全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (3): 263~268 263
收稿 2010-11-08　　修定 2011-02-24
资助 国家 “973” 项目(2009CB118504)。
* 通讯作者(E-mail: ylcui@shnu.edu.cn; Tel: 021-64324650)。
拟南芥白化突变体EMS30的基因定位与分析
孙跃, 杨仲南, 崔永兰*
上海师范大学生命与环境科学学院, 上海200234
摘要: EMS30是拟南芥经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变得到的白化突变体。该突变体的叶绿体结构存在严重缺陷, 同时伴随叶
绿素缺失。遗传分析显示EMS30突变体的突变表型受隐性单基因控制。采用图位克隆的方法对EMS30突变基因进行定位
的结果显示, 该基因位于拟南芥第一条染色体的分子标记F21M12和F14N23之间的96 kb区间内, 该区间包含25个基因。通
过生物信息学分析发现, 该区间内有3个基因定位在叶绿体或与叶绿体发育相关。这些结果有助于该基因的克隆, 为阐释
叶绿体发育提供线索。
关键词: 拟南芥; 白化; 图位克隆
Genetic Mapping and Analysis of Albino Gene EMS30 in Arabidopsis thaliana
SUN Yue, YANG Zhong-Nan, CUI Yong-Lan*
College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China
Abstract: An Arabidopsis thaliana albino mutant EMS30 was obtained by ethyl methane sulphonate (EMS)
mutagenesis strategy. EMS30 showed severe defects in chloroplast ultrastructure in concomitance with chloro-
phyll deficiency. Genetic analysis indicated that albino phenotype was controlled by a single recessive locus.
Using map-based cloning technique, EMS30 has been mapped to a region of 96 kb between molecular markers
F21M12 and F14N23 on chromosome 1. In this region there are 25 genes, of which 3 genes are related with
chloroplast function by bioinformatic analysis.
Key words: Arabidopsis thaliana; albino; map-based cloning
光合作用是绿色植物、藻类、光合细菌利用
光能固定二氧化碳, 将无机物转化为有机物并释
放氧气的过程。叶绿体是进行光合作用的场所,
而叶绿素在光合作用中起着吸收光能、驱动电子
传递的作用(Fromme等2003)。叶绿体发育缺陷或
叶绿素合成受阻会形成典型的叶色突变体, 其表
现为不正常的白化、黄化、浅绿、灰白、条纹等
(Awan等1980)。叶色突变体是比较常见的突变现
象, 一般在发育的早期出现, 也有少数的突变体会
在发育后期形成叶色突变体(Sugimoto等2004)。
叶色突变体产生的机制很复杂, 涉及到基因突变
和很多代谢调控过程(Motohashi等2001)。
叶色变异通常影响突变体光合效率, 造成作
物减产, 严重时甚至导致植株死亡。在育种工作
中, 叶色变异可作为标记性状, 简化良种繁育和杂
交种生产(沈允钢和程建峰2010; 吴殿星等1995)。
某些叶色突变体具有一些特殊的优良性状, 为作
物遗传育种提供了优良的种质资源(Gan和Amasi-
no 1995)。在基础研究中, 叶色突变体是研究植物
光合作用(Fambrini等2004)、光形态建成(Parks和
Quail 1991)、激素生理以及抗病机制(Agrawal等
2001)等一系列生理代谢过程的理想材料; 同时利
用此种突变体可分析鉴定基因功能, 了解基因间
互作(Lopez-Juez等1998)。因此对于该类突变体的
研究有着迫切的理论需要和广阔的应用前景。
本文中研究的突变体是我们经甲基磺酸乙酯
(ethyl methane sulphonate, EMS)诱变得到的一株拟
南芥白化突变体, 与野生型相比, 该植株呈白化表
型, 生长受抑制, 苗期致死, 在增补蔗糖条件下, 可
延长生长期, 但依旧为致死植株。本研究对该突
变体进行了背景纯化、遗传分析、细胞学观察,
并用图位克隆的方法对导致白化表型的EMS30基
因进行了精细定位, 为以后该基因的克隆及功能
研究打下了基础。
材料与方法
1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)以Landsberg
植物生理学报264
erecta (Ler)为遗传背景, 突变体由EMS诱变剂诱变
得到, 方法同Sanders等(1999)。野生型Ler (WT)的
种子经10 mmol·L-1 EMS诱变剂浸泡后种植, 单株
收种子, 将获得的种子种下后观察表型, 获得白
化突变体植株。种植方法及生长条件同易君等
(2006)。
2 方法
纯化突变体的背景, 由野生型Ler为父本, 以
EMS30分离群体中的绿色植株为母本, 同时收取每
个单株的杂交和自交种子, 通过自交判断基因型,
收取含突变位点植株为母本的杂交种子, 得到10
棵含突变位点的杂合F1代植株, F1代自交得到近
5 000棵F2代植株。统计白化表型和正常绿色表型
植株的比例, 进行遗传分析。
选取野生型和突变体EMS30生长1周的叶片,
提取叶绿体的色素, 野生型和突变体各取3个平行
样本。具体方法参照文献(Wellburn 1994)。
取生长于培养基PNS (Haughn和Somerville
1986)+2%蔗糖上2周的真叶, 置于2.5%戊二醛-磷
酸缓冲液(pH 7.2)中4 ℃固定1周, 磷酸缓冲液漂洗,
1%锇酸固定过夜, 次日磷酸缓冲液漂洗, 乙醇梯度
脱水, 梯度环氧树脂/环氧丙烷渗透, 最后包埋于
Epon 812树脂中, 样品切片, 经醋酸铅和柠檬酸铀
染色, 透射电镜观察。
提取总蛋白时, 将叶片置于预冷的研钵内, 加
200 μL Media (每250 mL加1.5 mol·L-1 Tris-HCl (pH
8.6) 4.16 mL、NaCl 0.73 g、NH4Cl 0.08 g、
MgCl2·6H2O 0.5 g)和40 μL 25% Triton, 充分研磨,
冰浴1 h, 13 400×g离心10 min, 吸上清液置新管中,
确定上清液的体积。分光光度计测样品和BSA的
OD600值, 进行蛋白定量, 确定样品的上样量。加入
与上清液等体积的2×SDS Loading buffer, 混匀, 沸
水浴4 min。每次上样前13 400×g离心1 min, 取上
清液上样。
采用Western blot分析突变体光合作用相关蛋
白表达情况。取生长于培养基PNS+2%蔗糖上2周
的野生型Ler和突变体EMS30的植株, 提取总蛋
白。每个样品总蛋白的上样量为40 μg。120 V垂
直电泳, 电流15 A转膜过夜。5%脱脂牛奶封闭, 杂
一抗(多克隆兔抗, Agrisera公司), TBST洗脱, 杂二
抗(山羊抗兔IgG, 康为世纪公司)显影。
图位克隆所需要的定位群体以野生型Col为
父本, 以EMS30分离群体中的绿色植株为母本(方
法同背景纯化杂交), 杂交得到近100棵杂合F1代植
株, F1代自交后得近20
000 棵F2代植株, 取F2代中的
白化突变体作定位材料。分子标记的建立参照陈
辉等(2007)的方法。基因初定位的方法及所用分
子标记参照Zhu等(2008)的方法, 找到连锁的分子
标记后, 在该分子标记附近设计新的分子标记, 用
高通量提取DNA的方法(Xin等2003), 提取大量定
位群体F2代植株的DNA, 分析其基因型, 对目的基
因进行精细定位。
利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.
arabidopsis.org/, http://www.cbs.dtu.dk/services/Tar-
getP/对精细定位区间内的基因进行分析。
实验结果
1 EMS30突变体的分离、表型及遗传分析
突变体EMS30是由拟南芥野生型Ler经EMS
诱变筛选到的白化表型植株, 该植株只能长出白
化子叶, 苗期致死, 在增补2%蔗糖的PNS培养基上,
叶片略微发黄, 可以长出4片真叶, 但不能进行生
殖生长(图1)。
为了确定该植株的白化突变表型是否为单基
因控制, 我们对其进行遗传分析, 将F2代种植后统
计绿色植株和白化植株的分离比为73 :24 [χ 2
(3:1)=0.003; P>0.95], 因此确定EMS30的白化表型
是由隐性单基因控制的。
2 EMS30突变体的叶绿素含量测定及透射电镜观
察
EMS30突变体呈现白化表型, 由于叶片的颜
色与色素的含量直接相关, 因此我们测量了EMS30
突变体和野生型Ler的色素含量, 结果如表1所示。与
野生型相比, 突变体基本不含有叶绿素a和叶绿素
b, 只含有少量的类胡萝卜素, 与其白化表型相一致。白
化突变大多数会伴随叶绿体发育异常(Babiychuk
等2003), 所以我们又观察了拟南芥突变体和野生
型的叶绿体超微结构。透射电镜结果显示, 在野
生型植株中, 叶绿体呈现出典型的基粒类囊体和
基质类囊体的分化; 而突变体EMS30的叶绿体发
育异常, 只含有少量的基质类囊体, 没有形成垛叠
的基粒类囊体, 总类囊体膜明显减少(图2)。
孙跃等: 拟南芥白化突变体EMS30的基因定位与分析 265
3 EMS30突变体的光合作用相关蛋白的表达分析
叶绿体发育异常通常影响光合作用相关蛋白
的表达(Myouga等2008), 为了研究EMS30突变体光
合作用相关蛋白的表达, 我们采用了Western bolt的
方法分析类囊体膜蛋白复合物亚基的表达情况。
在突变体EMS30中, 光系统II的核心亚基PsbD (D2)缺
图2 野生型和突变体EMS30生长14 d真叶的叶绿体超微结构
Fig.2 Chloroplast ultrastructures of 14-day-old leaf of wild type and EMS30 mutant
标尺=1 μm。
表1 野生型Ler和突变体EMS30的色素含量分析
Table 1 Analysis of pigment contents in wide type and EMS30 mutant
　　　　　　 　 Chl a含量/mg·g-1 (FW) Chl b含量/mg·g-1 (FW) Car含量/mg·g-1 (FW) Chl a/b
野生型Ler 0.8696±0.0065 0.32570±0.03700 0.27020±0.00290 2.670
突变体EMS30 0.0008±0.0002 0±0.00019 0.00735±0.00410 —
图1 野生型Ler和突变体EMS30表型分析
Fig.1 Phenotype of wild type and EMS30 mutant
植物生理学报266
失, 光系统II的捕光叶绿素a/b结合蛋白Lhcb3显著下
降, 而光系统I的核心亚基PsaA与ATP合成酶亚基
AtpB的表达量并没有受到影响, 这表明光系统II蛋
白复合物受到该基因突变的影响(图3)。
4 EMS30突变体的基因定位及分析
为了进一步研究EMS30突变体并克隆到该基
因 , 我们采用图位克隆的方法对该基因进行定
位。首先我们用本实验室开发的在拟南芥5条染
色体上均匀分布的20个分子标记(Zhu等2008)进行
图3 野生型Ler和突变体EMS30类囊体膜蛋白的Western blot分析
Fig.3 Western blot analysis of thylakoid membrane proteins in wild type and EMS30 mutant
A: 总蛋白(上样量为40 μg, 考马斯亮蓝染色); B: 类囊体膜蛋白的Western blot。
图4 突变基因EMS30的初定位
Fig.4 First mapping of the gene EMS30
1~3: EMS30突变体混合模板; 4: Ler; 5: Col; 6: Ler/Col混合模板。
表2 精细定位所用分子标记的引物序列
Table 2 Primer sequences of molecular markers involved in the fine mapping
分子标记 正向引物(5→3) 反向引物(5→3)
F12K11 CTGACGCAGAGTTAGCATAC GCGAAGGATCATCAAGGTA
T23G18 TATTTCCCGATGAGTGGC GAGGACAGAGGAGCCAAA
F22O13 CTACACATTTACAGCCATGT CATATCATTCTGTGTAAACGT
F21M12 AAACGATGAAGGAGCCGAT AAACCAAGGCACAGAAGCG
F14N23 GGTGGTTTGTTTACTCTG ATGGGTGCCGATCCTCA
T28K15 TGCTACGGAAGAAAAAGAGTGA TCGGATTAGCGCAGAGGG
F19K19 CGGAGAGGTAGA AGACAGTAA AAGCAGAAGAATCGTCGTAG
初定位连锁分析, 结果显示突变位点位于第一条
染色体T28K15分子标记附近(图4)。
为了进一步找到该突变位点, 我们又设计了
一系列In/Del分子标记(表2), 结合高通量PCR的方
法, 共分析了3 000个白化突变单株, 将突变位点精
细定位在拟南芥第一条染色体上臂F21M12和
F14N23两个分子标记之间96 kb的区间内(图5), 在
该区间内共有25个基因 , 其中首尾基因分别为
AT1G09910和AT1G10130。结合TAIR数据库(http://
孙跃等: 拟南芥白化突变体EMS30的基因定位与分析 267
www.arabidopsis.org/)及Targat P (http://www.cbs.
dtu.dk/services/TargetP/)预测, 有3个基因与叶绿体
功能相关 , 可能为EMS30的候选基因 , 分别是
AT1G09940 (与亚铁血红素的生物合成相关)、AT1-
G09960 (与蔗糖的跨膜运输相关)、AT1G10070
(与支链氨基酸代谢过程相关)。
讨　　论
EMS30突变体是通过EMS诱变获得的白化突
变体。在营养土中萌发, 只能长出2片白化子叶,
但在增补2%蔗糖的培养基中, 可以长出4片真叶,
但仍然呈现苗期致死表型。该突变体只能合成少
量叶绿素, 叶绿素合成受阻可能是导致叶绿体不
能正常发育的原因。很多研究表明, 叶绿素的合
成受多种方式调控(吴自明等2008), 叶绿素能稳定
与其结合的光合蛋白复合体, 使其进入类囊体, 当
叶绿素缺失时 , 蛋白复合体不稳定 , 会被水解
(Eichacker等1996), 从而影响叶绿体发育。叶绿体
超微结构显示该突变体仅含少量基质类囊体, 但
无垛叠的基粒类囊体。叶绿体发育异常通常伴随
光合作用相关蛋白的表达量变化。光系统II主要
分布在基粒类囊体膜中, 光系统I及ATP合成酶主
要分布在基质类囊体膜中(Chow等1991; Allred和
Staehelin 1985)。在EMS30突变体中, 基粒结构缺
失, 光系统II亚基D2不能被探测, 光系统II的捕光
叶绿素a/b结合蛋白Lhcb3仅积累到较低的水平, 而
光系统I亚基PsaA及ATP合成酶亚基AtpB没有明显
的变化, 表明该基因突变对光系统II产生了严重的
影响, 并未对光系统I产生影响。
图位克隆是一种正向遗传学的研究方法, 主
要是通过寻找与目的基因相连锁的分子标记来确
图5 突变基因EMS30的精细定位图
Fig.5 Genetic mapping of the gene EMS30
定基因的位置。本实验中, EMS30已经定位在拟南
芥第一条染色体F21M12和F14N23两个分子标记
之间96 kb的区间之内, 根据TAIR数据库和Target P
数据库分析, 该区间内有25个基因, 其中3个定位
在叶绿体或是与叶绿体发育和叶绿素合成相关。
目前, 我们正在采取测序以及进一步缩小区间相
结合的方式进一步确定基因的位置 , 克隆该基
因。对EMS30的克隆及功能分析, 有助于推动叶绿
体早期发育的研究, 将更好地诠释叶绿体发育的
分子机制。
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