全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 10 期，2009 年 10 月972
收稿 2009-08-19 修定 　2009-09-27
* 通讯作者(E-mail: lish@gsau.edu.cn; Tel: 0931-7631547)。
油菜愈伤组织中烯丙基硫苷的积累和某些外源碳氮化合物对其含量的影响
吴媛媛 1,2, 马绍英 1,2, 李胜 1,2,*, 张真 1,2, 刘媛 1,2, 张青松 1,2
1 甘肃农业大学生命科学技术学院植物细胞工程研究室, 兰州 730070; 2 兰州汇通生物科技有限公司, 兰州 730000
提要: 油菜愈伤组织在培养中生长34 d的增殖量最大, 增殖倍数为7.08倍, 烯丙基硫苷的含量在第6天最高; 外源L-缬氨酸
明显促进烯丙基硫苷的积累, 其浓度为2和4 mmol·L-1时烯丙基硫苷含量分别达到98.5和97.40 mg·g-1 (DW); 蔗糖最有利于
油菜愈伤组织的生长和其中烯丙基硫苷的积累, 浓度以30 g·L-1的蔗糖为最佳。
关键词: 油菜; 烯丙基硫苷; 前体物质; 糖源; 愈伤组织
Accumulation of Sinigrin in Brassica campestris L. Callus and Effects of Some
Exogenous Carbon and Nitrogen Containing Compounds on Its Contents
WU Yuan-Yuan1,2, MA Shao-Ying1,2, LI Sheng1,2,*, ZHANG Zhen1,2, LIU Yuan1,2, ZHANG Qing-Song1,2
1Laboratory for Plant Tissue Culture, College of Life Science & Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070,
China; 2Lanzhou Huitong Biological Science & Technology Ltd., Lanzhou 730000, China
Abstract: It was studied by callus culture to accumulation dynamics of sinigrin in rape (Brassica campestris)
callus and effects of some exogenous carbon and nitrogen containing compounds on sinigrin contents. The
extreme proliferation multiples of callus was 7.08 in the 34th day of culture. The sinigrin content reached to
109.04 mg·g-1 (DW) in the highest at the 6th day. When the addition concentrations of L-valine were 2 mmol·L-1
and 4 mmol·L-1, the sinigrin contents of rape callus were 98.5 and 97.40 mg·g-1 (DW), respectively, which were
promoted obviously. Sucrose was the optimal carbon source for rape callus multiplication and sinigrin accumu-
lation with the best addition concentration of 30 g·L-1.
Key words: Brassica campestris; sinigrin; precursors; carbon source; callus
烯丙基硫苷(sinigrin)是植物体内由氨基酸衍生
而来的一种亲水性的次生代谢产物, 是十字花科植
物的风味成分(Grubb和Abel 2006), 其降解产物中
的烯丙基异硫氰酸酯有抗癌和抗肿瘤的作用, 并广
泛用作食品添加剂和食品抗菌剂(翟建华等2008)。
随着对天然药物需求的不断增加, 硫苷及其降解产
物的研究开发和利用引起了人们的广泛关注(Nafisi
等 2006)。植物中已发现的硫苷有 120 多种, 但对
单一硫苷合成代谢的研究尚鲜有报道(Wielanek和
Urbanek 1999)。为此, 本文研究了油菜愈伤组织
培养过程中烯丙基硫苷的积累以及不同糖源和氨基
酸对其含量的影响, 并对烯丙基硫苷的生物合成途
径进行了初步探讨。
材料与方法
以油菜(Brassica campestris L.)品种 ‘ 陇油 5号 ’
种子胚诱导并于继代培养基 1 (MS+0.5 mg·L-1 2,4-
D+4.0 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1蔗糖+5 g·L-1琼脂)上继
代 6 个月的愈伤组织为实验材料。愈伤组织转接
于增殖培养基 2 (MS+0.5 mg·L-1 2,4-D+3.0 mg·L-1
6-BA+30 g·L-1蔗糖+5 g·L-1琼脂)上, 每瓶接种生长
旺盛且大小一致的 5块愈伤组织, 于 10~15 μmol·m-2·
s-1 光照和温度(25±2) ℃的条件下培养, 每隔 2 d 随
机选取 5 瓶测定愈伤组织的增殖量、干重和烯丙
基硫苷含量, 直至接种后第 42 天为止。实验重复
3 次。
在增殖培养基 2 中分别添加 L- 丙氨酸(Ala)、
L- 亮氨酸(Leu)、L- 异亮氨酸(Ile)、DL- 蛋氨酸
(Met)、L- 缬氨酸(Val) 5 种氨基酸, 每种氨基酸的
浓度分别设 0 . 1、0 . 5、1 . 0、1 . 5、2 . 0、2 . 5、
3.0、3.5、4.0、6.0 mmol·L-1, 以不添加氨基酸
的为对照。愈伤组织接种于上述培养基上, 每种处
理 10 瓶, 重复 3 次。培养至第 35 天时, 测定愈伤
组织的增殖量、干重和烯丙基硫苷含量。培养条
件同上。
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在去除蔗糖的增殖培养基 2 中分别添加葡萄
糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、白砂糖 5 种糖源, 每
种糖的浓度分别设 10、20、30、40、50、6 0
g·L-1。愈伤组织接种于上述培养基上, 每种处理10
瓶, 重复 3 次。培养到第 35 天时, 测定愈伤组织
的增殖量、干重和烯丙基硫苷含量。培养条件同
上。
愈伤组织的生长按下式计算愈伤组织增殖倍
数: 接种量(g· 瓶 -1)= 接种后瓶重-接种前瓶重; 收
获量(g·瓶 -1)=收获前瓶重-收获后瓶重; 增殖倍数=
收获量 / 接种量。
愈伤组织于恒温烘箱(60 ℃)中烘干, 研成粉末,
称取0.5 g, 加入10 mL 70%甲醇, 于70 ℃恒温水浴
中浸提 30 min, 浸提 3 次, 合并上清液。加入占总
体积 1/50 的 0.5 mol·L-1 Pb(Ac)2-Ba(Ac)2 溶液,
6 440×g离心10 min, 取上清液并以1:1体积加入氯
仿萃取。如此重复操作 3 次 , 将上层萃取液于
55 ℃旋转蒸发至近干, 加甲醇定容至 25 mL, 分别
过 0.45 和 0.22 μm滤膜, 置于 4 ℃下保存, 供色谱
检测用(何洪巨等 2002; Bartlet 等 1999)。
HPLC 检测条件为: 高效液相色谱仪 Agilent
1100; 色谱柱为YWG-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);
流动相为甲醇:(水 +0.005 mol·L-1 KCl)=9:91 (V/V);
柱温 30 ℃; 检测波长 227 nm; 进样量为 20 μL。
采用外标法进行定量测定(吴谋成等 1995)。以峰
面积(x)为横坐标, 烯丙基硫苷含量(y)为纵坐标建
立峰面积与烯丙基硫苷含量的线性回归方程为
y=15.45x-1 723.45 (R2=0.9991), 单位为 μg·g-1
(DW )。
结果与讨论
1 油菜愈伤组织生长期间的增殖量及烯丙基硫苷
含量的变化
油菜愈伤组织生长期间的增殖量变化趋势基
本上符合S型生长曲线, 愈伤组织在接种后2~12 d
的生长很少, 鲜重无明显增加; 12~34 d生长进入旺
盛时期, 生长增殖呈直线上升, 第34天的鲜重最大,
增殖倍数为 7.08 倍; 34 d 以后随着时间的延长生
长速度下降, 第 42 天的增殖速率比 34 d 的下降
24.2% (图 1)。培养后期, 培养基中糖含量减少而
不足以维持细胞生长。
生长期间油菜愈伤组织的烯丙基硫苷含量在
整体上呈先上升后下降的趋势, 愈伤组织接入初期
的合成速率快, 第 6 天达到最高值, 为 109.04 mg·g-1
(DW); 第 6~42 天的含量呈逐渐下降趋势, 第 42 天
降到 45.53 mg·g-1 (DW) (图 2)。由此可见, 细胞生
长期间的次生代谢产物合成过程并不是匀速进行
的, 在油菜愈伤组织中的烯丙基硫苷合成速率呈先
快后慢的变化过程。此外, 次生代谢物产量受愈伤
组织的增殖量和含量共同影响, 油菜愈伤组织中烯
丙基硫苷产量呈先增后减的变化趋势, 36 d的产量
最高, 为 51.96 mg· 瓶 -1 (DW), 随后急剧下降。据
此可以认为 34~36 d 为烯丙基硫苷的最佳收获期。
图 1 不同收获时间的愈伤组织增殖量的变化
Fig.1 Changes in callus multiplication in different
callus growth periods
图 2 不同收获时间的愈伤组织中烯丙基硫苷
含量及产量的变化
Fig.2 Changes in sinigrin contents and output
in different callus growth periods
2 氨基酸对油菜愈伤组织增殖量和烯丙基硫苷含
量的影响
添加L-缬氨酸和L-亮氨酸对油菜愈伤组织增
殖量有一定的抑制作用, 并且随着添加物浓度的增
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加其抑制作用也明显增强; L-异亮氨酸和DL-蛋氨
酸对愈伤组织的增殖有一定的促进作用, L-异亮氨
酸的浓度为4.0 mmol·L-1时的愈伤组织增殖倍数达
到 6.97 倍, 添加 6.0 mmol·L-1 DL- 蛋氨酸的愈伤组
织增殖倍数为6.86倍; L-丙氨酸在整体上对愈伤组
织的增殖并无明显的促进作用(图 3)。
苷的含量, 这可能是由于基本培养基已经为硫苷的
合成提供了足够的硫。
图 3 不同氨基酸对愈伤组织增殖量的影响
Fig.3 Effects of different amino acids on callus multiplication
添加L-缬氨酸对愈伤组织中烯丙基硫苷含量
有明显的促进作用, 整体上呈双峰曲线, 在 2.0 和
4.0 mmol·L-1 时含量分别高达 98.5 和 97.40 mg·g-1
(DW), 比不加氨基酸的值高 23% 和 21% (图 4)。
L-缬氨酸属于脂肪烃侧链氨基酸, 其结构中的侧链
为三碳直链基团, 和烯丙基硫苷的侧链碳的个数相
符, 由此可以初步判断烯丙基硫苷的侧链来源于L-
缬氨酸, 至于L-缬氨酸的侧链是如何转化成烯丙基
硫苷 R 基团的还需更深入研究。在培养体系中加
入前体化合物将有利于终端产物的合成, 但高浓度
外源前体的加入又会抑制植物细胞的生长, 最终影
响次生代谢物的产量, 因此就许多前体而言, 存在
一个前体的最佳添加浓度(杨广兴等 2007; 张真等
2008)。本文中的前体L- 缬氨酸在浓度为 2.0 和 4.0
mmol·L-1 时其烯丙基硫苷含量较高, 超过4.0 mmol·L-1
的添加浓度烯丙基硫苷的合成反而受到抑制。
添加其他 4 种氨基酸的愈伤组织中烯丙基硫
苷含量在整体上比不加氨基酸的低, 仅在添加 3.0
mmol·L-1 L-异亮氨酸时, 其含量为88.8 mg·g-1 (DW),
略高于不加氨基酸的值(图 4)。有研究表明, DL-
蛋氨酸可为油菜根系直接吸收利用, 而且对植株中
硫苷合成积累有一定的促进作用(王庆仁等 1999),
但本文中添加 DL- 蛋氨酸并未显著提高烯丙基硫
图 4 不同氨基酸对愈伤组织中烯丙基硫苷含量的影响
Fig.4 Effects of different amino acids on
sinigrin contents in callus
添加L-缬氨酸对烯丙基硫苷产量有明显促进
作用, 其中添加 2.0 mmol·L-1 L- 缬氨酸的烯丙基硫
苷产量达到 270.10 mg· 瓶 -1 (DW), 比不加氨基酸
的高 27%。由于添加 DL- 蛋氨酸有利于愈伤组织
的增殖, 其对烯丙基硫苷产量也有一定的促进作用,
其中浓度为 3.0 mmol·L-1 的 DL- 蛋氨酸其产量为
264.46 mg· 瓶 -1 (DW); L- 异亮氨酸、L- 丙氨酸和
L-亮氨酸对烯丙基硫苷产量无明显促进作用(图5)。
图 5 不同氨基酸对愈伤组织中烯丙基硫苷产量的影响
Fig.5 Effects of different amino acids on
sinigrin output in callus
3 糖源对油菜愈伤组织的增殖量和烯丙基硫苷含
量的影响
添加 10~30 g·L-1 的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖
和白砂糖时, 油菜愈伤组织鲜重均呈增长趋势, 在
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30 g·L-1 时达到最大值, 其增殖倍数分别为7.33、8.41、
8.14、7.90 倍, 随着添加物浓度的增加愈伤组织增
殖量下降, 添加物浓度为 60 g·L-1 时降到最低值。
在 4 种糖中, 蔗糖比其他 3种糖更适于油菜愈伤组
织的增殖(图 6)。添加乳糖的愈伤组织全部褐化,
说明油菜愈伤组织不适合添加乳糖。
愈伤组织中烯丙基硫苷含量对不同糖源的添
加也有响应, 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、白砂糖 4
种糖的浓度为10 g·L-1时的烯丙基硫苷含量最高, 分
别为 127.82、130.56、118.48、113.33 mg·g-1
(DW), 随着添加物浓度的增加, 烯丙基硫苷含量呈
递减趋势。蔗糖和白砂糖的变化趋势相似。添加
乳糖的虽然其愈伤组织中的烯丙基硫苷含量在整体
上略高于其他糖源, 但其愈伤组织全部褐化(图7)。
图 6 不同糖源对愈伤组织增殖量的影响
Fig.6 Effects of different carbon sources on callus multiplication
图 7 不同糖源对愈伤组织中烯丙基硫苷含量的影响
Fig.7 Effects of different carbon sources on
sinigrin contents in callus
在细胞增殖量和烯丙基硫苷含量的影响下, 蔗
糖、麦芽糖和白砂糖对油菜愈伤组织中烯丙基硫
苷产量的影响均呈先升后降的趋势, 它们的浓度为
30 g·L-1 时的产量最大, 分别为 230.43、221.06 和
222.45 mg· 瓶 -1 (DW); 添加葡萄糖比前 3种糖的产
量低, 其在 20 g·L-1 时的产量最大。乳糖不利于愈
伤组织的生长, 全部褐化, 因此其产量也最低(图8)。
图 8 不同糖源对愈伤组织中烯丙基硫苷产量的影响
Fig.8 Effects of different carbon sources on
sinigrin output in callus
低浓度糖较利于烯丙基硫苷的积累, 而较高浓
度的糖利于细胞的生长, 但糖浓度过高可能会引起
细胞外渗透压过大, 以致细胞膜的通透性失调, 最
终导致细胞生长受阻。30 g·L-1 的蔗糖既可满足细
胞生长的需求, 又较有利于烯丙基硫苷的积累, 由
此可见, 细胞次生代谢物产量的高低应该从愈伤组
织的增殖量和烯丙基硫苷含量两方面加以综合评
价, 蔗糖是油菜愈伤组织增殖和烯丙基硫苷积累的
最佳糖源, 其最适浓度为 30 g·L-1。在烯丙基硫苷
合成中, 初级代谢和次级代谢是两个互相竞争的过
程, 硫苷作为一类与植物抗逆性相关的次生代谢物,
在适当的胁迫环境下, 细胞中参与次级代谢的物质
增加, 烯丙基硫苷含量也随之升高。所以本文结果
中低浓度糖的烯丙基硫苷含量之所以高于高浓度糖
的, 可能与上述原因有关。
参考文献
何洪巨, 陈杭, Schniteler WH (2002). 芸薹属蔬菜中硫代葡萄糖
苷鉴定与含量分析. 中国农业科学, 35 (2): 192~197
王庆仁, 林葆, 李继云(1999). 含硫硒化合物在油菜中的积累及
其对硫苷水平的影响. 生态学报, 19 (4): 546~550
吴谋成, 况成尘, 黄伟(19 95). 用液相制备色谱从菜籽中分离、
纯化、制备硫代葡萄糖苷. 色谱, 13 (1): 4~7
杨广兴, 李胜, 李唯, 张真, 李婷, 王新宇, 杨德龙, 王彦军(2007).
植物生理学通讯 第 45 卷 第 10 期，2009 年 10 月976
几种外源含氮化合物对草麻黄愈伤组织增殖和麻黄碱含量
的影响. 植物生理学通讯, 43 (1): 49~52
翟建华, 王蓓, 刘向欣, 曹小妹(2008). 异硫氰酸烯丙酯的常用制
法及其主要功效. 中国调味品, 4 (4): 20~24
张真, 李胜, 李唯, 刘媛, 吴兵, 张青松, 李婷(2008). 不同光质光
对葡萄愈伤组织增殖和白黎芦醇含量的影响. 植物生理学通
讯, 44 (1): 106~108
Bartlet E, Kiddle G, Williams I, Wallsgrove R (1999). Wound-
induced increases in the glucosinolate content of oilseed rape
and their effect on subsequent herbivory by a crucifer
specialist. Entomol Exp Appl, 91: 163~167
Grubb CD, Abel S (2006). Glucosinolate metabolism and its control.
Trends Plant Sci, 11 (2): 89~100
Nafisi M, Sonderby IE, Hansen BG, Geu-Flores F, Nour-Eldin HH,
Norholm MHH, Jensen NB, Li J, Halkier BA (2006). Cyto-
chromes P450 in the biosynthesis of glucosinolates and in-
dole alkaloids. Phytochem Rev, 5: 331~346
Wielanek M, Urbanek H (1999). Glucotropaeolin and myrosinase
production in hairy root cultures of Tropaeolum majus.
Plant Cell Tiss Org Cul, 57: 39~45