全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (1): 63~72　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0137 63
收稿 2014-11-24　　修定 2014-12-28
资助 国家自然科学基金(30870194和J1210063)、陕西省重点实
验室科研计划(12JS103和2010JS090)和西北大学研究生创
新计划(YZZ13068)。
* 同等贡献。
* * 通讯作者(E-mail: ziqinxu@nwu.edu.cn; Tel: 029-88303484)。
拟南芥HyPRP蛋白AZI1在大肠杆菌中的表达及其抗真菌活性分析
王晓燕*, 杜改亮*, 韩瑶瑶, 刘梦欣, 马燕勤, 冯欢, 徐子勤**
西北大学生命科学学院, 陕西省生物技术重点实验室, 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室, 西安710069
摘要: AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1)基因位于拟南芥4号染色体上, 编码产物是脂质转移蛋白(lipid transfer protein,
LTP)家族的一个成员。该基因在系统获得抗性(systemic acquired resistance, SAR)中具有重要功能, 名称来自它可以被壬二
酸(azelaic acid, AzA)诱导。已有的研究结果显示, 在拟南芥中由AzA和甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate, G3P)诱导的SAR
反应需要AZI1和DIR1, 这两个脂质转移蛋白有助于G3P的积累。为了确定AZI1蛋白是否具有抗真菌活性, 本工作构建了
原核表达载体pET28a-AZI1, 利用大肠杆菌BL21 (DE3)受体细胞制备了没有信号肽的AZI1重组蛋白。Western免疫印迹分
析发现通过半乳糖苷类似物IPTG诱导表达的AZI1重组蛋白主要以包涵体的形式存在。体外抑菌实验以及激光共聚焦显
微观察结果表明, 用镍离子亲和层析树脂纯化的AZI1重组蛋白对灰霉菌、赤霉菌、棉花枯萎病菌和酿酒酵母细胞的生长/
分裂均具有抑制作用。
关键词: 拟南芥; AZI1; 蛋白纯化; 系统获得抗性; Western印迹分析; 抑真菌作用
Expression of Arabidopsis HyPRP Family Member AZI1 in Escherichia coli
and Antifungal Activity Analysis of the Recombinant Protein
WANG Xiao-Yan*, DU Gai-Liang*, HAN Yao-Yao, LIU Meng-Xin, MA Yan-Qin, FENG Huan, XU Zi-Qin**
Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Shaanxi Provincial Key Laboratory
of Biotechnology, College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China
Abstract: AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1) locates on the fourth chromosome of Arabidopsis and encodes
a member of lipid transfer protein (LTP) family. It possesses important functions in systemic acquired resistance
(SAR) and is named after the inducible expression by azelaic acid (AzA). Previous researches in Arabidopsis
showed that AZI1 and DIR1 (DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1) were involved in SAR triggered by
AzA and glycerol-3-phosphate (G3P), and the LTPs encoded by them contributed to the accumulation of G3P.
In order to determine whether AZI1 has the antifungal activity, a prokaryotic expression vector pET28a-AZI1
was constructed and the recombinant protein lacking the signal peptide was prepared using BL21 (DE3) strain
of Escherichia coli in the present work. Western blotting analysis indicated that the recombinant AZI1 produced
in E. coli cells after induction with IPTG, an analogue of galactoside, mainly existed as inclusion bodies. Anti-
microbial tests in vitro and observation under the laser confocal microscopy confirmed that the recombinant
AZI1 purified with immobilized nickel-ion affinity chromatography resin could inhibit the growth or division of
Botrytis cinerea, Gibberella fujikuroi, Fusarium oxysporum, and Saccharomyces cerevisiae.
Key words: Arabidopsis thaliana; AZI1; protein purification; systemic acquired resistance (SAR); Western
blotting analysis; fungistasis
AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1)基因属于
HyPRP (hybrid proline-rich protein)家族, 编码产物
由氨基末端的信号肽、中间位置的富脯氨酸结构
域(proline-rich domain, PRD)和羧基末端的八半胱
氨酸基序(eight-cysteine-motif, 8CM)构成。N端的
信号肽能够使AZI1蛋白通过分泌途径合成并定位
到细胞表面, 亲水性PRD与其他细胞壁结构蛋白有
高度的相似性, 疏水性8CM的存在说明该蛋白与细
胞膜有着密切的联系(Zhang和Schläppi 2007)。
HyPRP广泛存在于高等植物中, 是富脯氨酸蛋白
(proline-rich protein, PRP)的一个亚类。PRP是五类
细胞壁结构蛋白中的一类, 它们在植物生长和发育
植物生理学报64
过程中决定特殊的细胞壁结构, 在植物受到生物和
非生物胁迫时起防卫功能(Minorsky 2002)。拟南
芥(Arabidopsis thaliana)基因组中包含28个HyPRP
基因, 它们分布在1号至5号染色体上, 可以被激素
和环境胁迫诱导(Dvořáková等2007; Josè-Estanyol和
Puigdomènech 2000)。AZI1和HyPRP家族的其他三
个成员EARLI1 (AT4G12480)、AT4G12490、
AT4G12500串联排列在拟南芥的4号染色体上, 被
归类为EARLI1亚家族。系统进化分析结果显示,
在EARLI1亚家族中AZI1和EARLI1更为接近。
AZI1基因编码一个16.76 kDa的分泌性蛋白,
N端信号肽裂解后产生一个由PRD和8CM构成、
大小为14.09 kDa的蛋白质。由于8CM的存在, 也
将AZI1归类于脂质转移蛋白(lipid transfer protein,
LTP)/蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)/种子贮藏蛋
白(seed storage protein)家族。LTP是一类非常重要
的脂类结合蛋白, 广泛存在于植物、动物和微生
物中, 占细胞内可溶性总蛋白的4%。从许多植物
的不同组织中分离得到的LTP对脂类分子的亲和
作用没有选择性, 所以也被称为非特异性脂质转
移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTP)
(Kader 1996)。早期的研究根据分子量大小将植物
LTP蛋白分为LTP1和 LTP2两大类。LTP1主要存在
于植物地上部分的组织和器官中, 分子量约为10
kDa; LTP2主要存在于植物根部 , 分子量约为7
kDa。X射线晶体衍射与核磁共振(nuclear magnet-
ic resonance, NMR)实验结果显示, LTP1和 LTP2的
球形结构内部具有一个疏水腔, 负责结合脂类物
质(Lee等1998; Shin等1995)。后来发现, 有几种花
药特异性蛋白与植物nsLTP表现一定的同源性, 被
建议作为第三类植物LTP (Lauga等2000)。近年来,
又从拟南芥和水稻(Oryza sativa)基因组中鉴定出
了6种新型的nsLTP, 所以迄今共发现9种类型的
nsLTP。拟南芥没有VII型nsLTP, 而IX型nsLTP只
存在于拟南芥中(Boutrot等2008)。植物nsLTP具有
多种功能, 它们参与了蜡质的合成与运输过程, 能
够促进细胞壁的扩展或者松弛, 具有蛋白酶抑制
剂活性, 可以防止细胞融合, 在体细胞胚胎发生以
及抗逆和抗病反应中起重要作用。
在自然进化过程中, 植物形成了一系列针对活
体营养型(biotrophy)和坏死型(necrotrophy)病原体
的防御机制。在与活体营养型病菌相互作用中, 很
多植物能够通过“基因对基因”模式产生超敏反应,
达到抑制病原菌侵染的效果, 进而引发系统获得抗
性(systemic acquired resistance, SAR)。活体营养型
病菌侵染植物后引发的SAR构成了一个复杂的信
号转导网络(Hammond-Kosack和Parker 2003)。与
此不同, 植物对坏死型病菌的抗性主要是通过茉莉
酸/乙烯(jasmonic acid/ethylene, JA/ET)和水杨酸
(salicylic acid, SA)途径来调控的(Zhang等2013)。
拟南芥azi1 T-DNA插入突变体SALK_017709和
SALK_085727在丁香假单胞杆菌侵染后不能产生
系统获得抗性 , 但局部抗性不受影响 ( Jung等
2009)。与Col-0野生型植株相似, azi1突变体植株在
病原菌侵染位点可以积累SA, 表达PR1 (PATHO-
GENESIS-RELATED 1)基因。将壬二酸(azelaic acid,
AzA)或者收集的引发了SAR的Col-0野生型拟南芥
的叶柄渗出液渗入到azi1突变体中, 突变体可以对
有毒病原体PmaDG3 (Pseudomonas syringae pv.
maculicola DG3)产生系统抗性。这一结果说明,
AzA有可能是SAR反应中的一个长距离移动信号,
它可以使未受无毒菌侵染的其他组织积累SA, 通
过SA信号途径引发相关抗性基因的表达。
壬二酸能够诱导AZI1基因表达, 产生的AZI1
蛋白与SAR信号转移有关。Yu等(2013)发现在拟
南芥中由AzA和甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate,
G3P)诱导的SAR需要脂质转移蛋白AZI1和DIRI,
它们有助于G3P的积累。张欣等(2011)发现转AZI1
酵母细胞在SC-URA平板上的生长能力明显低于
转pESC-URA空载体的对照组酵母细胞, 在拟南芥
中过表达AZI1基因可以提高个体对蒜薹灰霉菌的
抗性。以上研究报道显示, AZI1在拟南芥对生物胁
迫的抗性反应中具有重要功能。由于AZI1具有潜
在的蛋白酶抑制剂活性, 推测它对真菌细胞可能具
有直接的破坏作用。本工作建立了AZI1蛋白的原
核表达体系, 利用纯化的不含信号肽的重组蛋白分
析了AZI1对真菌细胞生长和分裂的抑制作用。
材料与方法
1 试验材料
植物材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)
Heynh Col-0 (Columbia-0)生态型植株。基因克隆
王晓燕等: 拟南芥HyPRP蛋白AZI1在大肠杆菌中的表达及其抗真菌活性分析 65
实验的受体细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)
DH5α菌株。原核表达体系的受体细胞为大肠杆菌
BL21 (DE3)菌株, 购自北京康为世纪生物公司; 载
体为pET28a。体外抑菌实验采用蒜薹灰霉菌
(Botrytis cinerea Pers. ex Fr. of Garlic Sprout)、赤霉
菌(Gibberella fujikuroi)、棉花枯萎病菌(Fusarium
oxysporum f. sp. Vasinfectum)和携带pESC-URA空载
体的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W303-1A
MATa菌株(leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1;
ade2-1; his3-11,15)。
2 试验方法
2.1 原核表达载体的构建
根据AZI1基因的PRD-8CM编码序列设计上
下游引物, 上游引物为5′-CGCGGATCCGAAT-
TCACAAATTGCAACTGCAAGCC-3′ (直线表示
BamHI酶切位点, 虚线表示EcoRI酶切位点), 下游
引物为5′ -CGCCTCGAGTCAAGCACATTG-
GAAACCAG-3′ (直线表示XhoI酶切位点)。以拟
南芥Col-0基因组DNA为模板, 使用高保真DNA聚
合酶Pfu扩增不含信号肽编码区的AZI1基因。PCR
反应步骤包括: 94 ℃预变性10 min; 94 ℃变性1
min, 60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 30个循环;
72 ℃延伸10 min。对回收后的PCR产物和pET28a
进行EcoRI和XhoI双酶切, 然后用T4 DNA 连接酶
连接目的片段与载体大片段。连接反应的条件为
4 ℃、12 h。用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受
态细胞,挑取单菌落进行菌落PCR和双酶切鉴定,
将阳性克隆送上海生工生物技术公司测序。
2.2 AZI1重组蛋白的诱导表达
挑取pET-28a和pET28a-AZI1转化的BL21
(DE3)抗性克隆, 接种到含有50 mg·L-1卡那霉素的
液体LB培养基中, 于37 ℃过夜培养。第2天将菌液
转接到新培养基中进行大体积繁殖, 继续培养至
OD600=0.6~0.8。将1 mL对照和1~6 h采集的菌液在
13 570×g离心1 min收集菌体, 用40 µL 1×SDS上样
缓冲液重悬沉淀, 放入沸水浴中煮8 min。13 570×g
离心10 min后取20 µL上清液上样, 用15% SDS-聚
丙烯酰胺凝胶进行电泳分离(Li等2012)。
2.3 AZI1重组蛋白的Western免疫印迹分析
挑取含有pET-28a或pET28a-AZI1质粒的BL21
(DE3)细菌克隆, 在附加50 mg·L-1卡那霉素的液体
LB培养基中于37 ℃培养至OD600=0.6, 加入IPTG
(终浓度1 mmol·L-1)在28 ℃诱导8 h。13 570×g、
4 ℃离心10 min收集菌体, 加入1/10体积的超声裂
解缓冲液(50 mmol·L-1 Tris-HCl, 50 mmol·L-1 NaCl,
pH 8.0), 于冰上超声处理40次(每次超声10 s, 间隔
5 s)。13 570×g、4 ℃离心15 min, 收集的上清液记
为A液。向沉淀中加入适量体积的包涵体洗涤液
(50 mmol·L-1 Tris-HCl, 50 mmol·L-1 NaCl, 1% Tri-
tonX-100, pH 8.0), 重悬沉淀进行超声处理。再次
离心后向获得的沉淀中加入适量的包涵体溶解液
(20 mmol·L-1 Tris-HCl, 50 mmol·L-1 NaCl, 8 mol·L-1
尿素, pH 8.0), 4 ℃过夜溶解, 离心收集的上清液记
为B液。向A液和B液中加入100 μL 2×SDS-PAGE上
样缓冲液, 沸水浴中煮10 min, 离心后取20 μL上样。
电泳结束后采用半干电转移装置将凝胶中的蛋白
质转移到PVDF膜上。将PVDF膜取出置于含有5%
脱脂奶粉的1×TBS缓冲液中, 在室温下封闭3 h后加
入兔抗His-tag多克隆抗体(Abcam, 1:1 000), 室温孵
育2 h后于4 ℃过夜。第2天用TBS-T (1×TBS+0.05%
Tween-20)洗涤3次, 每次10 min。再加入带有碱性磷
酸酶(AP)标记的羊抗兔免疫球蛋白G (康为世纪,
1:2 000), 室温孵育1 h后用TBS-T洗涤3次, 每次10
min。最后用NBT/BCIP作为底物进行显色。
2.4 AZI1重组蛋白的纯化
携带pET28a-AZI1的BL21 (DE3)大肠杆菌细
胞经IPTG诱导后, 收集菌体进行超声裂解。对包
涵体沉淀进行洗涤和溶解处理, 经13 570×g、4 ℃
离心15 min后将上清液转移到透析袋中, 用含有
6、4、2 mol·L-1尿素和不含尿素的缓冲液(20
mmol·L-1 Tris-HCl, 50 mmol·L-1 NaCl)进行梯度透
析。用0.45 μm滤膜过滤透析后的上清液, 缓慢上
样到镍离子螯合层析柱上进行纯化。平衡缓冲液
含50 mmol·L-1 NaH2PO4, 300 mmol·L
-1 NaCl, pH 8.0;
洗涤缓冲液含50 mmol·L-1 NaH2PO4, 300 mmol·L
-1
NaCl, 20 mmol·L-1咪唑, pH 8.0; 洗脱缓冲液含50
mmol·L-1 NaH2PO4, 300 mmol·L
-1 NaCl, 250
mmol·L-1咪唑, pH 8.0。将含有重组蛋白的洗脱液
分阶段收集到2 mL离心管中, 进行冷冻干燥, 再用
1×PBS溶解后进行15% SDS-PAGE凝胶电泳。
2.5 AZI1蛋白对真菌生长的抑制作用
在分析AZI1蛋白对灰霉菌、赤霉菌和棉花枯
植物生理学报66
萎病菌等真菌的抗性时, 首先在马铃薯培养基(po-
tato dextrose agar, PDA)上对保存的蒜薹灰霉菌等
真菌进行划线后在28 ℃培养4 d。用无菌水悬浮孢
子, 并用玻璃棉过滤除去菌丝, 再用1/4马铃薯培养
基将悬浮液稀释成5×104个(孢子)·mL-1。取孢子悬
浮液与纯化的AZI1蛋白混合, AZI1蛋白终浓度为
100、200和300 μg·mL-1, 对照组为不含AZI1重组蛋
白的孢子悬浮液或含BSA (100 μg·mL-1)的孢子悬
浮液,并用马铃薯培养基将各处理的孢子终浓度调
整一致。向小圆形培养皿中倒入15 mL PDA培养
基, 凝固后将3片经高压灭菌的直径为0.6 cm的滤
纸片放于培养基表面, 将20 μL AZI1重组蛋白与灰
霉菌等真菌孢子混合液滴加到滤纸片上, 在28 ℃
倒置培养72 h, 观察灰霉菌等真菌的孢子萌发和菌
丝生长状况。该实验重复3次, 并对灰霉菌等真菌
孢子萌发后菌斑的直径进行统计学分析。在分析
外施AZI1蛋白对赤霉菌等真菌侵染拟南芥叶片的
影响时, 取孢子悬浮液与纯化的AZI1蛋白混合,
AZI1蛋白终浓度为100、200和300 μg·mL-1, 对照组
为含有100 μg·mL-1 BSA的孢子悬浮液。将20 μL
AZI1重组蛋白与真菌孢子混合液滴加到野生型拟
南芥叶片上, 4 d后观察侵染效果。
2.6 AZI1蛋白对酵母细胞生长的抑制作用
在分析AZI1蛋白对酿酒酵母细胞的抑制作用
时, 将冻存于–80 ℃的携带pESC-URA空载体的酿
酒酵母W303-1A MATa菌株接种于SC-URA固体培
养基上, 28 ℃培养3 d后从平板上挑取单克隆接种
于5 mL SC-URA液体培养基培养10 h。将2 μL酵
母菌液稀释10、100和1 000倍, 取4 μL不同稀释倍
数的酵母菌液, 与6 μL浓度为200 μg·mL-1的AZI1蛋
白混合(AZI1重组蛋白终浓度为120 ng·μL-1), 对照
为4 μL菌液加6 μL dH2O。将混合液滴加到SC-
URA培养基上, 吸收后置于28 ℃倒置培养, 分别在
24 与72 h后观察酵母菌的生长状况。
2.7 酵母细胞膜通透性分析
细胞膜通透性分析采用SYTOX green荧光染
色法(Chen和Xu 2011)。挑取携带pESC-URA空载
体的酿酒酵母W303-1A MATa单克隆, 接种于5 mL
SC-URA液体培养基中, 在28 ℃、180 r·min-1条件
下振荡培养10 h。在1 mL酵母菌液中加入1 000 U
制霉菌素(阳性对照)、150 μg·mL-1 BSA (阴性对
照)或终浓度为200 μg·mL-1的AZI1重组蛋白, 在
28 ℃培养4 h。各取100 μL菌液于1.5 mL无菌离心
管中, 加入SYTOX green荧光染料(终浓度为0.2
μmol·mL-1), 在28 ℃培养箱中孵育30 min, 期间混匀
数次。将30 μL菌液滴加到载玻片中间, 封片后用
OLYMPUS激光共聚焦显微镜进行观察。激发光波
长450~490 nm, 发射光波长500 nm。统计具有荧光
信号的细胞数和明视野下的细胞总数, 采用t-检验
方法进行显著性差异分析。
实验结果
1 AZI1重组蛋白的Western blotting分析
经IPTG诱导后, 对携带pET28a-AZI1和pE-
T28a质粒的BL21 (DE3)大肠杆菌细胞进行超声处
理, 收集可溶性组分和尿素溶解后的包涵体组分,
各上样20 μL进行Western blotting分析。从图1可
以看出, 包含pET28a的BL21 (DE3)大肠杆菌细胞
的可溶性组分和包涵体组分中都不存在AZI1蛋白,
携带pET28a-AZI1的BL21 (DE3)大肠杆菌细胞中
表达的AZI1重组蛋白以不溶性的包涵体形式存在,
大小约为15 kDa, 与预期结果一致。这说明利用
BL21 (DE3)表达的AZI1重组蛋白以包涵体的形式
存在于细胞中(Li等2012)。
图1 AZI1重组蛋白在大肠杆菌细胞中表达的可溶性分析
Fig.1 Soluble analysis of recombinant AZI1 expressed in E. coli
1: PageRulerTM Prestained Protein Ladder RDM604; 2: pE-
T28a-AZI1转化大肠杆菌经IPTG诱导后的包涵体组分; 3: pE-
T28a-AZI1转化大肠杆菌在IPTG诱导后的可溶性组分; 4: pET28a
转化大肠杆菌经IPTG诱导后的包涵体组分; 5: pET28a转化大肠杆
菌在IPTG诱导后的可溶性组分。
王晓燕等: 拟南芥HyPRP蛋白AZI1在大肠杆菌中的表达及其抗真菌活性分析 67
2 AZI1重组蛋白的纯化
携带pET28a-AZI1的大肠杆菌细胞经IPTG诱
导后, 收集菌体进行超声裂解。用尿素对分离的
包涵体进行溶解, 用镍离子亲和层析柱纯化AZI1
重组蛋白, 然后进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电
泳分析。结果显示, 采用镍离子亲和层析柱可以
得到高纯度的AZI1重组蛋白(图2-A)。进一步采用
冻干法对洗脱的AZI1重组蛋白溶液进行了浓缩处
理, 从电泳图中可以清楚地观察到大约15 kDa的蛋
白质条带(图2-B)。采用六组氨酸标签抗体对浓缩
之后的AZI1重组蛋白进行了Western免疫印迹分
析, 结果显示除了AZI1单体, 还存在少量的二聚体
(图2-C)。SDS-PAGE和Western印迹分析结果显示
由于8CM的存在, 不含信号肽的AZI1重组蛋白可
图2 AZI1重组蛋白的纯化和鉴定
Fig.2 Purification and identification of recombinant AZI1
A: AZI1重组蛋白的纯化, 其中1: 第一次洗脱液; 2: Unstained Protein Molecular Weight Marker SM0431 (Fermentas China, Shenzhen), 分
子量从大到小依次为116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4和14.4 kDa; 3~8: 第二至第七次洗脱液; 箭头所指为AZI1重组蛋白。B: 浓缩的
AZI1重组蛋白, 其中1: 浓缩后的AZI1重组蛋白; 2: Unstained Protein Molecular Weight Marker SM0431; 箭头所指为AZI1重组蛋白。C, 纯
化AZI1重组蛋白的Western免疫印迹分析; 1: PageRulerTM Prestained Protein Ladder RDM604; 2: 纯化后的AZI1重组蛋白; 箭头所指为AZI1
重组蛋白二聚体。
能会形成空间结构十分复杂的聚合体。
3 AZI1重组蛋白对真菌生长的抑制作用
抑菌实验结果表明, AZI1蛋白对真菌生长具
有一定的抑制作用。不用AZI1重组蛋白处理时,
72 h后可以看到灰霉菌孢子在培养基上能够有效
萌发并生长形成菌丝。用终浓度为100或200
μg·mL-1的AZI1重组蛋白处理时, 灰霉菌孢子的萌
发能力明显下降(图3-A), 说明AZI1重组蛋白对灰
霉菌的生长具有抑制作用。当用终浓度为300
μg·mL-1的AZI1重组蛋白处理赤霉菌(图3-B)和棉
花枯萎病菌(图3-C)时, 孢子几乎不能萌发。通过3
次独立重复实验, 从图3-D可以看到不加AZI1重组
蛋白时, 灰霉菌等真菌孢子萌发形成的菌斑直径
最大, 随着AZI1重组蛋白浓度的升高, 真菌孢子萌
发形成的菌斑直径变小 , 当加入终浓度为300
μg·mL-1的AZI1重组蛋白时, 真菌孢子几乎不萌
发。在拟南芥叶片上滴加AZI1重组蛋白和真菌孢
子混合液, 随着AZI1重组蛋白浓度的增高, 拟南芥
叶片损伤程度逐渐减轻(图4)。当AZI1重组蛋白的
浓度达到300 μg·mL-1时, 在叶片上可看到侵染位
点, 但叶片其它部分仍然保持绿色。说明AZI1重
组蛋白能够抑制真菌孢子的萌发, 并且能够增强
拟南芥叶片对病原体的抗性。在与真菌相互作用
中, AZI1蛋白有可能插入到真菌细胞的细胞膜中,
通过引起细胞膜穿孔、导致细胞破裂、使细胞内
部离子流出来抑制真菌孢子的萌发, 降低菌丝的
生长能力(郑灿伟和宾金华2008)。张欣等(2011)发
现与野生型植株相比, AZI1基因过表达植株对灰霉
菌具有明显的抗性, 本工作得到的结果进一步说
明在大肠杆菌中表达的AZI1重组蛋白对灰霉菌等
真菌病原体的生长也具有抑制作用。
4 AZI1重组蛋白对酵母细胞生长的抑制作用
张欣等(2011)将AZI1基因导入酿酒酵母, 发现
细胞内表达的AZI1蛋白也会降低细胞的生长速
度。本工作用AZI1重组蛋白处理酵母细胞, 发现
它同样能够抑制酵母细胞的生长。稀释10倍的酿
植物生理学报68
酒酵母细胞在SC-UAR培养基上生长72 h以后,
AZI1处理组与对照组的生长速度虽有所不同, 但
差异不是十分明显。将稀释100或1 000倍的酵母
细胞与AZI1重组蛋白混合, 在固体培养基上培养
24和72 h后可以清楚地看到AZI1能够降低酵母细
胞的分裂和生长速度(图5)。
5 AZI1重组蛋白对酵母细胞质膜通透性的影响
采用SYTOX green荧光染料对酵母细胞进行
染色, 发现AZI1处理能够增加细胞膜的通透性。激
光共聚焦显微观察结果显示, 用AZI1重组蛋白处理
后能够吸收SYTOX green的死细胞数量明显增加
(图6-A~F)。本实验以制霉菌素为阳性对照, 以牛
血清白蛋白BSA为阴性对照。制霉菌素能够与真
菌细胞膜上的甾醇结合, 通过改变细胞膜的通透性
使细胞内容物泄漏, 导致真菌细胞死亡。对不同处
理后酵母细胞的死亡率进行统计, 结果显示AZI1重
组蛋白对酵母细胞有一定的抑制作用, 死亡细胞数
量介于制霉菌素处理和BSA处理之间(图6-G)。
讨　　论
本实验利用高保真耐热DNA聚合酶Pfu从拟
南芥Col-0生态型基因组DNA扩增产生不含信号肽
图3 AZI1重组蛋白对灰霉菌、赤霉菌和棉花枯萎病菌的抑制作用
Fig.3 Antifungal activity of recombinant AZI1 against Botrytis cinerea, Gibberella fujikuroi and Fusarium oxysporum
A~C: 孢子萌发情况, 其中A: 灰霉菌孢子; B: 赤霉菌孢子; C: 棉花枯萎病菌孢子; 各图中1: 不含AZI1重组蛋白(对照); 2: 100 μg·mL-1
AZI1重组蛋白; 3: 200 μg·mL-1 AZI1重组蛋白; 4: 300 μg·mL-1 AZI1重组蛋白。D: 菌斑直径的统计学分析。
王晓燕等: 拟南芥HyPRP蛋白AZI1在大肠杆菌中的表达及其抗真菌活性分析 69
编码序列的AZI1基因 , 经限制性内切酶XhoI和
EcoRI对目的基因片段和pET28a载体进行双酶切
后, 采用T4 DNA连接酶构建得到原核表达载体,
并通过菌落PCR、双酶切方法对转化大肠杆菌
图4 AZI1重组蛋白对拟南芥真菌抗性的促进效果
Fig.4 Promotion of recombinant AZI1 to fungal resistance of
Arabidopsis thaliana
A: 赤霉菌孢子; B: 棉花枯萎病菌孢子。各图中1: 100 μg·mL-1
BSA; 2: 100 μg·mL-1 AZI1重组蛋白; 3: 200 μg·mL-1 AZI1重组蛋白;
4: 300 μg·mL-1 AZI1重组蛋白。
图5 AZI1重组蛋白对酿酒酵母生长的抑制作用
Fig.5 Inhibitory effect of recombinant AZI1 to the growth of
Saccharomyces cerevisiae
A: 24 h后的生长状况; B: 72 h后的生长状况。各图中1: 稀释
10倍的酵母细胞; 2: 稀释100倍的酵母细胞; 3: 稀释1 000倍的酵母
细胞。AZI1重组蛋白浓度为120 ng·μL-1。
图6 AZI1重组蛋白对酵母细胞膜通透性的影响
Fig.6 Influence of recombinant AZI1 on membrane permeability
of yeast cells
A~F为细胞膜通透性观察, 其中A和B: 1 000 U制霉菌素; C和
D: 200 μg·mL-1 AZI1重组蛋白; E和F: 150 μg·mL-1 BSA。A、C、E,
SYTOX green荧光; B、D、F, 明视野; B、D、F的菌液浓度相同。
G: 酵母细胞死亡率的统计学分析, 其中1: 1 000 U制菌霉素处理; 2:
200 μg·mL-1 AZI1重组蛋白处理; 3: 150 μg·mL-1 BSA处理。
DH5α感受态细胞以后形成的抗性克隆进行了鉴
定。测序结果表明, 克隆的AZI1基因序列与Gen-
Bank数据库中登录的序列完全一致。进一步将测
序结果正确的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)
植物生理学报70
表达菌株, 通过IPTG诱导表达了AZI1重组蛋白。
IPTG诱导结果显示, 利用BL21 (DE3)大肠杆
菌表达的AZI1重组蛋白以包涵体的形式存在于细
胞中, 需要用含有尿素的裂解缓冲液进行处理才
能溶解。包涵体的形成与多种因素有关。较高的
温度容易使蛋白质变性和聚集。表达水平较高时
重组蛋白会形成错配的二硫键, 不能正确折叠, 进
而通过非特异性结合聚集到一起。大肠杆菌细胞
不能对真核蛋白进行糖基化, 由于溶解度降低, 很
容易形成不溶性的包涵体。氨基酸组成也会影响
重组蛋白的溶解度, 含硫氨基酸越多越容易形成
包涵体。重组蛋白折叠时形成的中间体发生聚合
是包涵体形成的主要原因, pH可以影响处于部分
变性状态的中间体的稳定性, pH越接近等电点蛋
白质越容易聚集。培养条件欠佳时, 也会产生包
涵体(罗莉等2012)。包涵体的形成也有有利的方
面, 目的蛋白与包涵体中含量很低的杂蛋白只需
要简单的低速离心就能够被分离纯化, 表达水平
也会比较高(麻晓庆等2007)。包涵体形式的重组
蛋白需要用含有尿素、盐酸胍或SDS等解离剂的
裂解缓冲液进行处理才能溶解。尿素与蛋白质的
氢键相互作用可以破坏蛋白质的高级结构。但在
包涵体溶解过程中尿素容易析出, 因此作用时间
不能太长; 温度也不应太高, 以避免对蛋白质进行
共价修饰(顾玮彦等2006) 。
以包涵体形式存在的重组蛋白, 往往不具有
生物学活性(Cardamone等 1995)。本工作对尿素
溶解后的重组蛋白进行梯度洗脱, 用镍离子亲和
层析柱纯化得到了具有生物活性的AZI1重组蛋
白。进一步通过冻干法对AZI1重组蛋白进行浓缩
处理, 并用于抗性分析。抑菌实验结果表明, AZI1
重组蛋白能够抑制灰霉菌、赤霉菌和棉花枯萎病
菌的孢子萌发和菌丝生长过程。在长势良好的
Col-0野生型拟南芥叶片上滴加AZI1重组蛋白和赤
霉菌、棉花枯萎病菌孢子混合液, 在培养箱中黑
暗处理4 d后, 可观察到该蛋白能够明显增加拟南
芥对真菌病原体的抗性。在对照处理中(含100
μg·mL-1 BSA的孢子悬浮液), 拟南芥叶片的损伤程
度极为严重, 呈湿腐状。随着AZI1重组蛋白浓度
的上升 , 拟南芥叶片对真菌侵染的抗性逐渐增
强。当AZI1蛋白的浓度达到300 μg·mL-1时, 叶片
的颜色几乎保持鲜绿色, 可观察到对真菌病原体
有明显的抗性。由此说明纯化得到AZI1重组蛋白
具有生物活性, 能够抑制真菌孢子的萌发。
AZI1重组蛋白也能够抑制酿酒酵母细胞的生
长。AZI1重组蛋白(120 ng·μL-1)对稀释10倍的酵
母细胞的抑制效果和对照处理相似, 没有多大的
差异。但是当酵母细胞的稀释倍数达到100和
1 000时, AZI1重组蛋白对酵母细胞生长的抑制作
用十分明显。进一步采用SYTOX green荧光染料
对酵母细胞进行染色, 发现AZI1处理能够增加酵
母细胞膜的通透性。对不同处理后酵母细胞的死
亡率进行统计分析发现, AZI1处理后酵母细胞的死
亡率介于制霉菌素处理和BSA处理之间。AZI1、
EARLI1、AT4G12490和AT4G12500同属于EAR-
LI1亚家族, 氨基酸序列比对及系统进化分析结果
显示AZI1和EARLI1是高度相似的横向(种内)同源
基因, 而AT4G12490与AT4G12500的关系更为密切
(Zhang和Schläppi 2007)。EARLI1亚家族成员都具
有信号肽, 它们具有亲水性的PRD结构域和疏水性
的8CM结构域, 前者可能与细胞壁结合且位于细
胞外表面, 后者可能与细胞膜结合。Li等(2012)的
研究结果表明EARLI1重组蛋白能够通过增加细胞
膜的通透性抑制酵母细胞生长。Chassot等(2007)
发现组成性表达AZI1、EARLI1和AT4G12500可以
显著提高拟南芥对葡萄灰霉菌的抗性 , 其中以
AZI1过表达个体的抗性最强。这些研究报道与本
工作得到的结果一致。
已有的研究结果显示, LTP家族中的其他成
员LtpV.2、LtpV.3、XYP1和XYP2也具有防御功
能, 其中XYP1在灰霉菌侵染早期发挥功能, 灰霉
菌侵染25 h后这四个基因的表达会下调(Boutrot
等2008; Windram等2012)。另外, 迄今已经发现了
许多与植物对灰霉菌抗性相关的转录因子, 其中
ERF家族和WRKY家族成员与植物防卫反应的关
系最为密切(Jalali等2006), 并且已经证明有部分
转录因子直接参与了植物对灰霉菌侵染的响应过
程(Thomma等1998, 1999; Audenaert等2002; Pand-
ey等2005)。病原菌侵染高等植物后通常会诱导病
程相关(pathogenesis-related, PR)蛋白的表达, 这些
蛋白质可以抑制病原菌的生长和蔓延, 并激发产
生SAR。目前已经确定了14种类型的病程相关蛋
王晓燕等: 拟南芥HyPRP蛋白AZI1在大肠杆菌中的表达及其抗真菌活性分析 71
白, 其中包括LTP。大多数从植物中分离纯化的
LTP具有抗菌功能, 其机制与多种信号转导途径构
成的复杂网络有关。LTP参与激发子触发植物细
胞过敏性反应的信号转导过程, 它们能够通过与
JA、几丁质酶等互作从而促进长距离信号的传
递。另外, LTP与钙调素结合蛋白具有相同的钙调
素结合活性, Ca2+/CaM信号系统可能参与植物转
脂蛋白功能的调节(范芸等2011)。
LTP在抗菌信号转导中的功能还包括它参与
了SAR反应。拟南芥至少编码70个LTP蛋白, 其中
DIR1和DIR1-like已被发现在拟南芥SAR中参与长
距离信号的转移(Champigny等2013)。AZI1蛋白
具有8CM结构域, 也属于LTP家族。过表达AZI1和
DIR1的拟南芥植株可以产生SAR, 但系统叶片中
SA和SAG (水杨酸-2-O-β-葡萄苷)的含量并没有上
升。AZI1过表达个体与dir1突变体的杂交后代以
及DIR1过表达个体与azi1突变体的杂交后代都可
以产生SAR, 并且G3P的含量比它们相应的突变体
要高。进一步研究发现向azi1突变体注射G3P以后
可以在一定程度上使SAR得到恢复, DIR1蛋白的
表达量也有所增加, 说明DIR1蛋白可能在SAR中
起重要作用, 也说明G3P诱导的SAR需要DIR1和
AZI1共同发挥功能(Yu等2013)。在拟南芥中, AZI1
能够通过增加角质的合成来抵抗灰霉菌的侵染
(Chassot等2007)。AZI1也可能通过影响木质素的
合成提高拟南芥对丁香假单胞杆菌Psm ES4326的
抗性(高航等2013)。已有的研究结果表明, AZI1与
DIR1形成的多聚复合体与SAR信号的传递有关。
拟南芥dir1-1突变体(defective in induced resistance
1-1)不能产生SAR, PR基因在系统叶片中也不表达
(Maldonado等2002)。将dir1-1的叶柄渗出液接种
到叶片上, 不会产生或转移SAR所需的信号分子。
拟南芥DIR1在烟草SAR中也具有活性, 它编码的
脂质转移蛋白能够结合脂类衍生物, 形成的复合
体在SAR中起长距离信号的作用(Liu等2011)。本
工作发现在大肠杆菌中表达的AZI1重组蛋白能够
抑制灰霉菌和酵母菌等真菌的生长。通过激光共
聚焦观察到AZI1重组蛋白能够增加酵母细胞质膜
的通透性, 说明AZI1可能通过破坏细胞膜结构来
抑制真菌细胞的生长。
参考文献
范芸, 周晓燕, 王幼平(2011). 脂质转移蛋白在植物抗病中的作用.
分子植物育种, 9: 1245~1252
高航, 杜改亮, 麻力, 徐子勤(2013). 拟南芥抵抗丁香假单胞杆菌过
程中AZI1基因功能研究. 西北植物学报, 33: 429~436
顾玮彦, 黄磊, 徐志南, 岑沛霖(2006). 利用his-tag纯化和复性基因
工程产物肠激酶. 食品与生物技术学报, 25: 18~25
罗莉, 李坤, 王保成, 王明蓉(2012). 包涵体变复性技术研究进展. 中
国医药生物技术, 7: 290~293
麻晓庆, 王继红, 韩晓曦, 褚丹, 张丕桥, 李庆伟(2007). 基因重组蛋
白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化. 吉林医药学院
学报, 28: 1~3
张欣, 徐之艳, Schläppi M, 徐子勤(2011). 拟南芥AZI1基因对酿酒
酵母细胞生长和蒜薹灰霉菌侵染的抑制作用. 植物生理学报,
47: 57~62
郑灿伟, 宾金华(2008). 植物抗真菌蛋白的抗菌机制. 植物生理学通
讯, 44: 989~996
Audenaert K, De Meyer GB, Höfte MM (2002). Abscisic acid de-
termines basal susceptibility of tomato to Botrytis cinerea and
suppresses salicylic acid-dependent signaling mechanisms. Plant
Physiol, 128: 491~501
Boutrot F, Chantret N, Gautier MF (2008). Genome-wide analysis
of the rice and Arabidopsis non-specific lipid transfer protein
(nsLtp) gene families and identification of wheat nsLtp genes by
EST data mining. BMC Genomics, 9: 86
Cardamone M, Puri NK, Brandon MR (1995). Comparing the refold-
ing and reoxidation of recombinant porcine growth hormone
from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion
bodies. Biochemistry, 34 (17): 5773~5794
Champigny MJ, Isaacs M, Carella P, Faubert J, Fobert PR, Cameron
RK (2013). Long distance movement of DIR1 and investigation
of the role of DIR1-like during systemic acquired resistance in
Arabidopsis. Front Plant Sci, 4: 230
Chassot C, Nawrath C, Métraux JP (2007). Cuticular defects lead to
full immunity to a major plant pathogen. Plant J, 49: 972~980
Chen XJ, Xu HH (2011). Expression and purification of recombi-
nant MP-GFP protein in Escherichia coli. Agric Sci China, 10:
394~403
Dvořáková L, Cvrčková F, Fischer L (2007). Analysis of the hybrid
proline-rich protein families from seven plant species suggests
rapid diversification of their sequences and expression patterns.
BMC Genomics, 8: 412
Hammond-Kosack KE, Parker JE (2003). Deciphering plant-patho-
gen communication: fresh perspectives for molecular resistance
breeding. Curr Opin Biotechnol, 14: 177~193
Jalali BL, Bhargava S, Kamble A (2006). Signal transduction and tran-
scriptional regulation of plant defence responses. J Phytopathol,
154: 65~74
Josè-Estanyol M, Puigdomènech P (2000). Plant cell wall glycopro-
teins and their genes. Plant Physiol Biochem, 38: 97~108
Jung HW, Tschaplinski TJ, Wang L, Glazebrook J, Greenberg JT
植物生理学报72
(2009). Priming in systemic plant immunity. Science, 324: 89~91
Kader JC (1996). Lipid-transfer proteins in plants. Annu Rev Plant
Physiol Plant Mol Biol, 47: 627~654
Lauga B, Charbonnel-Campaa L, Combes D (2000). Characterization
of MZm3-3, a Zea mays tapetum-specific transcript. Plant Sci,
157: 65~75
Lee JY, Min K, Cha H, Shin DH, Hwang KY, Suh SW (1998). Rice
non-specific lipid transfer protein: the 1.6 Å crystal structure in
the unliganded state reveals a small hydrophobic cavity. J Mol
Biol, 276: 437~448
Li L, Zhang C, Xu D, Schläppi M, Xu ZQ (2012). Expression of
recombinant EARLI1, a hybrid proline-rich protein of Arabi-
dopsis, in Escherichia coli and its inhibition effect to the growth
of fungal pathogens and Saccharomyces cerevisiae. Gene, 506:
50~61
Liu PP, von Dahl CC, Park SW, Klessig DF (2011). Interconnection
between methyl salicylate and lipid-based long-distance signal-
ing during the development of systemic acquired resistance in
Arabidopsis and tobacco. Plant Physiol, 155: 1762~1768
Maldonado AM, Doerner P, Dixon RA, Lamb CJ, Cameron RK (2002).
A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance
signaling in Arabidopsis. Nature, 419: 399~403
Minorsky PV (2002). The wall becomes surmountable. Plant Physiol,
128: 345~353
Pandey GK, Grant JJ, Cheong YH, Kim BG, Li L, Luan S (2005).
ABR1, an APETALA2-domain transcription factor that functions
as a repressor of ABA response in Arabidopsis. Plant Physiol,
139: 1185~1193
Shin DH, Lee JY, Hwang KY, Kim KK, Suh SW (1995). High-reso-
lution crystal structure of the non-specific lipid-transfer protein
from maize seedlings. Structure, 3: 189~199
Thomma BP, Eggermont K, Penninckx IA, Mauch-Mani B, Vogelsang
R, Cammue BP, Broekaert WF (1998). Separate jasmonate-de-
pendent and salicylate-dependent defense-response pathways
in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial
pathogens. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 15107~15111
Thomma BP, Eggermont K, Tierens KF, Broekaert WF (1999). Re-
quirement of functional ethylene-insensitive 2 gene for efficient
resistance of Arabidopsis to infection by Botrytis cinerea. Plant
Physiol, 121: 1093~1102
Windram O, Madhou P, McHattie S, Hill C, Hickman R, Cooke E,
Jenkins DJ, Penfold CA, Baxter L, Breeze E et al (2012). Ara-
bidopsis defense against Botrytis cinerea: chronology and reg-
ulation deciphered by high-resolution temporal transcriptomic
analysis. Plant Cell, 24: 3530~3557
Yu K, Soares JM, Mandal MK, Wang C, Chanda B, Gifford AN,
Fowler JS, Navarre D, Kachroo A, Kachroo P (2013). A feed-
back regulatory loop between G3P and lipid transfer proteins
DIR1 and AZI1 mediates azelaic-acid-induced systemic immuni-
ty. Cell Rep, 3: 1266~1278
Zhang Y, Lubberstedt T, Xu M (2013). The genetic and molecular
basis of plant resistance to pathogens. J Genet Genomics, 40:
23~35
Zhang Y, Schläppi M (2007). Cold responsive EARLI1 type HyPRPs
improve freezing survival of yeast cells and form higher order
complexes in plants. Planta, 227: 233~243