探讨了这
两个优质稻品种稻米低直链淀粉形成的分子调控机理。结果显示, 虽然都为Wx-II型粳稻品种, ‘南粳46’的Wx基因在启动
子-1 773位置存在AA/CT的变异, ‘南粳46’和‘青香软粳’的Wx基因在启动子+693位置具有G/A位点多态性。转录水平分析
表明, 在‘南粳46’和‘青香软粳’稻米发育过程中, Wx基因的表达模式有较大的差异, 可能与其启动子序列的多态性相关, AA/CT
变异处于Wx基因的转录调控区。Wx基因启动子后+693位点的多态性与已报道Wxmq多态性位点之一相同, 引起Arg158/His158
的变异; 生物信息学软件分析表明, 该位点处于底物进入Wx蛋白催化中心的袋口上, Arg158/His158位点的变异可能影响到底
物进入Wx蛋白催化活性中心的速率, 从而影响稻米直链淀粉的合成过程和含量。文章丰富了Wx基因多态性的研究, 为进
一步验证其核苷酸变异与稻米直链淀粉含量的相关性奠定了基础。
关键词: 优质稻米; ‘青香软粳’; 直链淀粉含量; Wx基因; 多态性
Preliminary Study for the Molecular Mechanism of Low Amylose Content in
High-Quality Rice (Oryza sativa L.) Variety ‘Qingxiangruanjing’
LI Ling1,*, TIAN Lin1,*, WANG Tao-Tao1, JIANG Qi-Gen2, LUO Zhi-Jing1, CHEN Ming-Jiao1, ZHANG Jian-Zhong3, ZHANG
Da-Bing1, YUAN Zheng1,**
1School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2Shanghai Qingpu District
Agricultural Technology Extension and Service Center, Shanghai 201700, China; 3Shanghai Agricultural Technology Extension
and Service Center, Shanghai 201103, China
Abstract: Waxy (Wx) gene, which is a key factor in regulating amylose content (AC), plays an important role in
determining rice eating and cooking quality (ECQ). In this study, for further exploiting the underlying relationship
and regulatory mechanism between the AC and ECQ, the Wx polymorphism was characterized in the high-quality
rice varieties ‘Qingxiangruanjing’ and ‘Nanjing46’ with 8.7% and 10.2% AC respectively. Although all of the vari-
eties we analyzed belong to the Wx-II japonica cultivars, the AC is different among them. Expression analysis of
Wx gene in ‘Qingxiangruanjing’ and ‘Nanjing46’ indicates that their expression patterns are different, which might
be correlated to the nucleotide polymorphism at nucleotide position -1 773 from the start codon in ‘Nanjing46’
variety, and the AA/CT nucleotides locate in the transcription regulatory area. While the Arg158/His158 polymor-
phism in both ‘Qingxiangruanjing’ and ‘Nanjing46’ varieties might have sophisticated effect on AC since the ami-
no acid is located in the pocket area of the Wx protein, which may change the catalytic activity of the starch syn-
thase for substrate and affect the AC in rice, and this mutation site also have been reported to be the one of
characterizations of the Wxmq gene. Therefore, our study enriches the research of Wx genetic polymorphism, and
provides basis for further validating the relationship between rice AC and Wx gene polymorphism.
Key words: high-quality rice;‘Qingxiangruanjing’; amylose content; Wx gene; polymorphism
稻米蒸煮食味品质是稻米品质的核心, 已成
为水稻育种工作者和消费者首要考虑的因素。进
行稻米品质形成的遗传调控因子、环境影响因素
及其相互作用的研究也成为近年来水稻育种学家
的研究热点之一。到目前为止, 关于稻米食味和
蒸煮品质方面的研究, 主要集中在直链淀粉含量
(amylose content, AC)、胶稠度(gel consistency,
植物生理学报148
GC)和糊化温度(gelatinization temperature, GT) 3个
方面(易俊良等2011)。前期的研究表明, 稻米的蒸
煮食味品质属数量性状, 遗传特征较为复杂(康美
花等2010); 其形成还较大地受到播种期、大田密
度、灌溉、收获期以及施肥等环境因素的影响(陈
翠竹等2008)。目前普遍认为稻米蒸煮食味品质主
要受胚乳基因型控制, 同时还受母体遗传效应以
及环境效应的影响, 受主效基因控制和微效基因
的修饰(康美花等2010)。
淀粉是稻米胚乳中最主要的成分, 由直链淀
粉和支链淀粉组成, 二者在胚乳中所占比例以及
支链淀粉的精细结构决定了水稻籽粒的理化性
质、营养品质、最终产量和稻米蒸煮食用品质的
优劣(Nakamura等2002)。合适的直链淀粉含量是
优质稻米的重要指标。研究表明, 淀粉的生物合
成和积累是一个复杂的生化调控过程, 由ADP-葡
萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,
AGPase)、颗粒结合淀粉合成酶(granule binding
starch synthase, GBSS)、可溶性淀粉合成酶(solu-
ble starch synthase, SSS)、淀粉分支酶(starch
branching enzyme, SBE)和脱分支酶(debranching
enzyme, DBE)等关键酶调控其合成代谢(田志喜等
2010; Jeon等2010; Nakamura等2010; Zeeman等
2010; James等2003)。这些籽粒淀粉合成代谢调控
酶在水稻籽粒的灌浆过程中特异表达 (沈鹏等
2006), 并受环境条件调节(陈翠竹等2008; Jiang等
2003), 进而影响稻米的蒸煮食用品质。分子生物
学研究发现, 水稻淀粉粒结合淀粉合成酶I (GBSS
I, 又名ADP-Glu-淀粉葡萄糖基转移酶)主要负责淀
粉粒中直链淀粉成分的合成, 是由第6染色体上的
Waxy (Wx)位点控制的(Wang等1995; Okagaki和
Wessler 1988), 催化ADP-Glu+(1,4)-α-D-glucose
(N)→ADP+(1,4)-α-D-glucose (N+1)的反应(舒小丽
和舒庆尧2004)。直链淀粉含量影响稻米品质和蒸
煮特性: 直链淀粉含量过高, 米饭粘性小, 米饭硬,
饭粒松散, 无光泽; 而含量过低, 米饭太软, 饭粒黏
结, 粘而腻, 弹性差(李广贤等2008)。相对而言, 较
多的人喜欢吃中等直链淀粉含量的大米, 因此对
Wx位点多态性及表达调控机制的研究具有重要的
理论意义和广泛的应用价值。
已有研究表明, Wx座位上存在多种复等位基
因(Wxa、Wxb、Wxop、Wxin、Wxhp、Wxmq和wx) (Liu
等2009; Mikami等2008; Sato等2002; Mikami等
1999), 其多态性与表达量和酶的活性直接相关
(Sun等2011; Liu等2009; Prathepha 2007; 蔡秀玲等
2000; Hirano和Sano 2000; Cai等1998; Hirano等
1998; Bligh等1998; Wang等1995; Sano 1984), 是导
致水稻直链淀粉含量和胶稠度变异最主要的原因
(Tran等2011; Tian等2009; Itoh等2003)。这些多态
性位点可被利用进行分子标记辅助育种, 为稻米
品质选育提供可靠的依据(田志喜等2010; Bao等
2006; Yamanaka等2004)。但水稻是一种多型性作
物, 在自然界中存在大量的遗传变异, 有必要在同
一遗传背景和种植环境下, 对常规育种材料及其
选育后代进行系统的性状和基因型分析, 从而研
究稻米籽粒淀粉合成代谢相关调控基因多态性形
成的原因及其表达调控与稻米品质间的相互关
系。‘青香软粳’是上海市青浦区农业技术推广服
务中心育种学家从中熟晚粳稻品种‘南粳46’群体
中选育出的新型优质米品种 , 其蒸煮的米饭光
亮、滑爽、较软, 并富有弹性, 食味佳, 具有较好
的推广前景。本文以‘南粳46’和‘青香软粳’等6个
正在上海市种植和选育推广的品种为研究对象,
结合Tian等(2009)的测序结果, 分析这些品种稻米
的直链淀粉含量和Wx基因位点多态性的相关性,
发现Wx基因在-1 773和+2 078位置还存在新的
AA/CT和C/T位点多态性; 在‘青香软粳’和‘南粳
46’的基因组中, +693还具有Wxmq相同的多态性位
点G/A。生物信息学分析表明, 这3个位点的多态
性可能会影响到Wx基因的表达模式和蛋白酶对底
物的催化效率, 从而影响稻米直链淀粉的合成过
程、含量和蒸煮食用品质。这些研究结果为进一
步分析Wx基因多态性与稻米直链淀粉含量及蒸煮
食用品质的相关性提供了基础, 为在生产中进行
优质稻米的品质选育提供理论基础。
材料与方法
1 水稻种植以及稻米直链淀粉含量的分析
本研究共收集了6个上海市正在种植和选育
的水稻(Oryza sativa L.)品种: ‘南粳46’、‘青香软
粳’、‘沪两优51’、‘沪优617’、‘金汇优50’和‘早丰
优69’。‘南粳46’是江苏省农业科学院粮食作物研
李凌等: 优质稻米‘青香软粳’低直链淀粉含量形成分子机制的初步研究 149
究所选育的国标二级优质稻谷; ‘青香软粳’是‘南
粳46’的自然变异株, 由上海市青浦区农业技术推
广服务中心选育; ‘沪两优51’、‘沪优617’、‘金汇
优50’和‘早丰优69’是杂交稻品种, 具有‘武运粳7
号’遗传背景。所有水稻品种于2009~2011年种植
于上海交通大学试验田(东经121.44º, 北纬31.03º),
常规水肥管理, 用于收获叶片、DNA提取和稻米
直链淀粉含量测定。稻米正常成熟后送至农业部
稻米及制品质量监督检验测试中心(中国水稻研究
所)进行检验分析。
2 DNA提取和测序
通过常规CTAB法提取不同水稻品种叶中
DNA。在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.
gov)中获得‘武运粳7号’的Wx基因组序列(LOC_
Os06g04200), 并以此序列为模板合成测序用引物
(表1)。
通过梯度PCR确定每对PCR引物的最适退火
温度。PCR扩增体系包括: 1 μL DNA抽提液(约10
ng DNA)模板、50 pmol·L -1引物0.2 μL、0.25
mmol·L-1 dNTP 1 μL、1×GCI缓冲液1 μL、1 U Taq
DNA聚合酶0.25 μL, 加ddH2O至10 μL。扩增程序
分两种: 500 bp以下的采用程序I (95 ℃变性5 min;
95 ℃ 1 min, 50~64 ℃梯度退火温度0.5 min, 72 ℃
0.5 min, 35个循环; 72 ℃延伸5 min); 500 bp以上的
采用程序II (95 ℃变性5 min; 95 ℃ 1 min, 50~64 ℃
梯度退火温度0.5 min, 72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃
延伸5 min)。将扩增后的片段进行电泳检测, 以条
带最清晰的反应温度为最适温度。
PCR扩增体系共20 μL, 其中包括: 2 μL DNA
抽提液(约20 ng DNA)模板、50 pmol·L-1引物(表1)
0.4 μL、0.25 mmol·L-1 dNTP 2 μL、1×GCI缓冲液2
μL、1 U Taq DNA聚合酶0.5 μL, 加ddH2O至20
μL。扩增程序分两种: 500 bp以下的采用程序I
(95 ℃变性5 min; 95 ℃ 1 min, 最适退火温度0.5
min, 72 ℃ 0.5 min, 35个循环; 72 ℃延伸5 min);
500 bp以上的采用程序II (95 ℃变性5 min; 95 ℃
1 min, 最适退火温度0.5 min, 72 ℃ 1 min, 35个循
环; 72 ℃延伸5 min)。
3 定量PCR分析
取授粉后0~5 d以及6~10 d的新鲜种子, 采用
Trizol (上海Genery公司)法提取组织总RNA。初步
提取的总RNA通过DNase (美国Promega公司)处理
后, 用0.3 μg的RNA反转录为双链的cDNA, 反转录
试剂盒为Ferments公司产品。1 μL反转录产物用
于定量PCR反应, 所用引物为QWx (表1)。定量
PCR反应在BIO-RAD公司CFX96荧光定量PCR仪
上进行。Wx基因在组织中表达量的判定通过相对
定量法 , 即同时在组织cDNA中扩增Wx基因和
ACTIN基因, 将CT值的差值转化为相对表达量的
值。所有QRT-PCR实验均进行3次技术性重复和3
次生物学重复, 以这3次技术性重复的数值取平均
值作为一个生物学数值; 而对3个这样的生物学数
值取平均得到最终表达值, 并依据这3个生物学数
值计算标准差。
4 基因多态性的生物信息学分析
参考Tian等(2009)的研究结果, 作为系统对照,
选择I型(‘桂香丝糯’、‘太湖糯’、‘江洲香糯’、‘苏
御糯’)、II型(‘农垦58’、‘武运粳7号’)和III型(‘台
中在来1号’、‘桂朝2号’、‘广陆矮4号’、‘龙特甫
B’) Wx基因单倍型品种进行Wx基因多态性与稻米
表1 Wx基因测序引物及定量RT-PCR所用引物序列
Table1 Primer sequences of Wx gene for DNA sequencing and quantitative RT-PCR
引物名称 F (正向引物, 5→3) R (反向引物, 5→3)
1 CAACAGAAACCACACACCACC CCTAACCAAACATAACGAACG
2 CATTCCTTCAGTTCTTTGTCTATC GATTGGGGATTAGAATTTGAAGC
3 GGCTCACCAAACCTTAAACAA ATGAACACACGGTCGACTCC
4 TTCGCAAGATTTTAACCCAAG GCAACCTGCAGTGAAAAAGA
5 ACTGGCGAGCTACCTGAAGA CTGCAACGCCTCCTTGTT
6 TGACAAATTTCAGGCAATCG AGGGCTGGAGAAATCAACAA
7 AGCTGCAGGGGATGAGATAC TCATCATCAGCATCAGACAGG
8 TTGAACAAGACGAACGGTCA GACTTGGCATAAAACAAAAATGG
QWx GCTTGGGATACCAGCGTTGTG ATGGGTTGTTGTTGAGGTTTAGGA
植物生理学报150
直链淀粉含量相关性的对比分析。在NCBI数据库
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索Wx基因全长
cDNA, 并用BlastN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST/Genome/PlantBlast.shtml)寻找籼稻(indica)
和粳稻(japonica)对应的基因组DNA序列。通过
Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbi-
ology.msu.edu/)和Gramene禾本科植物网(http://
www.gramene.org/)获得相关基因外显子和内含子
等信息, 根据cDNA序列对基因组DNA进行标注。
测序结果利用Vector NTI 11.0软件进行分析。
首先将本项研究和Tian等(2009)的测序结果导入
Vector NTI 11.0软件的DNA数据库, 利用该软件中
自带的Align X功能对片段进行比对。将具有相同
多态性位点的品种进行进一步聚类分析。对于比
对中发现的多态性位点, 采用TFBIND软件(http://
tfbind.hgc.jp/)预测转录因子与Wx基因上游的结合
位点。预测突变位点对于蛋白结构造成的影响时,
采用Swiss-Model的同源建模功能(http://swissmodel.
expasy.org/)预测蛋白的结构变化, 通过Discovery
Studio软件预测底物(ADP-葡萄糖)与Wx蛋白的结
合位点, 并用PyMOL软件显示蛋白质的三维结构。
实验结果
1 稻米品质测定
‘青香软粳’是上海市青浦区农业技术推广服
务中心选育出的优质水稻新材料, 与其遗传亲本
材料‘南粳46’相比, ‘青香软粳’稻米软而弹性适中,
在上海市优质稻区试评比中表现优异, 是进行优
质稻米形成分子调控机制研究的工具材料。与上
海市主栽品种‘武运粳7号’稻米外观相比, ‘南粳46’
和‘青香软粳’稻米外观透明度下降, 暗示‘南粳46’
和‘青香软粳’稻米的直链淀粉含量可能降低。测
定结果显示, ‘南粳46’直链淀粉含量为10.2%, ‘青
香软粳’直链淀粉含量为8.7%, 较‘武运粳7号’直链
淀粉含量 (15 .5%)明显下降 (分别为34.20%和
43.87%) (表2)。而正在选育的品种‘沪优617’、‘早
丰优69’、‘沪两优51’、‘金汇优50’直链淀粉含量
在16%~17%之间, 与‘武运粳7号’直链淀粉含量相
近(表2), 这可能与其选育亲本材料具有‘武运粳7
号’遗传背景相关。
Tian等(2009)根据稻米中直链淀粉含量和基
因多态性的相关性, 将Wx的基因型划分为Wx-I、
Wx-II和Wx-III型。Wx-II型品种的直链淀粉含量低
于Wx-III型, 但高于Wx-I型。从表2中可见, ‘青香软
粳’及其他正在选育的4个品种虽然都属于Wx-II型
粳稻品种 , 但其直链淀粉含量仍存在较大差异
(>30%), 这一差异可能是‘南粳46’和‘青香软粳’稻
米更软的原因。
2 Wx基因测序及基因多态性分析
前人的研究表明, Wx基因位点的变异在调控
稻米直链淀粉含量和胶稠度中起到重要的作用
(Tran等2011; Tian等2009; 蔡秀玲等2000; Cai等
1998; Bligh等1998; Wang等1995)。因此, 我们以
Wx-II型粳稻品种‘武运粳7号’的Wx基因序列为模
板, 设计测序引物(表1), 以期通过测序分析, 在上
海市正在种植和选育推广的品种中获得Wx基因新
的多态性位点。测序结果显示, 与‘武运粳7号’品
种Wx基因序列相比, 低淀粉含量品种‘南粳46’和
‘青香软粳’材料的Wx基因具有新的多态性位点:
在‘南粳46’ Wx基因启动子-1 773位有AA/CT的多
态性, 在‘南粳46’和‘青香软粳’ Wx基因启动子+693
位有G/A的单碱基核苷酸多态性, 这一多态性改变
发生在外显子上, 造成翻译后的氨基酸由精氨酸
(Arg, R)变为组氨酸(His, H)。该多态性位点与Sato
等(2002)在低淀粉含量‘Milky Queen’材料中发现
的Wxmq多态性位点之一相同(图1), 暗示着该位点
的改变可能与直链淀粉含量的变化有一定的相关
性。此外, 根据Tian等(2009)的测序结果, 我们发现
表2 稻米直链淀粉含量和胶稠度的测定
Table 2 Amylose content and gel consistency test
编号 品种名称 直链淀粉含量/% Wx基因单倍型
1 ‘青香软粳’ 8.7 II
2 ‘南粳46’ 10.2 II
3 ‘沪优617’ 16.5 II
4 ‘早丰优69’ 16.5 II
5 ‘沪两优51’ 17.0 II
6 ‘金汇优50’ 17.0 II
7 ‘农垦58’* 15.3 II
8 ‘武运粳7号’ 15.5 II
9 ‘台中在来1号’* 24.4 III
10 ‘桂朝2号’* 25.3 III
11 ‘广陆矮4号’* 24.7 III
12 ‘龙特甫B’* 25.1 III
　　*数据来源于Tian等(2009)的研究结果。
李凌等: 优质稻米‘青香软粳’低直链淀粉含量形成分子机制的初步研究 151
III型Wx基因的品种‘台中在来1号’、‘桂朝2号’、
‘龙特甫B’的Wx基因存在多个具有连锁遗传特点
的多态性位点。其中位于+2 078位碱基由野生型
中的C转换为T (图1), 这一突变的类型为错义突变,
导致这3个品种中编码的氨基酸由脯氨酸(Pro, P)
变为丝氨酸(Ser, S)。对这些多态性位点生物学功
能的分析将有助于加深对Wx基因表达调控机制和
生物学功能的认识。
3 Wx基因表达的定量PCR分析
前人的研究结果显示, Wx基因启动子区的多
态性与Wx基因的表达特征改变密切相关(蔡秀玲
等2000; Hirano和Sano 2000; 舒庆尧等1999; Cai等
1998; Bligh等1998, 1995; Hirano等1998; Ayres等
1997; Wang等1995)。为了研究Wx多态性与其表达
量的关系, 通过定量PCR, 我们在‘武运粳7号’、‘南
粳46’和‘青香软粳’的稻米发育过程中分析了授粉
后0~10 d中Wx基因的表达模式。由图2可见, 3个
品种Wx基因表达趋势一致, 即6~10 d时种子中的
Wx基因表达都比0~5 d的种子中高; 但‘南粳46’的
表达模式与‘武运粳7号’和‘青香软粳’有明显的不
同, 主要表现在授粉后0~5 d时, ‘南粳46’种子中的
Wx基因表达量很低, 而在第6~10 d时Wx基因的表
达量迅速升高, 这种转录水平上的差异可能主要
与‘南粳46’ Wx基因启动子-1 773位具有的AA/CT
核苷酸多态性有关(图1)。
TFBIND软件(http://tfbind.hgc.jp/)分析预测发
现, -1 773位左右的GAAAACAAACGG序列结合
转录因子的可能性极大, 因此, 该结合位点的多态
性可能直接影响到Wx基因的表达模式。‘青香软
粳’和‘武运粳7号’在启动子-1 773位点序列为AA,
而在‘南粳46’序列中变化为CT (图1)。荧光定量
PCR表达模式分析显示, ‘青香软粳’和‘武运粳7号’
Wx基因具有相近似的表达模式, 而‘南粳46’中Wx
基因的表达模式与它们明显不同, 暗示该位点的
多态性变化可能影响不同材料中转录因子结合的
活性, 造成表达量和表达模式的差异。当然, 这种
多态性与表达模式的变化以及与稻米中直链淀粉
含量变化的直接关系还需在今后的研究中进一步
深入分析。
4 Wx蛋白结构的生物信息学分析
序列分析比对表明: 与其他14个材料相比,
图1 Wx基因多态性分析
Fig.1 Polymorphism analysis of Wx gene
Wxa (Os06g04200)为野生型基因序列, 含有14个外显子。所示测序用引物与表1中的一致。实方框显示的是已经报道的Wx基因的多
态性位点; 虚方框显示的是本文发现的新多态性位点; 实线圆框显示的是我们发现的与Wxmq相同的多态性位点。
图2 Wx基因表达模式的定量RT-PCR分析
Fig.2 Quantitative RT-PCR analysis of Wx
gene expression pattern
植物生理学报152
‘青香软粳’和‘南粳46’这两个品种的Wx基因序列
在启动子+693位核苷酸发生了由G向A的单碱基
变化, 使得翻译后Wx蛋白的第158号氨基酸由Arg
变为His (图1), 这一基因型与Wxmq基因中的多态性
之一相同(图1) (Sato等2002), 暗示这一位点的变化
可能与稻米中直链淀粉含量的变化有密切的关
系。此外, 在‘台中在来1号’、‘桂朝2号’和‘龙特甫
B’这3个高淀粉含量的籼稻品种中, 启动子+2 078
位的核苷酸发生了C向T的转变(Tian等2009), 使翻
译后Wx蛋白的第415号氨基酸由Pro变为Ser (图
1)。我们推测, Wx蛋白外显子的多态性与其酶活
性可能相关。
为了对上述推测进行验证, 通过同源建模的
方法, 我们利用Swiss-Model的蛋白结构预测功能
对Wx蛋白的三维结构进行预测(http://swissmodel.
expasy.org/)。在寻找Wx蛋白与底物结合位点这一
步骤中, 我们选择ADP-葡萄糖为底物(舒小丽和舒
庆尧2004), 使用Discovery Studio软件模拟底物与
蛋白结合的情况, 结果发现以下位点可能是与底
物结合的潜在位点: Lys97、Thr98、Gly99、Gly100、
Ile406、Gly407、Arg408、Lys413、Leu489、Ile490、
Gln493和Trp360, 这些位点在图3-A中用蓝色标出。
由此可以推测, Wx蛋白催化活性中心或空间结构
上相近的氨基酸的变化可能会影响Wx蛋白与底物
的结合能力, 进而影响催化效率。‘青香软粳’和
‘南粳46’这两个品种中Arg158 (红色)/His158 (绿色)的
转变显示在图3-B中, 尽管Arg和His都属于碱性氨
基酸, 但是Arg的侧链是长且带正电的直链, 而His
的侧链则是由一个五元环状的结构, 它们侧链的
性状是不同的。‘台中在来1号’、‘桂朝2号’和‘龙
特甫B’这3个品种中Pro415 (红色)/Ser415 (绿色)的突
变显示在图3-C中, Pro属于芳香族氨基酸, 侧链有
苯环的结构, 不能和周围原子形成氢键, 而丝氨酸
属于极性氨基酸, 侧链有一个羟基, 能和周围原子
形成氢键。从蛋白结构分析可以看出, Pro415位点
在底物结合中心区附近(图3-A和C), 该位点突变成
Ser后可能影响蛋白结合位点与底物的亲和力 ;
Arg158虽然距离底物结合位点较远, 但是该位点处
于底物进入催化中心的袋口上(图3-A和B), Arg的
长链突变成His后可能会对底物ADP-葡萄糖进入
催化活性中心的速率产生影响, 从而会改变Wx蛋
白的催化效率。当然, 多态性位点与Wx蛋白酶活性
的相关性需要通过蛋白酶活性分析进一步验证。
讨　　论
我国稻种资源丰富, 类型复杂, 其中不乏口感
与蒸煮性质相当优秀的品种, 但多数稻米的食用
品质不够理想(刘巧泉等2006); 此外, 我国有相当
一部分水稻品种, 特别是籼型杂交稻, 虽然产量水
平较高, 但稻米的蒸煮食味品质急需改善; 而且,
普通百姓对大米的食味品质也提出更高的要求,
因此, 近年来水稻育种学家对改良稻米食用蒸煮
图3 Wx蛋白结构建模和催化活性中心预测
Fig.3 Modeling of Wx protein and catalytic center prediction
A: Discovery Studio软件模拟底物(ADP-葡萄糖)与Wx蛋白结合示意图; B: ‘青香软粳’和‘南粳46’ Wx蛋白发生Arg158/His158的氨基酸变
异产生结构变化示意图(Arg158红色/His158绿色); C: ‘台中在来1号’、‘桂朝2号’和‘龙特甫B’ Wx蛋白发生Pro415/Ser415的氨基酸变异产生结构
变化示意图(Pro415红色/Ser415绿色)。
李凌等: 优质稻米‘青香软粳’低直链淀粉含量形成分子机制的初步研究 153
性状开展了越来越多的研究。大量的研究工作已
经证实, Wx基因的表达调控是调节稻米直链淀粉
含量的关键因素之一, 直接影响到水稻种子发育
过程中直链淀粉的合成代谢和制成品的口感(Tran
等2011; Sun等2011; 康美花等2010; Tian等2009;
Liu等2009; Mikami等2008; 沈鹏等2006; Itoh等
2003; Sato等2002; 黄发松等1998; Bligh等1998;
Wang等1995)。但稻种资源的丰富性在生产应用
中受遗传及环境因素的限制, 有必要对不同遗传
背景的Wx基因多态性进行深入挖掘, 并研究其在
调控直链淀粉合成代谢及稻米蒸煮食用品质性状
中的相关性, 为充分利用稻种资源、在实际生产
中进行优质稻的分子辅助育种的应用奠定基础。
参考Tian等(2009)的研究结果, 与10个传统
糯、粳和籼稻水稻材料的Wx基因序列相比(见实
验方法), 我们的测序结果进一步证实了Wx基因的
基因型与稻米直链淀粉含量的相关性, 即I型Wx
基因的启动子前-1 160位的核苷酸是T, 启动子后
+111位有23 bp核苷酸插入; II型Wx基因的启动子
前-1 160位的核苷酸是T, 启动子后+111位有23 bp
核苷酸缺失; III型Wx基因的启动子前-1 160位的核
苷酸是G, 启动子后+111位有23 bp核苷酸缺失(图
1)。上海市正在种植和选育的‘南粳46’、‘青香软
粳’、‘沪两优51’、‘沪优617’、‘金汇优50’和‘早丰
优69’都为Wx-II型粳稻品种, 但‘南粳46’的Wx基因
在启动子-1 773位置存在AA/CT的变异, ‘南粳46’
和‘青香软粳’的Wx基因在启动子+693位置具有
G/A位点多态性。虽然舒庆尧等(1999)的研究结果
显示在Wx基因启动子前-1 220附近, 有一段多态
性微卫星(CT)n, 这段微卫星中CT重复的程度和直
链淀粉含量有着一定联系, 通常n为16或者17时,
直链淀粉含量中等, 往往有较好的口感。但我们
分析的6个品种与‘武运粳7号’相比, 在-1 220位点
没有差异, 都为17个CT重复。这也暗示我们发现
的多态性位点可能对Wx基因的多态性与淀粉含量
的相关性具有一定的贡献。
前人的研究显示, Wx基因在自然界中存在着
大量的变异, 在普通籼稻、粳稻、‘云南软米’品
种、美国长粒粳稻‘Lemont’、‘云南稻毫秕’、
‘Milky Queen’和糯稻中分别存在着Wxa、Wxb、
Wxop、Wxin、Wxhp、Wxmq、wx基因型(Tran等2011;
Liu等2009; Tian等2009; Mikami等2008; Sato等
2002; Wang等1995)。其中Wxb与Wxa相比, 第1内含
子+1位碱基由G变为T, 降低了Wx基因转录后
mRNA的剪接效率(Isshiki等2001, 2000; 蔡秀玲等
2000; Hirano和Sano 2000; Cai等1998; Hirano等
1998; Isshiki等1998; Wang等1995), 这种剪接效率
受转录调节因子如dull、Du1 (Zeng等2007; Isshiki
等2000)和环境温度的影响(Larkin和Park 1999)。
此外 , Zhu等(2003)的研究结果证明MYC蛋白
(OsBP-5)能与EREBP转录因子(OsEBP-89)相互作
用, 共同调节Wx基因的转录表达水平并影响籽粒
中的直链淀粉含量。转录水平上对Wx基因的调节
还表现在Wx基因的5-UTR区的(CT)n微卫星序列
的差异(舒庆尧等1999; Ayres等1997; Bligh等
1995)。高继平等(1995)的研究结果显示, 在Wx基
因的第一个外显子中, TTCATCA这段序列是Wx基
因的TATA盒, TATA盒结合蛋白与这段序列结合。
华健等(1992)通过凝胶滞后实验表明, 在TATA盒
上游240~577 bp的区域存在核蛋白结合位点, 即是
上游转录因子结合位点, 这一区域的突变可能会
对转录效率产生一定影响。
在本文中, 我们报道了一个AA/CT的新变异
位点 , 生物信息学分析显示该位点左右序列
(GAAAACAAACGG)很可能是调节Wx基因转录
表达水平的转录调控位点(TATA盒上游544 bp), 此
段区域的多态性可能直接影响到Wx基因的表达模
式。定量PCR分析Wx基因的表达模式, 初步证明
了我们的推测, ‘南粳46’的Wx基因在该位点发生了
AA/CT的变异, 可能是其Wx基因表达模式与‘武运
粳7号’和‘青香软粳’明显不同的原因之一。值得
注意的是, ‘青香软粳’是‘南粳46’的自然变异株, 其
直链淀粉含量的降低是否只是由于Wx基因启动子
CT回复至AA的变异引起的, 对这一问题的研究显
得十分有意义。虽然这一多态性与Wx基因表达模
式的相关性还需在不同的品种中深入分析验证,
但我们的研究结果足以暗示Wx基因的表达调控具
有多样性, 这种多样性不仅与其基因的剪接效率
相关, 也可能与上游调控因子的调控效率或环境
因素的调节相关(Larkin和Park 1999)。
与转录水平上的调节相比, Wx基因外显子上
存在更多的多态性, 直接影响了Wx基因翻译及其
植物生理学报154
催化底物的效率。Wx基因的第2外显子中23 bp的
插入, 导致终止密码子提前出现, 是形成wx等位基
因的根本原因(Mikami等2008)。Wxop与Wxa相比,
在第4外显子的A762突变为G762, 导致氨基酸由Asp
变为Gly (Mikami等1999); Wxin与Wxa相比, 第6外显
子中的A1132突变为C1132, 其编码的氨基酸由Tyr变
为Ser (Sano 1984); Wxmq与Wxa相比, 第4外显子和
第5外显子分别发生了Arg158/His158和Tyr191/His191的
转变(Sato等2002); Liu等(2009)的研究则发现, Wxhp
与Wxa相比, 第4外显子发生了Asp165/Gly165的转变,
生化分析显示这一变异没有影响GBSS I体外的催
化活性, 却大大降低了GBSS I与淀粉颗粒的结合
能力, 从而降低了稻米中直链淀粉的含量。我们
的研究结果显示, 在‘南粳46’和‘青香软粳’ Wx基因
的第4外显子中, 也存在着与Wxmq一致的Arg158/
His158变异, 属于错义突变(图1), 暗示Arg158位点的
变异在Wx蛋白功能变化中可能起着重要的作用。
蛋白质同源建模结构预测显示, Arg158位于底物进
入催化中心的袋口上(图3-A和B), 该多态位点的差
异可能会在体内改变Wx蛋白的催化活性或效率,
从而影响水稻稻米的淀粉合成代谢、含量和稻米
品质。这也可能是‘青香软粳’低直链淀粉含量形
成的原因之一。另一方面, 我们在已报道的‘台中
在来1号’、‘桂朝2号’和‘龙特甫B’这3个籼稻品种
中, 发现了Pro415/Ser415的变异(Tian等2009), 蛋白结
构分析显示Pro415位点在底物结合中心区附近(图
3-A和C), 该位点的变异可能会影响到蛋白结合位
点与底物的亲和力。Tian等人(2009)的报道显示,
这3个品种的直链淀粉含量和胶稠度均无明显差
异, 而糊化温度却相差很大。由此猜测这些多态
性位点的变异可能影响了Wx基因对糊化温度的调
控作用, 暗示Wx蛋白的功能受到本身蛋白结构的
影响较大, 不仅影响到对底物的催化效率和直链
淀粉含量的高低, 还可能影响到对底物的亲和力,
影响直链淀粉颗粒的形成。尽管这些推测有待于
生化实验和蛋白晶体结构解析等实验的验证, 但
我们的研究结果进一步暗示在田间选种过程中,
进化压力引起的Wx基因的多态性变异很可能影响
到Wx蛋白的催化效率, 从而影响到稻谷中淀粉含
量和食用品质(Olsen等2006)。此外, 由图1可见,
Wx基因第4外显子发生了大量的变异, 该区域可能
在Wx蛋白的调控功能起着重要的作用。
Tian等(2009)的研究表明, 有多个基因参与调
控稻米中淀粉的合成代谢, 因此, 后期的研究中,
有必要在‘青香软粳’和‘南粳46’这两个材料中对其
他基因的功能进行进一步的研究, 以确认该材料
米质变化的根本原因。相信在Wxmq、Wxhp、Wxop
基因型材料以及‘南粳46’和‘青香软粳’中深入分析
米质变化与关键调控基因变异的相互关系及分子
调控机制, 将大大加深我们对Wx基因调控直链淀
粉合成代谢分子机理的认识。
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