全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (1): 73–84　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0538 73
收稿 2015-10-15　　修定 2015-12-14
资助 国家自然科学基金(30870194和J1210063)、陕西省重点实
验室科研计划(15JS111、12JS103和2010JS090)和西北大
学研究生创新计划(YZZ14076和YZZ13068)。
* 通讯作者(E-mail: ziqinxu@nwu.edu.cn)。
菘蓝环硫指定蛋白基因IiESP的克隆及其编码产物的亚细胞定位
马燕勤, 李典珍, 姚静雯, 李琦, 徐子勤*
西北大学生命科学学院, 陕西省生物技术重点实验室, 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室, 西安710069
摘要: 为了探究十字花科植物环硫指定蛋白(ESP)对硫代葡萄糖苷分解的导向作用所具有的生物学功能, 从菘蓝中克隆了
IiESP基因的cDNA和基因组序列, 并分析了其表达模式。在此基础上利用GFP标签对IiESP蛋白进行了亚细胞定位, 并根据
氨基酸序列预测了该蛋白的三维结构。结果表明: IiESP基因含有2个外显子和1个内含子, 其基因组、cDNA和ORF序列长
度分别为1 555、1 315和1 164 bp。IiESP蛋白由387个氨基酸构成, 含有5个Kelch模块, 可折叠形成球状超螺线管结构。多
重比对发现IiESP与欧洲菘蓝ItESP、拟南芥AtESP和甘蓝BoESP在氨基酸序列上的一致性分别为79%、76%和77%。通过
农杆菌渗入法在本氏烟草叶片表皮细胞中瞬时表达IiESP基因, 证实IiESP蛋白定位于叶绿体中。RT-PCR分析结果显示,
IiESP主要在下胚轴、茎、早期花序、成熟花序、花、萼片和花瓣中表达, 其在花被中的高活性可能与吸引昆虫进行传粉
有关。
关键词: 菘蓝; 环硫指定蛋白; 表达分析; 亚细胞定位; Kelch模块
植物细胞能够合成各种各样的次生代谢产物,
这些物质可以提供防御食草性动物的功能, 对植
物有保护作用。硫代葡萄糖苷(glucosinolate, 又名
葡萄糖异硫氰酸盐或芥子油苷)是十字花科植物组
织中含有的一类重要的含硫次生代谢产物, 其主
链由一个β-硫代葡萄糖残基、一个N-羟基亚氨基
硫酸酯和一个可变的侧链组成(Rodman等1998)。
通常根据是否来自脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸
或者色氨酸将硫代葡萄糖苷划分为脂肪类、芳香
类和吲哚类3种类型(Kliebenstein等2005)。
硫代葡萄糖苷-黑芥子酶(myrosinase, 亦称为
葡糖硫苷酶, EC 3.2.1.147)体系是十字花科植物中
最具化学活性的防御体系。在完整的植物组织中,
硫代葡萄糖苷和黑芥子酶是完全分开的。硫代葡
萄糖苷存在于液泡中, 相对较为稳定; 黑芥子酶则
存在于特定的蛋白体中。当细胞受到伤害时, 硫
代葡萄糖苷和黑芥子酶的区室化分布被破坏, 作
为底物的硫代葡萄糖苷和作为催化剂的黑芥子酶
就会相互接触(Halkier和Gershenzon 2006), 硫代葡
萄糖苷被水解成异硫氰酸酯、硫氰酸酯和腈类等
具有不同毒性的物质(Bones和Rossiter 1996), 使植
物个体对食草动物和微生物病原体表现出抗性
(Buxdorf等2013)。
硫代葡萄糖苷-黑芥子酶体系还包括一类蛋
白质因子——环硫指定蛋白(epithiospecifier pro-
tein, ESP), 它们能够间接地影响黑芥子酶对硫代
葡萄糖苷的分解作用, 使水解产物从异硫氰酸盐
变为具有环硫结构的腈类物质(Matusheski等2006;
Brandt等2014)。ESP蛋白存在于许多植物中, 但也
有一些含硫代葡萄糖苷的植物没有ESP蛋白。根
据硫代葡萄糖苷侧链的不同, 水解产物可以是异
硫氰酸盐、环硫腈类或简单腈类。在黑芥子酶的
作用下, 硫代葡萄糖苷的糖苷键被打断, 脱去1分
子葡萄糖后形成一个不稳定的甙配基。在生理条
件下, 甙配基自发重排形成异硫氰酸盐。但是当
ESP存在时, 甙配基更倾向于重排形成腈类化合物
(图1) (Bernardi等2000)。
尽管已有研究证明异硫氰酸盐对许多微生物
和个别食草昆虫是有毒的, 但是腈类化合物和环
硫指定蛋白是否具有类似的作用还不清楚(Witt-
stock等2003)。ESP是一类不稳定的小分子蛋白,
不具有酶活性, 最早是从海甘蓝种子中分离得到
的(Tookey 1973), 随后在油菜中也发现了这种蛋白
质(Foo等2000; Bernardi等2000)。在拟南芥中, ESP
位点的遗传多样性与个体对多种草食性动物的抗
性相关。已有的研究结果显示, 与水解形成异硫
氰酸盐的植物相比, 形成腈类的植物更容易受到
鳞翅类幼虫的伤害(Lambrix等2001), 这说明ESP对
硫代葡萄糖苷分解的导向作用有助于鳞翅类幼虫
的发育和生长(Burow等2006)。另外, 在绣线菊和
拟南芥中还找到了能够负调节ESP活性的EPITH-
植物生理学报74
IOSPECIFIER MODIFIER1基因, 可以使硫代葡萄
糖苷主要分解为异硫氰酸盐, 说明植物次生代谢
产物的分解具有复杂的调控机制(Kissen等2012;
Slabaugh等2015)。
目前已经通过分析粗提物研究了许多十字花
科植物ESP蛋白的活性, 如海甘蓝(Crambe abyssi-
nica)、芜青(Brassica campestris ssp. rapifera)、孢
子甘蓝(Brassica oleracea var. gemmifera)、结球甘
蓝(Brassica oleracea var. capitata)和拟南芥等(Ver-
hoeven等1997; Brandt等2014)。采用同样的方法,
在甘蓝型油菜(Brassica napus ssp. oleifera)中也发
现了ESP蛋白, 并对其部分肽段的氨基酸序列进行
了鉴定(Bernardi 等2000)。
随着分子生物学的进展, 人们已经开始研究
ESP基因在植物体内的调节机制以及能够影响其表
达的外部环境因素。例如在白菜中分析了信号分子
茉莉酸对ESP表达的诱导作用(王政等2012), 但相关
工作在菘蓝中尚未见报道, ESP在菘蓝属植物中对硫
代葡萄糖苷分解代谢的调控作用也还不清楚。为了
阐明ESP在菘蓝中的功能, 本研究分离了菘蓝的环
硫指定蛋白基因IiESP, 并对其功能进行了初步分析。
材料与方法
1 试验材料和菌种
植物材料为温室中种植的菘蓝(Isatis indigotica
Fortune)植株。克隆实验采用的宿主细胞为大肠
杆菌(Escherichia coli) DH5α菌株。植物遗传转化
实验采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
LBA4404菌株。植物双元表达载体为pCAM-
BIA1302。
2 引物合成
试验所用引物及其序列见表1。根据拟南芥
AtESP编码区和起始密码子前保守区域设计简并
引物(上游M1、M2和M3, 下游M4、M5和M6), 扩
增得到保守片段。根据cDNA片段设计引物, 用
ESP-3′RACE和oligo dT18扩增IiESP 3′端, 用
ESP-5′RPrimer和UPM以及NUP (来自Clontech
RACE试剂盒)扩增IiESP 5′端。用cDNA设计引物
ESP-Upstream1和ESP-Upstream2扩增I iESP
5′UTR。用ESP-Downstream1和ESP-Downstream2
扩增IiESP的内含子区域。ESP-gfp-FPrimer和ESP-
g f p - R P r i m e r用于构建植物双元表达载体。
ESP-FPrimer和ESP-RPrimer用于鉴定IiESP在不同
组织中的表达水平。引物IactinF和IactinR用于参
照基因Actin (GenBank登记号AY870652.1)的表达
分析。
3 RNA提取和cDNA第一链的合成
采集菘蓝的花, 用于RNA提取和cDNA合成。
RNA的提取采用Trizol法。在分离保守区和3′端序
列时, 使用反转录试剂盒PrimeScript® 1st Strand
cDNA Synthesis Kit (Takara)合成cDNA。在分离5′
端序列时, 使用SMARTerTM RACE cDNA Amplifi-
cation Kit (Clontech)合成cDNA。
4 cDNA保守区、5′端和3′端的扩增
在扩增保守区时, PCR反应体系的总体积为
20 μL, 含有10 μL 2×Master Mix、1 μL上游引物
(M1、M2和M3)、1 μL下游引物 (M4、M5和
M6)、1 μL模板cDNA和7 μL ddH2O。PCR扩增条
件为: 94°C预变性10 min; 94°C变性30 s, 48°C退火
30 s, 72°C延伸1 min, 35个循环; 最后在72°C延伸
10 min。
采用巢式Touchdown PCR方法扩增IiESP
cDNA的5′端。第1次PCR反应体系的总体积为50
μL, 含5 μL 10×Advantage2 PCR Buffer、1 μL
dNTP Mix (10 mmol·L-1)、1 μL 50×Advantage2
polymerase Mix (TaKaRa)、34.5 μL PCR-Grade
图1 硫代葡萄糖苷的酶解途径
Fig.1 Enzymolysis pathway of glucosinolate
马燕勤等: 菘蓝环硫指定蛋白基因IiESP的克隆及其编码产物的亚细胞定位 75
Wa t e r、5 μ L 1 0 × U P M ( C l o n t e c h )、1 μ L
10×ESP-5′RPrimer和2.5 μL cDNA模板。PCR扩增
条件为: 94°C 30 s, 72°C 3 min, 5个循环; 94°C 30 s,
70°C 30 s, 72°C 3 min, 5个循环; 94°C 30 s, 68°C
30 s, 72°C 3 min, 25个循环。第2次PCR的模板为
1 μL第1次PCR产物, 上游引物为1 μL 10×NUP
(Clontech), 其他试剂和PCR条件均保持不变。
IiESP cDNA 3′端扩增的PCR反应体系总体积
为25 μL, 含0.25 μL LA Taq DNA polymerase (Ta-
KaRa)、2.5 μL 10×Buffer、2.5 μL dNTP Mix、
0.5 μL oligo dT18引物、0.5 μL ESP-3′RACE引
物、1 μL模板cDNA和17.75 μL ddH2O。PCR扩增
条件: 94°C预变性5 min; 94°C变性30 s, 48°C退火
30 s, 72°C延伸1 min, 32个循环; 72°C再延伸10 min。
从凝胶中回收PCR产物, 与pMD18-T载体连
接, 然后转化到大肠杆菌DH5α菌株中。提取质粒
DNA进行菌落PCR鉴定, 将阳性菌株送到上海生
工生物技术有限公司进行测序。通过NCBI BLAST
在线工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
对测序结果进行同源性搜索 , 使用DNAStar、
DNAMAN等软件包进行序列比对分析。
5 IiESP基因组DNA的扩增
利用CTAB法提取菘蓝基因组DNA, 用于构建
基因组步移文库。利用Universal GenomeWalkerTM
2.0 Kit (Clontech)中提供的4种限制性内切酶分别
切割基因组DNA, 反应条件为37°C酶切16 h。给4
种酶切产物加上接头, 反应条件为4°C连接16 h, 然
后在70°C处理5 min终止反应。文库构建完成后,
需要进行2次PCR。第1次PCR的引物为试剂盒提
供的Adaptor primer1 (AP1)以及来自cDNA的IiESP
特异性引物ESP-Upstream1和ESP-Downstream1。
将纯化的第1次PCR产物作为第二PCR反应的模
板, 第2次PCR反应的引物为试剂盒提供的Adaptor
primer2 (AP2)以及来自cDNA的IiESP特异性引物
ESP-Upstream2和ESP-Downstream2。两次PCR均
为Touchdown PCR。回收第2次PCR产物, 连接至
pMD18-T载体。转化大肠杆菌后提取质粒DNA进
行菌落PCR鉴定, 将阳性菌落送到上海生工生物技
术有限公司进行测序。
6 不同组织中IiESP基因的表达分析
表达分析以根、下胚轴、莲座叶、茎生叶、
茎、茎尖、花序、花、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊
表1 文中用到的引物
Table 1 Primers used in the present work
引物名称 序列(5′→3′) 备注
M1 ATGGGRAGRGGDARRGTBCA 保守区域扩增
M2 ATGGGRAGRGGDARRGTBGA 保守区域扩增
M3 ATGGGRAGRGGDARRATHGA 保守区域扩增
M4 ATSARRGCDACYTCDGCRTC 保守区域扩增
M5 CKYTCNARDATNCKYTCCAT 保守区域扩增
M6 GAGAAGAYGATSARRGCDAC 保守区域扩增
ESP-3′RACE GACATTCTCGAAAAGAAGAG cDNA扩增
ESP-5′RPrimer CTACCGCAGTTGCAAAGACGCTCCTTGC cDNA扩增
ESP-Upstream1 GGGTTGACATCGTCCCGCCTTGGTTC 基因组扩增
ESP-Upstream2 AGTCTCGGGTCCTCCCATCTCACCGAG 基因组扩增
ESP-Downstream1 CTTCGGCAAGGAGCGTCTTTGCAACTGC 基因组扩增
ESP-Downstream2 ACGGTCCAGGGAAGTTGTCTAATGAAGG 基因组扩增
ESP-gfp-FPrimer GCGCCATGGATGAATATTCCATGTAAATTC 载体构建
ESP-gfp-RPrimer GCGACTAGTCGCGGAATTGACTGCGTAGAAG 载体构建
ESP-FPrimer ATGAATATTCCATGTAAATTC 表达分析
ESP-RPrimer TCACGCGGAATTGACTGCGTAG 表达分析
IactinF TATTGTTGGTCGTCCCAGGC Actin检测
IactinR ACGACCACTGGCGTAAAGAG Actin检测
R: 腺嘌呤或鸟嘌呤; D: 非胞嘧啶; B: 非腺嘌呤; H: 非鸟嘌呤; Y: 胞嘧啶或胸腺嘧啶; K: 鸟嘌呤或胸腺嘧啶; S: 胞嘧啶或鸟嘌呤; N: 腺
嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。
植物生理学报76
和短角果为材料。将0.2 g不同材料在液氮中研磨
成粉末状, 用TRIzol试剂提取总RNA, 用反转录试
剂盒PrimeScript® 1st Strand cDNA Synthesis Kit
(TaKaRa)合成cDNA 第一链, 然后进行PCR检测。
PCR体系的总体积为20 μL, 含10 μL 2×Master
Mix、7 μL ddH2O、1 μL ESP-FPrimer、1 μL
ESP-RPrimer和1 μL模板cDNA。PCR扩增条件:
94°C预变性10 min; 94°C变性30 s, 58°C退火30 s,
72°C延伸90 s, 35个循环; 72°C再延伸10 min。用
菘蓝Actin基因作为内参。
7 植物双元表达载体的构建和鉴定
取0.2 g花于液氮中研磨成粉状, 用TRIzol法提
取RNA, 用反转录试剂盒PrimeScript® 1st Strand
cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)反转录生成第一链
cDNA, 作为PCR模板。PCR反应体系的总体积为
20 μL, 含0.4 μL Prime STAR GXL DNA Polymerase
(TaKaRa)、4 μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer、1.6
μL dNTP、11 μL ddH2O、1 μL ESP-gfp-FPrimer、
1 μL ESP-gfp-RPrimer和1 μL cDNA模板。PCR条
件: 94°C预变性10 min; 94°C变性30 s, 60°C退火30
s, 72°C延伸90 s, 35个循环; 72°C再延伸10 min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后, 进行胶回收。
用限制性内切酶BglII和SpeI对扩增产物和植物双
元表达载体pCAMBIA1302进行双酶切, 反应条件
为37°C消化8 h。电泳分离后从琼脂糖凝胶中回收
线性化的pCAMBIA1302载体大片段和IiESP片段,
用T4 DNA连接酶在16°C过夜连接, 然后转化到大
肠杆菌DH5α中。在附加50 mg·L-1卡那霉素的LB
固体培养基上进行选择培养, 对具有Kan抗性的克
隆进行菌落PCR鉴定, 将鉴定正确的菌液送往上海
生工生物技术有限公司进行测序。通过扩大培养
从测序正确的菌落提取质粒DNA, 采用冻融法将
重组质粒转入农杆菌LBA4404菌株, 经菌液PCR检
测后将得到的阳性克隆保存于−70°C。
8 IiESP在本氏烟草叶片细胞中的瞬时表达
对−80°C保存的含有IiESP-gfp融合表达载体
和gfp空载体的根癌农杆菌LBA4404进行划线培
养, 挑取单菌落接种于5 mL含有20 mg·L-1利福
平、50 mg·L-1链霉素和50 mg·L-1卡那霉素的YEB
液体培养基(5 g·L-1蛋白胨、1 g·L-1酵母提取物、
5 g·L-1蔗糖和0.493 g·L-1 MgSO4·7H2O, pH 7.0)中,
180 r·min-1、28°C培养至对数生长期。再以菌液
与培养基1:100的比例扩大培养, 至所需OD值。选
取生长3周的本氏烟草植株叶片, 用75%乙醇擦洗
其下表皮, 用5 mL无针头医用注射器吸取不同浓
度的菌液, 将注射器顶端紧贴住叶片下表面(避开
叶脉), 从下表皮经气孔将菌液缓缓渗入叶片内。
之后将注射过菌液的叶片用锡箔纸包裹, 在人工
气侯室中于22~24°C进行避光培养。在不同的时
间段进行取样, 撕取烟草叶片下表皮, 压片后用激
光共聚焦显微镜观察荧光信号。检测绿色荧光的
激发光波长为488 nm, 发射光波长为625~725 nm。
实验结果
1 IiESP cDNA 3′端和5′端序列的克隆
以菘蓝花cDNA第一链为模板, 利用引物Oligo
dT18和ESP-3′RACE进行PCR扩增, 得到约600 bp
的3′端片段(图2-B), 经测序为628 bp。采用Clon-
tech RACE试剂盒中的引物UPM和菘蓝IiESP基因
的特异性引物ESP-5′RPrimer进行PCR, 扩增得到
约1 000 bp的5′端片段(图2-C), 经测序为945 bp。
对3′端和5′端序列进行拼接, 得到IiESP cDNA全长
序列, 大小为1 315 bp。
2 IiESP基因组序列的克隆
以ESP-Upstream1/2和AP1/2 (Clontech)以及
ESP-Downstream1/2和AP1/2 (Clontech)为引物, 以
经过酶切且连有接头的基因组DNA为模板, 分别
扩增IiESP的启动子区域和下游序列, 得到的片段
长度分别为800 bp (图3-A)和约1 kb (图3-B)。
将回收的片段连接至pMD18-T载体, 转化大
肠杆菌DH5α感受态细胞后进行菌落PCR鉴定。将
阳性克隆送至上海生工生物技术有限公司测序,
得到797 bp的上游启动子区域和945 bp的下游序
列。拼接得到的IiESP基因组序列全长为1 555
bp。基因组、cDNA和编码序列比对结果显示
IiESP基因包含2个外显子和1个内含子(图4)。
3 IiESP编码蛋白的结构分析
以ESP-FPrimer和ESP-RPrimer为引物, 以反转
录生成的cDNA第一链为模板, 扩增IiESP基因的开
放阅读框(ORF), 得到长约1.1 kb的片段(图5-A和
B)。序列分析结果表明, IiESP基因的编码序列长
1 164 bp, 可编码387个氨基酸。利用氨基酸序列
马燕勤等: 菘蓝环硫指定蛋白基因IiESP的克隆及其编码产物的亚细胞定位 77
进行BLAST搜索, 发现IiESP蛋白含有5个Kelch模
块(图6), 同时还能够找到2个重叠的Kelch模块, 每
个Kelch模块由4个串联的β折叠片组成(图7-A)。
进一步通过SWISS-MODEL在线工具(http://swiss-
model.expasy.org/)进行建模分析, 结果显示这些
Kelch模块通过分子内相互作用形成了一个大的球
状超螺线管结构, 即β螺线管结构域(图7-B)。通过
氨基酸序列比对发现 I i E S P蛋白与欧洲菘蓝
ItESP、甘蓝BoESP和拟南芥AtESP的一致性(iden-
tity)很高, 分别为79%、77%和76% (图8)。
4 IiESP基因的表达模式分析
以ESP-FPrimer和ESP-RPrimer为引物, 通过
RT-PCR检测了IiESP在菘蓝不同组织和器官中的
表达水平, 发现IiESP在茎生叶中不表达, 在根、莲
座叶、早期花序、雄蕊、雌蕊和果实中的表达量
较低, 在下胚轴、茎、茎尖、成熟花序、花、萼
片和花瓣中的活性很高(图9)。
5 IiESP蛋白的亚细胞定位
本实验所用的定位载体为pCAMBIA1302, 在
35S启动子和gfp报告基因之间有3个酶切位点, 在
构建融合表达载体时选择了BglII和SpeI两个酶切
位点。在扩增目的片段时, 上游引物5′端引入了
BglII限制性酶切位点, 下游引物5′端引入了SpeI限
制性酶切位点。以菘蓝花cDNA第一链为模板进
行PCR扩增, 得到长约1.2 kb的片段(图10-A)。从
凝胶中回收DNA片段, 用限制性内切酶BglII和
SpeI进行双酶切, 然后连接至用相同限制性内切酶
线性化的pCAMBIA1302空载体中。对转化DH5α
感受态细胞得到的抗性克隆进行菌液PCR鉴定(图
10-B), 对阳性克隆进行测序, 结果显示序列完全正
确。通过液氮冻融法将重组质粒导入LBA4404菌
株, 经菌液PCR鉴定后用阳性克隆(图10-C)进行亚
细胞定位实验。
将OD600为0.8的农杆菌菌液渗入本氏烟草叶
图2 IiESP cDNA的扩增
Fig.2 Amplification of IiESP cDNA
A: Actin cDNA片段的扩增, 其中M为DL5000 DNA Marker, CK为试剂盒阳性对照; B: IiESP cDNA 3′端的扩增, 其中M为DL5000 DNA
Marker, 1和2为3′端目的产物; C: IiESP cDNA 5′端的扩增, 其中M为DL2000 DNA Marker, 1~4分别为IiAP1、IiSEP1、IiSEP3和IiESP基因的
5′端目的产物。
图3 IiESP基因组序列的扩增
Fig.3 Amplification of the genomic DNA of IiESP
A: IiESP基因启动子序列的扩增; B: IiESP基因下游序列的扩增。M: DL5000 DNA Marker; D: 模板为DraI酶切片段; E: 模板为EcoRV
酶切片段; S: 模板为StuI酶切片段; P: 模板为PvuII酶切片段; CK: 试剂盒对照。
植物生理学报78
图4 IiESP基因的结构
Fig.4 The structure of IiESP
马燕勤等: 菘蓝环硫指定蛋白基因IiESP的克隆及其编码产物的亚细胞定位 79
片下表皮, 在避光条件下共培养40 h, 以获得最佳
的瞬时表达效果。通过激光共聚焦显微镜检测荧
光信号, 发现IiESP-GFP融合蛋白产生的绿色荧光
定位在叶绿体中, 可以与叶绿体红色荧光重合(图
11-B、D、F和H)。相反, 空载体中GFP基因表达
产生的绿色荧光分布在细胞质中, 不能与叶绿体
的红色荧光重合(图11-A、C、E和G)。
讨　　论
硫代葡萄糖苷是十字花科植物中一类主要的
含硫次生代谢产物, 在黑芥子酶的催化下可水解
生成异硫氰酸盐、腈类化合物、氰基环硫烷烃类
化合物、硫酸盐、硫元素以及葡萄糖等。这些化
合物中有些对植物防御害虫和微生物病原体十分
重要。另外, 硫代葡糖苷和它的代谢产物也具有
保健活性(Bones和Rossiter 1996)。已有的研究发
现硫代葡萄糖苷及其代谢产物对菜青虫和小菜蛾
等寄主专一性昆虫以及桃蚜和甘蓝夜蛾等杂食性
昆虫均具有抵抗和防御作用(Kim等2008)。根据侧
链化学性质和水解条件的不同, 硫代葡萄糖苷可
以水解形成不同类型的产物。比如, 侧链为脂肪
类的硫代葡萄糖苷在pH=7.0的条件下会水解生成
图5 IiESP基因编码序列的克隆
Fig.5 Cloning of the coding sequence of IiESP
A: 编码序列的扩增, 其中M为DL2000 DNA Marker, 1和2为编码序列; B: 编码序列的菌液PCR鉴定, 其中M为DL5000 DNA Marker, CK
为阴性对照, 1~6为不同的大肠杆菌抗性克隆。
图6 IiESP蛋白的保守性模块
Fig.6 The conserved motifs in IiESP
5种不同颜色代表不同的Kelch模块, 下划线表示2个重叠的Kelch模块。
植物生理学报80
图7 IiESP蛋白的结构分析和建模
Fig.7 Structure analysis and modeling of IiESP
A: 二级结构预测; B: 利用SWISS-MODEL建立的三维结构。
图8 环硫指定蛋白氨基酸序列的多重比对
Fig.8 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of epithiospecifier proteins
IIESP: 菘蓝环硫指定蛋白; ITESP: 欧洲菘蓝环硫指定蛋白(GenBank登记号AFP47625.); ATESP: 拟南芥环硫指定蛋白(GenBank登记号
NP_175806.3); BOESP: 甘蓝环硫指定蛋白(GenBank登记号XP_013587912.1)。
马燕勤等: 菘蓝环硫指定蛋白基因IiESP的克隆及其编码产物的亚细胞定位 81
异硫氰酸酯; 相反, 当pH<7.0或者有亚铁离子存在
时, 则水解产生腈类(Galletti等2001)。植物中的小
分子蛋白ESP对硫代葡萄糖苷-黑芥子酶体系具有
调节作用, 能够作为黑芥子酶的辅助因子间接地
改变硫代葡萄糖苷的水解产物。硫代葡萄糖苷的
R基为烯烃基时, ESP可将硫转移到R基团的烯烃
基末端, 使其形成环硫腈类化合物, 而不是异硫氰
酸盐。也有研究发现ESP能够使带有非烯烃基的
硫代葡萄糖苷转化为简单腈类化合物(Lambrix等
2001)。
本研究克隆了菘蓝IiESP基因, 它的基因组序
列的长度为1 555 bp, 包括2个外显子和1个内含
子。该基因cDNA序列的长度为1 315 bp, ORF序
列的长度为1 164 bp, 可编码387个氨基酸。生物信
息学分析结果显示, IiESP蛋白含有5个Kelch模块,
可以折叠形成一个β螺线管结构域。Kelch重复模
块被认为能够与其他蛋白尤其是黑芥子酶相互作
用, 可以使硫代葡萄糖苷水解形成特殊的腈类化
合物, 但是含有Kelch模块的蛋白质在功能上并不
仅限于此, 它们在各种不同的生物学过程中都能
够发挥作用(Burow等2006; Adams等2000)。通过
半定量RT-PCR发现IiESP在萼片和花瓣中表达水
平很高, 说明ESP蛋白帮助黑芥子酶水解产生的腈
类物质可能对昆虫的毒性较小, 可以促进传粉过
程。通过gfp融合表达载体发现IiESP蛋白定位于
叶绿体中, 这与软件预测结果一致(PSORT WWW
Server, http://psort.hgc.jp/)。
ESP基因的表达也可能与植物对昆虫的防
御、昆虫对寄主的选择以及昆虫的生长发育有
关。硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系统是植物防御虫害
最有效的生化武器, 但是与寡食性昆虫相比, 广食
性昆虫对硫代葡萄糖苷更为敏感(Ahuja等2010)。
例如, 取食野生甘蓝的硫代葡萄糖苷以后, 仅仅使
寡食性的小菜蛾(Plutella xylostella)和菜粉蝶
(Pieris rapae)的发育周期变长, 成年昆虫的体质减
轻, 但可以使广食性的甘蓝夜蛾(Mamestra brassi-
cae)的成活率明显降低(Harvey等2007)。
除此之外, 有些寡食性昆虫还将硫代葡萄糖
苷作为其营养物质。例如大菜粉蝶(Pieris brassi-
cae)不仅喜欢在硫代葡萄糖苷含量较高的黑芥
(Brassica nigra)花上取食, 与此同时它们的生长速
度也会达到最大(Smallegange等2007)。目前, 大部
分学者认为寡食十字花科植物的昆虫是通过硫代
葡萄糖苷的挥发性代谢物, 如异硫氰酸盐、腈类
图9 IiESP的表达模式分析
Fig.9 Expression pattern analysis of IiESP
R: 根; H: 下胚轴; Rl: 莲座叶; Cl: 茎生叶; S: 茎; St: 茎尖; Fb: 早期花序; IF: 花序; F: 花; Se: 萼片; Pe: 花瓣; St: 雄蕊; Pi: 雌蕊; Si: 短角果。
图10 IiESP-gfp融合表达载体的构建
Fig.10 Construction of IiESP-gfp fusion expression vector
A: IiESP编码序列的扩增, 其中M为DL2000 DNA Marker, 1和2为含酶切位点的目的片段; B: 大肠杆菌DH5α的菌液PCR鉴定, 其中CK
为阴性对照, 1~6为抗性克隆, M为DL2000 DNA Marker; C: 农杆菌LBA4404的菌液PCR鉴定, 其中CK为阴性对照, 1~4为抗性克隆。
植物生理学报82
图11 IiESP蛋白的亚细胞定位
Fig.11 The subcellular localization of IiESP
A和B: 明视野与GFP荧光叠加; C和D: GFP荧光; E和F: 叶绿体荧光; G和H: 叶绿体荧光与GFP荧光叠加; A、C、E和G: pCAMBIA1302
空载体; B、D、F和H: IiESP-gfp融合表达载体。
马燕勤等: 菘蓝环硫指定蛋白基因IiESP的克隆及其编码产物的亚细胞定位 83
化合物等, 对远距离的寄主进行定向(Städler和
Reifenrath 2009)。小菜蛾成虫夜间活动主要依靠
嗅觉进行寄主定向, 挥发性的异硫氰酸盐在小菜
蛾产卵时对寄主的选择过程中发挥着重要作用
(Dai等2008)。相反, 为了降低后代的同种竞争压
力, 菜粉蝶会在没有损害或没有同类卵的寄主植
株上产卵。这是因为虫害后植物体内的硫代葡萄
糖苷被水解形成挥发性的腈类化合物, 这些化合
物对菜粉蝶具有驱除作用(Little等2007)。与此一
致, 过量表达环硫指定蛋白的转基因拟南芥以及
外施吲哚-3-乙腈的拟南芥都不能吸引菜粉蝶雌虫
(de Vos等2008; Mumm等2008)。
通过本研究我们得到了菘蓝环硫指定蛋白基
因IiESP, 并分析了其表达模式及其编码蛋白的结
构与亚细胞定位特征。这不仅为后续菘蓝ESP蛋
白的原核表达提供了研究基础, 而且为更进一步
研究药用植物菘蓝对生物胁迫的防御机制提供了
理论依据。
参考文献
Adams J, Kelso R, Cooley L (2000). The kelch repeat superfamily of
proteins: propellers of cell function. Trends Cell Biol, 10 (1):
17–24
Ahuja I, Rohloff J, Bones AM (2010). Defence mechanisms of Bras-
sicaceae: implications for plant-insect interactions and potential
for integrated pest management. A review. Agron Sustain Dev,
30 (2): 311–348
Bernardi R, Negri A, Ronchi S, Palmieri S (2000). Isolation of
the epithiospecifier protein from oil-rape (Brassica napus ssp.
oleifera) seed and its characterization. FEBS Lett, 467 (2–3):
296–298
Bones AM, Rossiter JT (1996). The myrosinase-glucosinolate system,
its organisation and biochemistry. Physiol Plant, 97 (1): 194–208
Brandt W, Backenköhler A, Schulze E, Plock A, Herberg T, Roese E,
Wittstock U (2014). Molecular models and mutational analyses
of plant specifier proteins suggest active site residues and reac-
tion mechanism. Plant Mol Biol, 84 (1–2): 173–188
Burow M, Müller R, Gershenzon J, Wittstock U (2006). Altered
glucosinolate hydrolysis in genetically engineered Arabidopsis
thaliana and its influence on the larval development of Spodop-
tera littoralis. J Chem Ecol, 32 (11): 2333–2349
Buxdorf K, Yaffe H, Barda O, Levy M (2013). The effects of gluco-
sinolates and their breakdown products on necrotrophic fungi.
PLoS ONE, 8 (8): e70771
Dai J, Deng J, Du J (2008). Development of bisexual attractants for
diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae)
based on sex pheromone and host volatiles. Appl Entomol Zool,
43 (4): 631–638
de Vos M, Kriksunov KL, Jander G (2008). Indole-3-acetonitrile pro-
duction from indole glucosinolates deters oviposition by Pieris
rapae. Plant Physiol, 146 (3): 916–926
Foo HL, Grønning LM, Goodenough L, Bones AM, Danielsen BE,
Whiting DA, Rossiter JT (2000). Purification and characterisa-
tion of epithiospecifier protein from Brassica napus: enzymic
intramolecular sulphur addition within alkenyl thiohydroximates
derived from alkenyl glucosinolate hydrolysis. FEBS Lett, 468
(2–3): 243–246
Galletti S, Bernardi R, Leoni O, Rollin P, Palmieri S (2001). Prepara-
tion and biological activity of four epiprogoitrin myrosinase-de-
rived products. J Agric Food Chem, 49 (1): 471–476
Halkier BA, Gershenzon J (2006). Biology and biochemistry of
glucosinolates. Annu Rev Plant Biol, 57: 303–333
Harvey JA, Gols R, Wagenaar R, Bezemer TM (2007). Development
of an insect herbivore and its pupal parasitoid reflect differences
in direct plant defense. J Chem Ecol, 33 (8): 1556–1569
Kim JH, Lee BW, Schroeder FC, Jander G (2008). Identification
of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant
effects on myzus persicae (green peach aphid). Plant J, 54 (6):
1015–1026
Kissen R, Hyldbakk E, Wang CWV, Sørmo CG, Rossiter JT, Bones
AM (2012). Ecotype dependent expression and alternative splic-
ing of epithiospecifier protein (ESP) in Arabidopsis thaliana.
Plant Mol Biol, 78 (4–5): 361–375
Kliebenstein DJ, Kroymann J, Mitchell-Olds T (2005). The gluco-
sinolate–myrosinase system in an ecological and evolutionary
context. Curr Opin Plant Biol, 8 (3): 264–271
Lambrix V, Reichelt M, Mitchell-Olds T, Kliebenstein DJ, Gershenzon
J (2001). The Arabidopsis epithiospecifier protein promotes the
hydrolysis of glucosinolates to nitriles and influences Trichoplu-
sia ni herbivory. Plant Cell, 13 (12): 2793–2807
Little D, Gouhier-Darimont C, Bruessow F, Reymond P (2007). Ovi-
position by pierid butterflies triggers defense responses in Arabi-
dopsis. Plant Physiol, 143 (2): 784–800
Matusheski NV, Swarup R, Juvik JA, Mithen R, Bennett M, Jeffery
EH (2006). Epithiospecifier protein from broccoli (Brassica
oleracea L. ssp. italica) inhibits formation of the anticancer
agent sulforaphane. J Agric Food Chem, 54 (6): 2069–2076
Mumm R, Burow M, Bukovinszkine’Kiss G, Kazantzidou E, Witt-
stock U, Dicke M, Gershenzon J (2008). Formation of simple
nitriles upon glucosinolate hydrolysis affects direct and indirect
defense against the specialist herbivore, Pieris rapae. J Chem
Ecol, 34 (10): 1311–1321
Rodman JE, Soltis PS, Soltis DE, Sytsma KJ, Karol KG (1998).
Parallel evolution of glucosinolate biosynthesis inferred from
congruent nuclear and plastid gene phylogenies. Am J Bot, 85 (7):
997–1006
Slabaugh MB, Cooper LD, Kishore VK, Knapp SJ, Kling JG (2015).
Genes affecting novel seed constituents in Limnanthes alba
Benth: transcriptome analysis of developing embryos and a new
genetic map of meadowfoam. PeerJ, 3: e915
Smallegange RC, van Loon JJA, Blatt SE, Harvey JA, Agerbirk N,
Dicke M (2007). Flower vs. leaf feeding by Pieris brassicae:
植物生理学报84
Cloning of the epithiospecifier protein gene IiESP from Isatis indigotica
and subcellular localization of the encoding product
MA Yan-Qin, LI Dian-Zhen, YAO Jing-Wen, LI Qi, XU Zi-Qin*
Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education; Shaanxi Provincial Key Labo-
ratory of Biotechnology; College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China
Abstract: In order to investigate the biological functions of epithiospecifier proteins (ESPs) in specifying the
enzymolysis products of glucosinolate in cruciferous plants, the cDNA and the genomic DNA sequences of
IiESP were cloned from Isatis indigotica at first, and the expression patterns of this gene were characterized
subsequently. Then the subcellular localization of IiESP was determined by using the GFP tag and the three-
dimensional structure of IiESP was predicted based on the amino acid sequences. The results show that IiESP
contains two exons and one intron, and its genomic DNA, cDNA and open reading frame (ORF) are 1.555,
1.315 and 1.164 bp in length, respectively. IiESP is constituted by 387 amino acid residues and contains 5 Kelch
motifs which can fold into a spherical super-solenoid structure. Multiple alignments of the amino acid sequenc-
es indicate that the identities of IiESP with ItESP of Isatis tinctoria, AtESP of Arabidopsis thaliana and BoESP
of Brassica olerace are 79%, 76% and 77%, respectively. By agroinfiltration method, IiESP was confirmed to
be located in chloroplasts after transient expression in leaf epidermal cells of Nicotiana benthamiana. RT-PCR
analyses showed that IiESP was mainly expressed in hypocotyl, stem, early inflorescence, mature inflorescence,
flower, sepal and petal, and its higher activity in perianth was probably associated with insect attraction and
entomophilous pollination.
Key words: Isatis indigotica; epithiospecifier protein; expression analysis; subcellular localization; Kelch motif
Received 2015-10-15 Accepted 2015-12-14
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 30870194 and J1210063), the Research Project of
Provincial Key Laboratory of Shaanxi (Grant Nos. 15JS111, 12JS103 and 2010JS090), and the Graduate Research Project of Northwest University
(Grant Nos. YZZ13068 and YZZ14076).
*Corresponding author (E-mail: ziqinxu@nwu.edu.cn).
glucosinolate-rich flower tissues are preferred and sustain higher
growth rate. J Chem Ecol, 33 (10): 1831–1844
Städler E, Reifenrath K (2009). Glucosinolates on the leaf surface
perceived by insect herbivores: review of ambiguous results and
new investigations. Phytochem Rev, 8 (1): 207–225
Tookey HL (1973). Crambe thioglucoside glucohydrolase (EC
3.2.3.1): separation of a protein required for epithiobutane for-
mation. Can J Biochem, 51 (12): 1654–1660
Verhoeven DTH, Verhagen H, Goldbohm RA, van den Brandt PA, van
Poppel G (1997). A review of mechanisms underlying anticar-
cinogenicity by brassica vegetables. Chem-Biol Interact, 103 (2):
79–129
Wang Z, Tan XL, Zhang ZY, Gu SL, Li GY (2012). Sequence analysis
and induced expression of epithiospecific protein (ESP) from
Brassica napus. Food Sci, 33 (7): 209–214 (in Chinese with En-
glish abstract) [王政, 谭小力, 张志燕, 顾守来, 李冠英(2012).
甘蓝型油菜表皮特异硫蛋白(ESP)的序列分析及其诱导表达.
食品科学, 33 (7): 209–214]
Wittstock U, Kliebenstein DJ, Lambrix V, Reichelt M, Gershenzon
J (2003). Glucosinolate hydrolysis and its impact on generalist
and specialist insect herbivores. In: Romeo JT (ed). Integrative
Phytochemistry: from Ethnobotany to Molecular Ecology: Re-
cent Advances in Phytochemistry. Vol. 37. Amsterdam: Elsevier,
101–125