全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (11): 1613~1620　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0371 1613
收稿 2014-08-18　　修定 2014-09-30
资助 江苏省农业科技支撑项目(BE2013430)。
* 通讯作者(E-mail: guzx@njau.edu.cn; Tel: 025-84396293)。
高等植物中异黄酮合成代谢及其调控
焦彩凤, 杨润强, 顾振新*
南京农业大学食品科技学院, 南京210095
摘要: 异黄酮是植物次级代谢过程中产生的酚类物质, 豆科等植物中含量丰富, 在动植物体内有着广泛的生理作用。本文
综述了高等植物中异黄酮的合成代谢途径及其关键酶以及调控机理。
关键词: 高等植物; 异黄酮; 合成代谢; 调控
Biosynthesis, Metabolism and Regulation of Isoflavones in Higher Plants
JIAO Cai-Feng, YANG Run-Qiang, GU Zhen-Xin*
College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Isoflavones are phenolic secondary metabolites found mostly in legumes, which possessed extensive
physiological and pharmacological activities. This article summarized the pathway of its biosynthesis and key
enzymes, the mechanism of regulation of isoflavones in higher plants.
Key words: higher plants; isoflavones; biosynthesis and metabolism; regulation
综　述 Reviews
异黄酮是高等植物中苯丙烷类代谢途径的分
支所形成的一类次生代谢产物, 其在豆科植物中
含量丰富。异黄酮对人体具有雌激素特性(Ren等
2001)、抗癌(Ashton和Ball 2000)、降低心血管疾
病发生率(Masilamani等2012)及调控免疫应答(Re-
gal等2000)等多种生理作用。在植物体内异黄酮
具有抵御逆境胁迫(Chen和Gallic 2005)、抵抗微生
物侵染(Malenčić等2013)、作为昆虫拒食剂(Lane
等1985)及促进根瘤菌趋化、生长繁殖、根瘤发育
和固氮(Cho和Harper 1991)等作用。从植物中提取
的异黄酮含量较低, 大豆(Glycine max)及其制品中
仅含异黄酮0.2~1.6 mg·g-1 (DW) (Kurzer和Xu
1997), 因而采用生物转化技术提高植物中异黄酮
含量, 可进一步扩大异黄酮的应用范围。本文从
信号分子、酶水平和基因水平上综述调控异黄酮
合成的机理, 为异黄酮在动物体和植物体内的应
用提供参考。
1 异黄酮合成途径及其关键酶
异黄酮在豆科植物中含量较为丰富, 主要由
染料木黄酮(genistein)、黄豆苷元(daidzein)和黄豆
黄素(glyeitein)组成, 相对含量分别为50%、40%和
10%, 三者在植物体内均以游离型或结合型(葡萄
糖苷、乙酰基葡萄糖苷和丙二酰基葡萄糖苷)的形
式存在(Ren等2001)。异黄酮合成过程包括两个主
要的阶段(Dhaubhadel 2011)。
第一阶段: 苯丙氨酸(Phe)经苯丙氨酸解氨酶
(PAL)脱去胺基, 形成肉桂酸(cinnamic acids), 肉桂
酸经细胞色素P450单加氧酶——肉桂酸-4-羟化酶
(C4H)催化加羟基, 形成p-香豆素(pcoumarin), 在4-
香豆素辅酶A连接酶(4CL)作用下, 生成前体物
质——p-香豆酰-CoA (pcoumarate CoA)。
第二阶段分为三步: (1) p-香豆酰-CoA在查尔
酮合酶(CHS)和查尔酮还原酶(CHR)的催化下生成
柚皮素查尔酮(naringein chalcone)或异甘草素
(isoliquirtigenin)。(2)柚皮素查尔酮或异甘草素在
查尔酮异构酶(CHI)的催化下生成柚皮素(narin-
genin)或甘草素(liquirtigenin), 其中柚皮素是黄酮
类和异黄酮类化合物途径的竞争性底物, 对柚皮
素进一步修饰可形成多种黄酮类化合物。最典型
的反应是以柚皮素为底物 , 在类黄酮3-羟化酶
(F3H)催化下, 形成黄烷酮醇(dihydroflavonol), 在
黄酮合成酶(FNS)催化下, 形成黄酮(flavone)。(3)
植物生理学报1614
甘草素或柚皮素在P450单加氧酶——异黄酮合酶
(IFS)催化下, 生成大豆异黄酮游离苷元: 染料木黄
酮、黄豆苷元和黄豆黄素, 其均在UGT (尿苷二磷
酸葡萄糖基转移酶)、AT (乙酰基转移酶)和MT (丙
二酰基转移酶)催化下, 生成葡萄糖苷型、乙酰基
葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型异黄酮。
1.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)
苯丙烷类合成途径中, PAL作为起始酶催化
Phe脱氨基, 形成肉桂酸, 产生苯丙烷骨架。PAL将
初生代谢产物转化为大量的次生代谢产物, 其催
化活性影响整个途径效率(Jiang等2013)。PAL以
同源四聚物形式存在, 其核心结构由近乎平行的α-
螺旋形成, 类似于组氨酸降解途径中的组氨酸解
氨酶(HAL) (Ritter和Schulz 2004)。PAL有一个独
特的共价辅因子: 由一个保守活性位点Ala-Ser-Gly
三肽的环化和脱水形成的4-methylidene-imidaz-
ole-5-one (MIO)。PAL反应可能起始于MIO和氨基
基团或苯丙氨酸的芳香环之间互作。
Calabrese等(2004)和Moffitt等(2007)认为酵母
和蓝藻细菌PAL结构与植物PAL结构相同。真核
生物PAL的限制底物进入和产物释放的N-末端延
伸物比原核生物大。两种生物的PAL结构和序列
的同源性比较结果提示真核生物PAL可能由细菌
HAL进化而来(Moffitt等2007)。
1.2 查尔酮合酶(CHS)
CHS是植物特定的II型聚酮合酶。苜蓿CHS的
晶体结构已被确定为2个42 kDa多肽的同源二聚体,
每个单体有2个结构域(Du等2010), 活性位点位于结
构域的裂缝, Cys164作为亲核物质, His303作为广义
碱, Asn336在脱羧反应中起重要作用(Wang 2011)。
最早在欧芹(Petroselinum crispum)中发现编
码CHS的基因(Kreuzaler等1983), 后来相继在葡萄
(Vitis vinifera)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、矮
牵牛花(Petunia hybrida)、玉米(Zea mays)、苜蓿
(Medicago sativa)等中克隆(Du等2010)。CHS属于
多基因家族, 矮牵牛花中有12种, 大豆中有9种CHS
基因(CHS1~CHS9)。但在拟南芥和欧芹等植物中,
仅为单拷贝基因。在大豆中CHS基因在所有组织
中均表达, 但表达水平不同。转录分析表明CHS7/8
在根中表达量最多, 其次是种皮; 子叶中CHS2的表
达量约为CHS7/8的4倍 ; 叶子中主要表达的是
CHS1和CHS7/8; 所有组织中CHS4的表达量均少
(Du等2010)。
大豆CHS基因家族的序列同源性较高, 编码
区中80%~99%的核苷酸序列相似, 在植物生长的
不同阶段和环境下, 基因家族成员的表达情况不
同, 其中CHS7和CHS8对于异黄酮合成和积累至关
重要。Dhaubhadel等(2007)通过转录组分析发现2
个不同品种的大豆种子培养物中异黄酮水平的差
异性是由种子发育晚期CHS7和CHS8差异表达所
致。在豆科植物中, CHS蛋白与一个NADPH依赖
性还原酶协同作用, 催化1分子4-香豆酰-CoA与3
分子丙二酰-CoA缩合产生C15骨架—四羟基类化
合物(柚皮素查尔酮)或三羟基类化合物(异甘草
素), 为异黄酮的生物合成提供上游底物, 而在非
豆科植物中只生成三羟基类化合物(异甘草素)
(Dhaubhadel 2011)。
1.3 查尔酮异构酶(CHI)
CHI具有立体专一性, 可在很大程度上加速查
尔酮环化, 形成黄酮核(Du等2010)。从苜蓿中分离
得到的II型CHIs整体结构为β-三明治折叠, 类似于
颠倒的花束, 其活性依赖于活性位点和底物间氢
键网的形成(Wang 2011), CHI是220个氨基酸残基
组成的功能性单体。CHI基因家族包含8个成员,
分为4个亚家族: CHI1、CHI2、CHI3和CHI4 (Ma-
silamani等2012)。基于催化能力可将CHI基因进一
步分为I型和II型 , 其分布具有高度的家族特异
性。所有高等植物中都有I型CHIs (如CHI2), 可将
柚皮素查尔酮转化为柚皮素; II型CHIs (如CHI1)几
乎为豆科植物独有, 除具有I型CHI的功能外, 还能
将异甘草素转化为甘草素(Du等2010)。豆科植物
中的CHI倾向于以6-脱氧查尔酮为底物, 而非豆科
植物中的CHI倾向于以查尔酮为底物。非豆科植
物CHI的Ser和Ile残基可能决定了对底物的优先选
择性(Ralston等2005)。
豆科植物中, 同型CHI的氨基酸序列有超过
70%的一致性, 而I型和II型CHI的一致性仅为50%
(Ralston等2005; Marinova等2007)。I型和II型CHI
有不同的表达和调控模式(Shimada等2003)。动力
学和表达试验表明, I型CHI和其他类黄酮途径中
的酶(如F3H)相互协调, 优先在花组织中表达, 对慢
生根瘤菌不响应。相反, II型CHI和异黄酮途径中
焦彩凤等: 高等植物中异黄酮合成代谢及其调控 1615
的酶(如IFS)相互协调, 在根中特异性表达, 可被结
瘤信号诱导(Jez等2000; Marinova等2007)。因此, I
型CHI与类黄酮合成有关, II型CHI则与异黄酮合
成有关(Kim等2007)。
大豆II型CHIs的多功能性对于植物代谢途径
中异黄酮的合成具有重要意义。II型CHIs中4个氨
基酸残基(Thr48、Tyr106、Asn113和Thr190)对催
化异甘草素转化为甘草素的过程具有重要作用
(Jez等2002)。保守的Tyr106活化一分子水, 作为环
化反应的酸。大豆CHI1和CHI2亚家族与其他豆科
植物中II型CHIs氨基酸序列的比较结果表明, 关键
氨基酸残基活性位点几乎完全保守。CHI2中由于
Thr190被替代, 使其催化能力减少6倍(Dhaubhadel
2011); CHI3和CHI4亚家族关键氨基酸残基活性位
点不保守, 这是其在酵母表达分析中转化查尔酮
衍生物的不稳定性原因(Ralston等2005)。
以前认为CHI为植物所特有(Jez等2000), 然而
最新研究表明: 在苔藓植物、真菌和细菌中均含
有CHI独特的β-三明治折叠的同源染色体(Gen-
sheimer和Mushegian 2004)。
1.4 异黄酮合酶(IFS)
IFS即2-羟基异黄酮合成酶(2-HIS), 是苯丙烷
代谢途径中引入异黄酮代谢支路的关键酶。IFS是
一个微粒体细胞色素P450单加氧酶, 催化底物柚
皮素和甘草素的一个芳香基从C-2迁移到C-3的反
应, 该反应依赖于NADPH和O2的参与, 产生不稳定
的中间体——2-羟基异黄酮, 该中间体经2-羟基异
黄酮脱水酶催化的脱水反应在C-2和C-3间形成双
键, 从而形成染料木黄酮、黄豆苷元、黄豆黄素
等异黄酮苷元。将IFS基因转入拟南芥中, 得到高
含量的染料木黄酮, 这表明IFS是异黄酮合成过程
中的限制因子(Liu等2002)。大豆中IFS包括IFS1和
IFS2, 两者高度同源, 其核苷酸同源性为92.5%, 氨
基酸同源性为96.7% (Jung等2000)。IFS1和IFS2均
具有底物亲和性, 将甘草素转化为黄豆苷元的量
超过将柚皮素转化为染料木黄酮的量 (Jung等
2000)。IFS1和IFS2基因结构分析表明每个基因在
编码区的相同位置都包含单一的内含子, 218 bp的
IFS1内含子和135 bp的IFS2内含子有46%的序列相
似性(Jung等2000)。表达分析表明在不同组织中
IFS1和IFS2的转录水平各异, IFS1主要存在于根和
种皮中, IFS2主要存在于胚和豆荚中。
IFS发现于真菌诱导子处理的大豆悬浮细胞
中, 此酶极不稳定而难于纯化。Steele等(1999)首
次在大豆中得到IFS编码基因, 随后在甘草(Glycyr-
rhiza uralensis)、绿豆(Vigna radiata)、红三叶草
(Trifolium pratense)等也得以鉴定(Jung等2000;
Akashi等1999; Overkamp等2000), 且编码这些序列
的蛋白质和大豆IFS相比, 超过95%的氨基酸是相
同的。
以前认为IFS为豆科植物特有, 现发现在一些
非豆科植物, 如甜菜(Beta vulgaris)中也存在IFS
(Steele等1999)。
2 异黄酮合成的调控
2.1 环境诱导
调控异黄酮合成的环境诱导子作为一种外界
信号, 被植物细胞膜上受体所识别并结合, 引起细
胞膜及细胞内一系列反应, 从而引起细胞核内植
物基因表达发生变化, 与异黄酮有关酶的结构及
活性发生变化, 最终导致异黄酮合成与积累。
2.1.1 细胞膜及胞内反应 在植物细胞质膜上存在
着与诱导子特异性结合位点, 当诱导子信号与其
结合后, 引起膜通透性、细胞氧化还原态和细胞
超微结构变化。
用稀土元素(REEs)处理能够调节细胞质膜的
渗透性, 进而增强细胞对营养物质的吸收、利用
和转化, 以此促进植物次生代谢物的合成(Zhao等
2000)。目前的研究认为: 细胞氧化还原态的改变
导致与次生代谢相关酶活性的改变 , 谷胱甘肽
(GSH)参与细胞氧化还原循环, 导致PAL活性增加
和相应次生代谢物合成量增加(Zhao等2005); 怀槐
悬浮细胞经茉莉酸甲酯(MeJA)处理后出现电子致
密小体(EDB), 其附近出现很多线粒体、高尔基体
和大量的核糖体, 提示MeJA可能通过增强细胞呼
吸作用, 以提供合成异黄酮所需的能量(罗建平等
2006)。
2.1.2 核内信号转导 细胞膜上及细胞内的一系列
反应使异黄酮合成途径中关键酶启动子得以活化,
由此促进核内编码关键酶的基因转录和表达, 最
终诱导异黄酮积累。这一过程需要通过Ca2+、
cGMP、激酶、NO等信息传递系统, 将诱导信号
传至细胞核内, 并被级联放大。
植物生理学报1616
2.1.2.1 钙和钙调素 异黄酮合成途径中关键酶CHS
表达的诱导需要Ca2+的参与, 因为光诱导CHS的表
达可以被细胞内Ca2+通道抑制剂硝苯吡啶(nifedip-
ine)和钌红(ruthenium)所抑制(Frohnmeyer等1998;
Christie和Jenkins 1996)。拟南芥细胞培养物经
300~330 nm波长的紫外光处理后可消除硝苯吡啶
对Ca2+通道的抑制作用, 10 ms UV-B处理致使胞质
Ca2+出现渐进、持久且不可逆转的增加, Ca2+的增
加致使随后的CHS表达量增加(Frohnmeyer等
1999)。Ca2+能激活NADPH氧化酶和产生H2O2,
H2O2使脂肪氧化酶活力增加, 而脂肪氧化酶是茉莉
酸(JA)合成的关键酶(Vidhyasekaran 2007), 提示Ca2+
可能参与JA信号转导。Ca2+依赖蛋白激酶(CDPKs)
是植物中具有Ca2+信号转换能力的特殊酶。Mune-
masa等(2011)报道了CPK6对质膜Ca2+透水通道活
性调控的必要性; 拟南芥CDPK CPK6能以Ca2+的作
用参与茉莉酸甲酯(MeJA)信号转导。稀土元素
(REEs)具有较强的配位能力和高电荷, 易与细胞质
膜结合, 并通过载体介导(生物内源载体或外加载
体)进入胞内与内膜系统上相关靶位结合, 从而在
稀土离子的跨膜过程中, 引发细胞Ca2+信号系统,
进而使信号支持的生理生化反应改变、调节细胞
的生理生化活性 , 最终影响整个生物体的生理
(Ding等2005), 包括异黄酮的合成调控。
钙调素是Ca2+的受体之一, 可能在Ca2+诱导
CHS表达的反应的信号转导中起作用。钙调素的
拮抗剂三氟啦嗪(trifluoperazine)可对紫外光诱导
的CHS表达产生强烈抑制作用, 说明钙调素在这个
反应中起着正调控作用(Frohnmeyer等1998)。
2.1.2.2 环鸟苷酸(cGMP) cGMP在光信号转导中
能诱导CHS表达。CHS启动子中的顺式元件包含
两个核转录因子结合位点: Myb-结合位点(CCTA-
AC)和G-box (CACGTG)是cGMP信号的靶点(Wu等
1996)。在防御反应中, cGMP能诱导一些防御基因
如异黄酮合成的起始酶PAL的表达 (Durner等
1998)。前人研究中只报道了能被cGMP调控的少
数几个基因, Suita等(2009)发现白光处理下, cGMP
作为第二信使能够调控大豆异黄酮合成中PAL、
C4H、4CL、CHS、CHR、CHI和IFS等多种结构基
因的表达。用cGMP的衍生物8-Br-cGMP处理后,
这些基因保持高水平的表达量10 h (Suita等2009)。
2.1.2.3 激酶 在欧芹悬浮细胞培养中发现, 光信号
传递物质是丝氨酸激酶, 可通过磷酸化作用参与
光信号转导(Harter等1994a)。欧芹悬浮细胞原生
质体经裂解后分离得到的胞质碎片保留了CHS表
达的光诱导性, 其经含有白光的红外光或紫外光
的短时间照射后, 引起18、40、48、55~70和120
kDa蛋白质磷酸化模式的快速变化, 且由于激活的
光受体不同, 磷酸化模式不同。胞质微粒体的分
离确定了这些蛋白的定位。追踪和光逆转性试验
表明, 体内光敏色素可通过修饰可溶性胞质激酶/
磷酸酶系统, 以此调控40 kDa蛋白质磷酸化(Harter
等1994a)。持续白光照射, 激酶可参与转录因子
(GBFs)活性调控, 并从胞质转移到细胞核中, 通过
磷酸化作用紧密结合到CHS启动子G-boxDNA元
件上(Harter等1994b)。
此外, 在西红柿(Lycopersicon esculentum)悬浮
细胞培养中发现, 紫外光能诱发促分裂原活化蛋
白激酶(MAPK)活性(Holley等2003)。然而其诱导
机制及与异黄酮合成途径中关键酶表达之间的关
系有待探明。
2.1.2.4 一氧化氮(NO) Klessig等(2000)通过烟草
试验, 认为植物具有一套和动物高度相似的NO介
导的防御信号机制: 依赖cGMP和不依赖cGMP两
种类型。
(1)依赖cGMP型。核细胞中cGMP参与NO信
号转导。NO处理可使植物叶片中cGMP浓度迅速
增加(Pfciffer等1994)。NO供体处理烟草(Nicotiana
tabacum)或其悬浮细胞能诱导病源相关基因(PR-
1)和异黄酮合成起始酶PAL基因的表达, 而这些基
因也能被可透过膜的cGMP类似物诱导, 且PAL基
因表达的激活作用可被cGMP抑制剂所抑制, 因而
cGMP作为第二信使参与烟草中NO信号转导途径
(Durner等1998)。NO还可以依赖cGMP诱发细胞
中另一个第二信使——环腺苷二磷酸核糖(cAD-
PR)的合成, cADPR识别并结合钙调素通道蛋白和
肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)诱发钙调素释放。研究表明
cADPR能诱导PR-1和PAL基因的表达, 其诱导作用
可被细胞内的Ca2+通道抑制剂钌红抑制(Wende-
henne等2001)。NO处理下, cADPR拮抗物8-溴
代-cADPR能够抑制PR-1活性, 在一定程度上说明
cADPR参与NO信号转导途径(Klessig等2000)。此
焦彩凤等: 高等植物中异黄酮合成代谢及其调控 1617
外, cGMP和cADPR可协同诱导PR-1和PAL基因的
表达(Durner等1998)。
(2)不依赖cGMP型。顺乌头酸酶是NO的另一
感应物。NO通过抑制顺乌头酸酶参与植物抗病反
应。NO通过抑制线粒体顺乌头酸酶活性, 减少活
性氧生成, 以此提高植物抗氧化能力(Wendehenne
等2001), 然而其分子机理尚不明确。
2.1.2.5 其他组分 Grotewold和Peterson (1994)用
Northern blot分析近亲交配系玉米经光处理后发
现, 异黄酮合成途径中CHI基因(ZmCHI1)的表达受
P蛋白(一种MYB的同源物)调控; CHI基因的转录
需要P蛋白参与。
G蛋白也是光信号转导系统中的组分。G蛋
白和蛋白磷酸化可能都与蓝光调节的基因表达有
关(Short和Briggs 1994)。虽然蓝光可能激活位于
质膜上的异三聚体G蛋白(Warpeha等1991)并使其
他膜上或细胞质内的蛋白磷酸化(Short等1994), 但
这是否最终调控异黄酮合成途径中关键基因的表
达尚不清楚。
2.2 代谢工程
通过基因工程的手段可改变次生代谢流向或扩
展乃至构建新的代谢途径, 以大量积累代谢产物。
2.2.1 加速限速反应 限速酶的过量表达可导致终
产物含量的增加是植物代谢工程最常用的策略之
一。Jung等(2003)将含有编码IFS基因片段的质粒
转导入来自大豆液体培养的胚细胞中, 使转基因
种子中异黄酮含量增加。Jung等(2000)将IFS基因
转入拟南芥中, 使异黄酮合酶在其中表达, 从而合
成异黄酮, 其中大豆苷元含量达到2 ng·mg-1 (DW)。
然而已有的研究表明, 过量表达PAL、C4H、
4CL、CHS、IFS和CHI等异黄酮合成途径中单个
关键酶, 并不一定能使异黄酮含量显著增加(Jez等
2000)。Dhaubhadel等(2007)利用Microarray技术分
析后发现, CHS8基因是激活整个类苯基丙醇通路
的关键基因 , 因而也是异黄酮积累的关键基因;
CHS8基因的过量表达, 异黄酮支路代谢水平因主
通路被激活而略有提高, 异黄酮含量随之略有增
加, 这提示在主通路以外, 异黄酮支路中可能还存
在关键基因, 两者共同的过量表达使异黄酮含量
显著提高。易金鑫等(2011)利用发根农杆菌转化
系统, 在大豆上分别过量表达CHS8、IFS2和CHS8+
IFS2, 前两者异黄酮含量较对照分别提高65.9%和
34.4%, 而后者提高82.3% (P<0.01)。由此证实大豆
异黄酮的积累由主通路中CHS8基因和支路中IFS2
基因共同决定。
2.2.2 转录调控因子策略 转录调控因子能调节多
个基因的共同表达, 因而通过引入转录调控因子
可协调控制整个代谢途径。将拟南芥的转录因子
GmMYB176转染到大豆胚中分离的原生质体中, 应
用RT-PCR监控内源CHS8的转录。结果表明, Gm-
MYB176在大豆胚原生质体中瞬时表达, 使CHS8转
录水平在48 h内增加169倍, 而GmMYB176基因沉
默将导致异黄酮水平下降, 表明GmMYB176对于
异黄酮生物合成的必要性 ; 但是过量表达Gm-
MYB176并不能增加CHS8转录和异黄酮水平, 这表
明GmMYB176调控CHS8基因可能需要另外的辅助
因子。亚细胞定位研究证实GmMYB176定位于核
中, 但其本身不具有核定位信号(Yi等2010)。14-
3-3蛋白中某一位点的缺失会改变GmMYB176的亚
细胞定位(Schoonheim等2009)。双分子荧光互补
和酵母双杂交试验也表明, GmMYB176与14-3-3蛋
白互作(Dhaubhadel和Li 2010), 因而GmMYB176的
核定位可能需要14-3-3蛋白与其pST的位点结合,
从而促进CHS8基因的表达, 提高异黄酮含量(Li等
2012)。
激活转录因子与抑制竞争性途径的共同作用
可进一步促进大豆异黄酮积累。将玉米C1和R转
录因子转入大豆中 , 苯丙烷通路PAL、C4H、
CHI、CHR、F3H和二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因
被激活, 染料木黄酮含量减少, 黄豆苷含量增加,
从而使总异黄酮含量增加。同时, 导入抑制F3H表
达的基因抑制F3H与IFS竞争底物柚皮素, 从而阻
断花青素等黄酮类物质合成(Yu等2003)。
2.2.3 改变代谢途径流向 提高植物次生代谢途径
中某一分支代谢途径中酶活性, 使其在与另外的
分支代谢途径的竞争中占据优势, 以提高目标代
谢物产量。应用反义技术和RNA干扰(RNAi, RNA
interference)技术可减少或阻塞非目标代谢物的合
成, 从而改变植物分叉代谢途径流向, 为目标产物
合成提供更加充足的合成前体。
RNAi技术已被广泛用于调控植物中苯丙烷
类次生代谢产物的合成。Jiang等(2014)根据RNAi
植物生理学报1618
技术原理构建的双价RNA干扰植物表达载体使大
豆中F3H和GmFNSII基因沉默, 并分别构建了两基
因的单价RNA干扰植物表达载体。通过发根农杆
菌ATCC15834对大豆子叶转化, 验证所构建RNA
干扰植物表达载体的效率。结果显示, 与两个单
价RNAi载体相比, RNAi载体转化生成的毛状根中
双价RNAi载体更有利于总异黄酮合成, 根中转化
总异黄酮的量是对照的2倍。
3 展望
目前, 研究者已陆续克隆出异黄酮合成途径
中关键酶的基因; 在异黄酮富集机制方面由第二
信使参与的级联过程已有初步假说。然而, 诱导
子信号传递途径中一些组分的产生仅被证实与植
物生长和抵御逆境环境有关, 其是否能进一步诱
导异黄酮合成关键酶的基因表达有待后续研究加
以确定。异黄酮组分间关系如何, 是否存在共诱
导作用和一个有次序的转导路径仍有待进一步研
究。目前的研究主要集中于CHS基因表达的调控,
其他结构基因则研究较少, 且编码关键酶的基因
中信号靶点不十分明了。对于应用代谢工程生产
次生代谢产物方面, 今后可以致力于寻找更为有
效的转录因子, 并明确其调控异黄酮合成的关键
酶的辅助因子, 深入探讨蛋白间互作在其中的作
用, 达到调控异黄酮合成的目的。因此, 有必要深
入研究异黄酮合成与调控机制, 以便有针对性地
应用相应的调控技术促进异黄酮合成, 发挥其在
动植物体内的生理作用。
参考文献
罗建平, 夏宁, 沈国栋(2006). 茉莉酸甲酯、水杨酸和一氧化氮诱导
怀槐悬浮细胞合成异黄酮及细胞结构变化. 分子细胞生物学
报, 39 (5): 438~444
易金鑫, 徐照龙, 王峻峰, 张大勇, 何晓兰, Zulfiqar A, 朱虹润, 马鸿
翔, Dhaubhadel S (2011). GmCHS8和GmIFS2基因共同决定大
豆中异黄酮的积累. 作物学报, 37 (4): 571~578
Akashi T, Aoki T, Ayabe S (1999). Cloning and functional expression
of a cytochrome P450 cDNA encoding 2-hydroxyisoflavanone
synthase involved in biosynthesis of the isoflavonoid skeleton in
licorice. Plant Physiol, 121 (3): 821~828
Ashton E, Ball M (2000). Effects of soy as tofu vs meat on lipoprotein
concentrations. Eur J Clin Nutr, 54 (1): 14~19
Calabrese JC, Jordan DB, Boodhoo A, Sariaslani S, Vannelli T (2004).
Crystal structure of phenylalanine ammonia lyase: multiple
helix dipoles implicated in catalysis. Biochemistry, 43 (36):
11403~11416
Chen Z, Gallic DR (2005). Increasing tolerance to ozone by elevating
foliar ascorbic acid confers greater protection against ozone than
increasing avoidancc. Plant Physiol, 138 (3): 1673~1689
Cho MJ, Harper JE (1991). Effect of inoculation and nitrogen on
isoflavonoid concentration in wild-type and nodulation-mutant
soybean roots. Plant Physiol, 95 (2): 435~442
Christie JM , Jenkins GI (1996). Distinct UV-B and UV-A/blue light
signal transduction pathways induce chalcone synthase gene ex-
pression in Arabidopsis cells. Plant Cell, 8 (9): 1555~1567
Dhaubhadel S (2011). Regulation of isoflavonoid biosynthesis in soy-
bean seeds. In: Ng TB (ed). Soybean—Biochemistry, Chemistry
and Physiology. Rijeka: InTech, 243~258
Dhaubhadel S, Gijzen M, Moy P, Farhangkhoee M (2007). Transcrip-
tome analysis reveals a critical role of CHS7 and CHS8 genes for
isoflavonoid synthesis in soybean seeds. Plant Physiol, 143 (1):
326~338
Dhaubhadel S, Li X (2010). A new client for 14-3-3 proteins: Gm-
MYB176, an R1 MYB transcription factor. Plant Signal Behav,
5 (7): 1~3
Ding S, Liang T, Zhang C, Yan J, Zhang Z (2005). Accumulation and
fractionation of rare earth elements (REEs) in wheat: controlled
by phosphate precipitation, cell wall absorption and solution
complexation. J Exp Bot, 56 (420): 2765~2775
Du H, Huang YB, Tang YX (2010). Genetic and metabolic engineer-
ing of isoflavonoid biosynthesis. Appl Microbiol Biotechnol, 86
(5): 1293~1312
Durner J, Wendehenne D, Klessig DF (1998). Defense gene induction
in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP and cyclic ADP-ribose.
Proc Natl Acad Sci USA, 95 (17): 10328~10333
Frohnmeyer H , Bowler C, Zhu JK, Yamagata H, Schäfer E, Chua
NH (1998). Different roles for calcium and calmodulin in phyto-
chrome and UV-regulated expression of chalcone synthase. Plant
J, 13 (6): 763~772
Frohnmeyer H, Loyall L, Blatt MR, Grabov A (1999). Millisecond
UV-B irradiation evokes prolonged elevation of cytosolic-free
Ca2+ and stimulates gene expression in transgenic parsley cell
cultures. Plant J, 20 (1): 109~118
Gensheimer M, Mushegian A (2004). Chalcone isomerase family and
fold: no longer unique to plants. Protein Sci, 13 (2): 540~544
Grotewold E, Peterson T (1994). Isolation and characterization of a
maize gene encoding chalcone flavonone. Mol Gen Genet, 242
(1): 1~8
Harter K, Frohnmeyer H, Kircher S, Kunkel T, Mühlbauer S, Schäfer
E (1994a). Light induces rapid changes of the phosphorylation
pattern in the cytosol of evacuolated parsley protoplasts. Proc
Natl Acad Sci USA, 91 (11): 5038~5048
Harter K, Kircher S, Frohnmeyer H, Krenz M, Nagy F, Schäfer E (1994b).
Light-regulated modification and nuclear translocation of cytosolic
G-box binding factors in parsley. Plant Cell, 6 (4): 545~559
Holley SR, Yalamanchili RD, Moura DS, Ryan CA, Stratmann JW
(2003). Convergence of signaling pathways induced by syste-
min, oligosaccha-ride elicitors, and ultraviolet-B radiation at
the level of mitogen-activated protein kinases in Lycopersicon
peruvianum suspension-cultured cells. Plant Physiol, 132 (4):
焦彩凤等: 高等植物中异黄酮合成代谢及其调控 1619
1728~1738
Jez JM, Bowman ME, Dixon RA, Noel JP (2000). Structure and
mechanism of the evolutionarily unique plant enzyme chalcone
isomerase. Nat Struct Biol, 7 (9): 786~791
Jez JM, Bowman ME, Noel JP (2002). Role of hydrogen bonds in the
reaction mechanism of chalcone isomerase. Biochemistry, 41
(16): 5168~5176
Jiang LY, Johnston E, Åberg KM, Nilsson U, Ilag LL (2013). Strategy
for quantifying trace levels of BMAA in cyanobacteria by LC/
MS/MS. Anal Bioanal Chem, 405 (4): 1283~1292
Jiang YN, Hu YL,Wang B, Wu TL (2014). Bivalent RNA interference
to increase isoflavone biosynthesis in soybean (Glycine max).
Braz Arch Biol Technol, 57 (2): 163~170
Jung W, Yu O, Lau SMC, OKeefe DP, Odell J, Fader G, McGonigle
B (2000). Identification and expression of isoflavone synthase,
the key enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes. Nat
Biotechnol, 18 (2): 559~559
Jung WS, Chung IM, Heo HY (2003). Manipulating isoflavone levels
in plants. J Plant Biotechnol, 5 (3): 149~155
Kim HB, Bae JH, Lim JD, Yu CY, An CS (2007). Expression of a
functional type-I chalcone isomerase gene is localized to the in-
fected cells of root nodules of Elaeagnus umbellate. Mol Cells,
23 (3): 405~409
Klessig DF, Dumer J, Noad R, Navarre DA, Wendehenne D, Kumar D,
Zhou JM, Shah J, Zhang S, Kachroo P et al (2000). Nitric oxide
and salicylic acid signaling in plant defense. Proc Natl Acad Sci
USA, 97 (16): 8849~8855
Kreuzaler F, Ragg H, Fautz E, Kuhn DN, Hahlbrock K (1983). UV
induction of chalcone synthase mRNA in cell suspension cul-
tures of Petroselinum hortense. Proc Natl Acad Sci USA, 80 (9):
2591~2593
Kurzer MS, Xu X (1997). Dietary phytoestrogens. Ann Rev Nutr, 17
(1): 353~381
Lane GA, Biggs DR, Russell GB, Sutherland ORW, Williams EM,
Maindonald JH, Donnell DJ (1985). Isoflavonoid feeding deter-
rents for Costelytra zealandica: structure-activity relationships. J
Chem Ecol, 11 (12): 1713~1735
Liu CJ, Blount JW, Steele CL, Dixon RA (2002). Bottlenecks for the
metabolic engineering of isoflavone glycoconjugates in Arabi-
dopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 99 (22): 14578~14583
Li X, Chen L, Dhaubhadel S (2012). 14-3-3 proteins regulate the
intracellular localization of the transcriptional activator Gm-
MYB176 and affect isoflavonoid synthesis in soybean. Plant J,
71 (2): 239~250
Malenčić D, Cvejić J, Tepavčević V, Bursać M, Kiprovski B, Rajković
M (2013). Changes in L-phenylalanine ammonia-lyase activity
and isoflavone phytoalexins accumulation in soybean seedlings
infected with Sclerotinia sclerotiorum. Cent Eur J Biol, 8 (9):
921~929
Marinova K, Kleinschmidt K, Weissenböck G, Klein M (2007).
Flavonoid biosynthesis in barley primary leaves requires the
presence of the vacuole and controls the activity of vacuolar fla-
vonoid transport. Plant Physiol, 144 (1): 432~444
Masilamani M, Wei J, Sampson HA (2012). Regulation of the im-
mune response by soybean isoflavones. Immunol Res, 54 (1-3):
95~110
Moffitt MC, Louie GV, Bowman ME, Pence J, Noel JP, Moore BS
(2007). Discovery of two cyanobacterial phenylalanine ammonia
lyases: kinetic and structural characterization. Biochemistry, 46
(4): 1004~1012
Munemasa S, Hossain MA, Nakamura Y, Mori IC, Murata Y (2011).
The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase, CPK6, func-
tions as a positive regulator of methyl jasmonate signaling in
guard cells. Plant Physiol, 155 (1): 553~561
Overkamp S, Hein F, Barz W (2000). Cloning and characterization of
eight cytochrome P450 cDNAs from chickpea (Cicer arietinum
L) cell suspension cultures. Plant Sci, 155 (1): 101~108
Pfeiffer S, Janistyn B, Jessner G, Pichorner H, Ebermann R (1994).
Gaseous nitric oxide stimulates guanosine-3′,5′-cyclic mono-
phosphate (cGMP) formation in spruce needles. Phytochemistry,
36: 259~262
Ralston L, Subramanian S, Matsuno M, Yu O (2005). Partial recon-
struction of flavonoid and isoflavonoid biosynthesis in yeast
using soybean type I and type II chalcone isomerases. Plant
Physiol, 137 (4): 1375~1388
Regal JF, Fraser DG, Weeks CE, Greenberg NA (2000). Dietary phy-
toestrogens have anti-inflammatory activity in a guinea pig mod-
el of asthma. Proc Soc Exp Biol Med, 223 (4): 372~378
Ren MQ, Kuhn G, Wegner J, Chen J (2001). Isoflavones, substances
with multi-biological and clinical properties. Eur J Nutr, 40 (4):
135~146
Ritter H, Schulz GE (2004). Structural basis for the entrance into the
phenylpropanoid metabolism catalyzed by phenylalanine ammo-
nia-lyase. Plant Cell, 16 (12): 3426~3436
Schoonheim PJ, Costa Pereira DD, De Boer AH (2009). Dual role for
14-3-3 proteins and ABF transcription factors in gibberellic acid
and abscisic acid signalling in barley (Hordeum vulgare) aleu-
rone cells. Plant Cell Environ, 32 (5): 439~447
Shimada N, Aoki T, Sato S, Nakamura Y, Tabata S, Ayabe S (2003). A
cluster of genes encodes the two types of chalcone isomerase in-
volved in the biosynthesis of general flavonoids and legume-spe-
cific 5-deoxy(iso)flavonoids in Lotus japonicus. Plant Physiol,
131 (3): 941~951
Short TW, Briggs WR (1994). The transduction of the blue light sig-
nals in higher plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 45
(1): 143~171
Short TW, Porst M, Palmer J, Fernbach E, Briggs WR (1994). Blue
light induces phosphorylation at seryl residues on a pea (Pisum
sativum L.) plasma membrane protein. Plant Physiol, 104 (4):
1317~1324
Steele CL, Gijzen M, Qutob D, Dixon RA (1999). Molecular charac-
terization of the enzyme catalyzing the aryl migration reaction
of isoflavonoid biosynthesis in soybean. Arch Biochem Biophys,
367 (1): 146~150
Suita K, Kiryu T, Sawada M, Mitsui M, Nakagawa M, Kanamaru K,
Yamagata H (2009). Cyclic GMP acts as a common regulator for
the transcriptional activation of the flavonoid biosynthetic path-
way in soybean. Planta, 229 (2): 403~413
植物生理学报1620
Vidhyasekaran P (2007). Fungal Pathogenesis in Plants and Crops:
Molecular Biology and Host Defense Mechanisms (2th edn).
Boca Raton: CRC Press, 510
Wang XQ (2011). Structure, function, and engineering of enzymes in
isoflavonoid biosynthesis. Funct Integr Genomics, 11 (1): 13~22
Warpeha KMF, Hamm HE, Rasenick MM, Kaufman LS (1991). A
blue light activated GTP binding protein in the plasma mem-
branes of etiolated peas. Proc Natl Acad Sci USA, 88 (20):
8925~8929
Wendehenne D, Pugin A, Klessig DE, Durner J (2001). Nitric oxide:
comparative synthesis and signalling in animal and plant cells.
Trends Plant Sci, 6 (4): 177~183
Wu Y, Hiratsuka K, Neuhaus G, Chua NH (1996). Calcium and cGMP
target distinct phytochrome-responsive elements. Plant J, 10 (6):
1149~1154
Yi J, Derynck MR, Li X, Telmer P, Marsolais F, Dhaubhadel S (2010).
A single repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regu-
lates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis
in soybean. Plant J, 62 (6): 1019~1034
Yu O, Shi J, Hession AO, Maxwell CA, McGonigle B, Odell JT (2003).
Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in
soybean seed. Phytochemistry, 63 (7): 753~763
Zhao DX, Fu CX, Han YS, Lu DP (2005). Effects of elicitation on ja-
ceosidin and hispidulin production in cell suspension cultures of
Saussurea medusa. Proc Biochem, 40 (2): 739~745
Zhao J, Zhu WH, Hu Q (2000). Promotion of indole alkaloid produc-
tion in Catharanthus roseus cell cultures by rare earth elements.
Biotechonol Lett, 22 (10): 825~828