全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 5 期，2009 年 5 月 483
收稿 2009-03-23 修定 　2009-04-15
* 通讯作者(E-mail: wbshenh@nja u.edu.cn; Tel: 025-
8 4 3 9 5 7 7 3 )。
血红素加氧酶介导 GA 对小麦糊粉层中 α-淀粉酶的诱导表达
武明珠, 徐晟, 崔为体, 张博, 刘雅辉, 凌腾芳, 沈文飚*
南京农业大学生命科学学院, 南京农业大学 -贝克曼离心机合作示范实验室, 南京 210095
提要: 单独以赤霉素(GA)处理或与HO-1诱导物高铁血红素(Ht)和CO水溶液组合处理均导致小麦糊粉层中血红素加氧酶
(HO)活性的提高, 同时 α-淀粉酶基因表达和 α-淀粉酶活性也明显受诱导; 用HO-1专一性抑制剂锌原卟啉(ZnPPIX)预处
理 6 h后, 上述效应部分受阻断。这暗示HO可能参与GA诱导的 α-淀粉酶基因表达。
关键词: 小麦糊粉层; 血红素加氧酶; 高铁血红素; 一氧化碳; 赤霉素; α-淀粉酶
Involvement of Heme Oxygenase in Gibberellic Acid-induced α-Amylase Ex-
pression in Wheat Aleurone Layer
WU Ming-Zhu, XU Sheng, CUI Wei-Ti, ZHANG Bo, LIU Ya-Hui, LING Teng-Fang, SHEN Wen-Biao*
Cooperative Demonstration Laboratory of Centrifuge Technique, Nanjing Agricultural University and Beckman Coulter Ltd. Co.,
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: In this study, we showed that gibberellic acid (GA) with or without HO-1 inducer hematin (Ht) or
carbon monoxide (CO) aqueous solution not only led to promote heme oxygenase (HO) activity in wheat aleu-
rone layer, but also enhanced α-amylase gene expression and its enzyme activities. Whereas, application of HO-1
inhibitor zinc protoporphyrin IX (ZnPPIX) for 6 h blocks partially above processes. Together, above results
suggested that HO might be involved in GA-induced α-amylase gene expression.
Key words: wheat (Triticum aestivum L.) aleurone layer; heme oxygenase; hematin; carbon monoxide; gibber-
ellic acid; α-amylase
在种子萌发过程中, 胚产生的赤霉素(GAs)诱
导糊粉层细胞合成并分泌水解酶(主要是 α- 淀粉
酶), 从而为种子萌发提供能量和底物。这一过程
也称为糊粉层细胞内的GA响应事件, 因此糊粉层
可以作为研究GA信号转导的一种模式系统(Kuo等
1996; Jones 等 1998)。
血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血红素
分解代谢过程中的限速酶, 它催化血红素降解成为
胆绿素(BV)、一氧化碳(CO)和游离的二价铁离子
(Fe 2+)。已经知道, 与一氧化氮合酶 / 一氧化氮
(NOS/NO)信号系统的功能相类似, 动物的 HO/CO
信号系统也具有舒张血管和支气管平滑肌, 参与血
压调节和拮抗炎症反应, 以及抗氧化的功能(Verma
等 1993; Dulak 和 Józkowicz 2003)。HO 有 3 种不
同类型的同工酶: HO-1、HO-2和HO-3。其中HO-1
是诱导型, 而属于组成型的HO-2和HO-3在生物体
内表达量较低。现已知HO-1几乎分布于动物所有
的器官和组织中, 并涉及整个生长发育过程。近年
来的研究表明, HO 在植物的生长发育和抗逆过程
中也有生理生化功能, 例如HO参与ABA诱导的蚕
豆叶片气孔的关闭(Cao等2007), HO/CO是生长素
诱导黄瓜不定根发生的下游信号系统( X ua n 等
2008)。胡冰等(2008)的研究也表明, HO-1 的诱导
物高铁血红素(hematin, Ht)可以缓解 200 mmol·L-1
NaCl胁迫所导致的小麦幼苗根部生长受抑, 并维持
根部的离子稳态。
本文以小麦品种 ‘扬麦13’的成熟种子糊粉层
为材料, 研究Ht或CO对GA诱导糊粉层中α-淀粉
酶基因表达的影响, 并初步探讨HO是否属于GA信
号转导的下游媒介。
材料与方法
GA、Ht和HO-1专一性抑制剂锌原卟啉(zinc
protoporphyrin IX, ZnPPIX)均购自 Sigma 公司, 所
有试剂均为现用现配。CO饱和溶液的制备参考徐
霁等(2006)文中的方法: 用浓硫酸与甲酸共热制备
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CO气体, 反应式为: H2SO4(l)+HCOOH(l)→CO(g)+
H2SO4·H2O(l)。气体持续通入盛有 100 mL 糊粉层
培养液(5 mmol·L-1 CaCl2水溶液)的玻璃烧杯中长达
30 min以上, 以确保溶液达到饱和。饱和溶液用无
菌过滤器过滤后立即用无菌的糊粉层培养液稀释至
实验所需的 CO 浓度(10.0% 饱和度)。
材料为小麦(Triticum aestivum L.)品种 ‘ 扬麦
13’ 种子。去掉胚和尾端的半粒种子用 1% 的次氯
酸钠消毒 20 min, 再用灭菌水清洗数次, 置于盛有
无菌水的培养皿中, 在温度为(25±1)℃的温箱中培
养 48 h。先用金属刮刀轻轻的刮去半粒种子的淀
粉, 剥离的糊粉层再用无菌水洗数次, 再把附着的
淀粉除去。最后剥离的糊粉层用 3 mL糊粉层培养
液(5 mmol·L-1 CaCl2, Con)放置于25 mL的三角瓶中
培养, 每个小瓶中有10片糊粉层。其他处理有: (1)
Ht: Con+10 μmol·L-1 Ht; (2) CO: Con+10.0% CO; (3)
GA: Con+50 μmol·L-1 GA; (4) GA+Ht: Con+50 μmol·L-1
GA+10 μmol·L-1 Ht; (5) GA+CO: Con+50 μmol·L-1
GA+10.0% CO; (6) ZnPPIX → GA: 50 μmol·L-1
ZnPPIX → Con+50 μmol·L-1 GA; (7) ZnPPIX →
GA+Ht: 50 μmol·L-1 ZnPPIX → Con+50 μmol·L-1
GA+10 μmol·L-1 Ht; (8) ZnPPIX → GA+CO: 50
μmol·L-1 ZnPPIX→Con+50 μmol·L-1 GA+10.0% CO;
(9) Con → GA: Con → Con+50 μmol·L-1 GA; (10)
ZnPPIX → Con: 50 μmol·L-1 ZnPPIX → Con。其
中, ZnPPIX和培养液的预处理(ZnPPIX→和Con→)
时间均为 6 h, 每组处理至少 3次重复, 每次重复至
少 30 片糊粉层。
α- 淀粉酶的活性测定和单位规定参照 Jones
和Varner (1967)以及Kuo等(1996)文中的方法。HO
的活性测定按照我们前文中的方法(Han 等 2008;
Xuan等2008), 以37 ℃下每30 min催化生成1 nmol
胆绿素为一个酶活单位(U)。
按照沈文飚等(2003)文中的方法提取各个不同
处理小麦糊粉层的总 RNA, 采用提取的总RNA进
行 cDNA 第一条链的合成反应。反应体系为: 20
μL体系中含 5 μg RNA样品, 2.5 U AMV反转录酶
(TaKaRa), 1 μmol·L-1 Oligo-dT引物, 合成后的cDNA
放在-20℃中保存备用。PCR 反应体系为 20 μL,
cDNA 稀释 2 倍后取 2 μL, 各个引物终浓度为 10
pmol·L-1, Taq 聚合酶(TaKaRa) 1 U; 反应循环参数:
预变性 95 ℃ 5 min; 94℃35 s, 47~54 ℃30 s, 72 ℃
60 s, 29 个循环; 72 ℃延伸 5 min。引物按以下基
因设计: α-淀粉酶基因(alpha-Amy3, GenBank登录
号为 X05809)上游引物 5-TCGGTGATCCAGG-
CGTTCCG-3, 下游引物 5-GGCATCCACCCA-
ATCATACCG-3 (扩增片段为 568 bp); 18S rRNA
( G enB a nk 登录号为 AJ 2 7 2 1 8 1 )上游引物 5 -
CAAGCCATCGCTCTGGATACATT-3, 下游引物5-
CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3 (扩增片段长度
为 658 bp)。以 18S rRNA 基因的 RT-PCR 产物为
内参, 对目的基因转录本水平进行RT-PCR半定量
分析。凝胶电泳结束后, 以溴化乙锭染色后检测,
并克隆测序验证。用 Quantity One 软件对 alpha-
Amy3 基因相对表达进行条带定量分析, 为便于比
较, 设定对照(Con, 0 h)表达量为 1。
所有数据是至少 3次独立实验结果的平均值,
选择 Duncan’s 测验做显著性统计分析。
实验结果
1 HO-1 诱导物 Ht 和 CO 水溶液对 GA 诱导 α- 淀
粉酶表达的影响
图 1结果显示, 与Kuo等(1996)报道的结果相
一致, GA处理后的小麦糊粉层中α-淀粉酶活性显
著得到诱导; 单独加入Ht或CO也有不同程度的诱
导 α- 淀粉酶活性的作用, 但是效果不如 GA。与
单独 GA 处理的相比, Ht 和 CO 分别与 GA 组合处
图 1 高铁血红素和 CO 对 GA诱导小麦糊粉层中
α- 淀粉酶活性的影响
Fig.1 Effects of hematin and CO on GA-induced α-amylase
activity in wheat aleurone layer
植物生理学通讯 第 45 卷 第 5 期，2009 年 5 月 485
理(GA+Ht 和 GA+CO)的 α- 淀粉酶活性有明显提
高。各处理 24 h 时的 α- 淀粉酶基因表达与酶活
性的变化趋势一致(图 2)。Ht 或 CO 与 GA共处理
后的 α- 淀粉酶表达诱导有一定的叠加效应。
图 2 高铁血红素和 CO 对 GA诱导小麦糊粉层中
α- 淀粉酶基因表达的影响
Fig.2 Effects of hematin and CO on GA-induced α-amylase
gene expression in wheat aleurone layer
2 HO-1 的抑制剂ZnPPIX预处理对GA诱导糊粉
层中 α- 淀粉酶表达的影响
图3结果显示, HO-1的抑制剂ZnPPIX预处理
(ZnPPIX →GA) 6 h与GA单独处理的(Con→GA)
相比, 其受 GA 诱导的 α- 淀粉酶活性明显降低, 其
中处理 72 h的 α- 淀粉酶活性比 GA单独处理的降
低 43.7%。图 4 结果表明, ZnPPIX 预处理能部分
下调 GA 诱导 24 h 内的 α- 淀粉酶基因转录本, 这
与酶活性的变化是一致的。这些结果表明 ,
ZnPPIX 预处理能部分阻断 GA 诱导的小麦糊粉层
α- 淀粉酶活性和基因表达。
图 4 ZnPPIX 预处理对 GA 诱导的小麦糊粉层中
α- 淀粉酶基因表达的下调作用
Fig.4 HO-1 inhibitor ZnPPIX pretreatment downregulated
α-amylase gene expression induced by GA in
wheat aleurone layer
3 ZnPPIX 预处理部分抑制 GA 和 Ht 以及 CO 组
合对 HO 和 α- 淀粉酶活性的诱导
图5-a结果表明, GA单独处理8 h的小麦糊粉
层中HO的活性受到诱导(P<0.05); GA和Ht或CO
组合可进一步上调HO活性。而ZnPPIX预处理则
部分削弱上述的诱导效应。值得注意的是 ,
ZnPPIX 单独处理的(ZnPPIX → Con) HO 活性比不
用 ZnPPIX处理的明显下降(P<0.05)。α- 淀粉酶活
性的变化与 HO 的趋势类似(图 5-b)。
讨 论
近年来的研究表明, HO/CO信号系统在植物生
长发育过程中也起作用。如 HO可调节 ABA诱导
的蚕豆叶片气孔的关闭(Cao等2007)以及生长素诱
导的黄瓜不定根的发生(Xuan 等 2008), 此外, CO
对镉诱导苜蓿根组织的氧化伤害也有防护作用(Han
等 2008)。本文结果表明, HO还可能参与GA诱导
小麦糊粉层中 α- 淀粉酶基因的表达。GA 单独处
理能诱导 α- 淀粉酶和 HO 活性的提高(图 1、5)。
GA和HO-1诱导物Ht以及CO水溶液的组合对小
图 3 ZnPPIX 预处理对 GA 诱导的小麦糊粉层中
α- 淀粉酶活性的逆转作用
Fig.3 HO-1 inhibitor ZnPPIX pretreatment reversed the
enhancement of α-amylase activity induced by
GA in wheat aleurone layer
植物生理学通讯 第 45 卷 第 5 期，2009 年 5 月486
图 5 ZnPPIX 预处理对 GA 和 Ht 或 CO 组合诱导的小麦糊
粉层中 HO (8 h) (a)和 α-淀粉酶(24 h) (b)活性的影响
Fig.5 Effects of ZnPPIX pretreatment on HO (8 h) (a) and
α-amylase activity (24 h) (b) induced by individual GA
in wheat aleurone layer
柱形上不同字母表示数字间差异达到 P< 0 .0 5 水平。
麦糊粉层中 HO 和 α- 淀粉酶活性的诱导还有一定
的叠加效应, HO-1的专一性抑制剂ZnPPIX预处理
能部分阻断这一效应(图5), 这暗示小麦糊粉层中受
GA诱导的α-淀粉酶活性对HO-1有依赖型和不依
赖型两大类。
已经知道, α- 淀粉酶的诱导表达与 G 蛋白、
cG M P、蛋白质磷酸化作用、磷酸肌醇循环途
径、Ca2+ 和钙调素等因素都有关系(Jones 等 1998;
Penson 等 1996; Kuo 等 1996; Yotsushima 等 1993;
Bush 1996)。另外, 有人认为 HO 分解产物之一的
CO 是一种气体信号分子, 并主要通过 sGC/cGMP
发挥作用(Verma 等 1993; Dulak 和 Józkowicz
2003)。Muramoto等(2002)也发现体外表达拟南芥
HO-1基因可以产生CO, 因此cGMP是否也属于HO
介导 GA 诱导 α- 淀粉酶基因表达的下游信号分子
还有待进一步研究。
参考文献
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