全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (6): 597~604 597
收稿 2012-03-15　　修定 2012-05-25
资助 国家自然科学基金(30900789)和国家自然科学基金委员
会-广东省人民政府联合基金(U0631001)。
* 通讯作者(E-mail: wangxj@scnu.edu.cn; Tel: 020-85216417)。
拟南芥漆酶基因AtLAC2调控植物生长发育的研究
张盛春, 张玉平, 王小菁*
华南师范大学生命科学学院广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州510631
摘要: 拟南芥漆酶基因家族有17个成员, 但其功能还不清楚。本文采用过量表达的方法初步分析了拟南芥漆酶基因At-
LAC2的功能。GUS染色显示AtLAC2在拟南芥不同生长发育时期的多个组织和器官中都有较强的表达, 且在叶片和茎尖中
的表达最强。AtLAC2的过量表达植株开花时间推迟, 花序轴分枝变多, 叶片变小。以上结果表明AtLAC2基因在调控植物
生长发育中具有重要作用。
关键词: 拟南芥; AtLAC2; 分枝; 开花; 漆酶
Arabidopsis thaliana Laccase Gene AtLAC2 Regulates Plant Growth and De-
velopment
ZHANG Sheng-Chun, ZHANG Yu-Ping, WANG Xiao-Jing*
Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences, South China Normal
University, Guangzhou 510631, China
Abstract: There are 17 genes in Arabidopsis laccase gene family. However, their functions have not been clear-
ly demonstrated. The present study analyzed the function of the AtLAC2 gene by over-expressing it in the wild-
type plants. The GUS staining results showed that AtLAC2 was strongly expressed in various organs and tissues
during different developmental periods, especially in the leaf and shoot apex. AtLAC2 over-expressing plants
showed delayed flowering time, increased primary branches, and decreased leaf size. These results suggest that
AtLAC2 may play important roles in regulating plant growth and development.
Key words: Arabidopsis thaliana; AtLAC2; branches; flowering; laccase
漆酶(EC 1.10.3.2)于1883首次从日本漆树
(Rhus venicifera)的汁液中被分离, 并由此而得名,
属于铜蓝氧化酶蛋白家族的一员, 该家族还包括
人体血浆铜蓝蛋白(EC 1.10.3.1)和植物抗坏血酸氧
化酶(EC 1.10.3.3) (Pourcel等2005)。漆酶广泛分布
于植物和真菌, 真菌漆酶在木质素降解(Eggert等
1997)、色素的合成(Aramayo和Timberlake 1990)、
增强病原菌毒力(Salas等1996)方面起着重要作用,
植物漆酶参与木质素的合成 (Dean和Eriksson
1994)以及对胁迫环境的适应等过程(Cai等2006)。
拟南芥中漆酶基因家族(laccase gene family)
有17个成员, 分别位于第1、2、3、5号染色体上,
在木质化组织中表达量较高(Sato等2001), 17个成
员中, 16个都在根中表达(McCaig等2005)。Turla-
pati等(2011)对拟南芥的17个漆酶基因成员的表达
进行了详细研究, 发现它们的时空表达有很大差
异。近年来, 采用反向遗传学的方法对部分漆酶
基因的功能进行了研究, 发现AtLAC8的突变体lac8
开花早于野生型(Liang等2006), AtLAC15/TT10的缺
失突变体种子颜色变成淡黄色或者乳白色(Pourcel
等2005)。目前, 有关植物漆酶基因功能的研究还
较少, 以上有限的研究结果为漆酶家族基因功能
多样性提供了重要依据(Zhou等2009)。
AtLAC2 (Arabidopsis thaliana LACCASE 2)位
于拟南芥第2号染色体上, 其在拟南芥信息资源网
(TAIR)中的基因登录号为At2g29130。Cai等(2006)
对拟南芥突变体的研究发现, AtLAC2的缺失突变
植株在正常条件和75 mmol·L-1氯化钠胁迫下没有
表现出异常; 在20%聚乙二醇(polyethylene glycol,
PEG)诱导的高渗胁迫条件下, 缺失突变体的根比
植物生理学报598
野生型的短。
虽然目前已有一些有关漆酶基因缺失突变体的
研究, 但由于拟南芥漆酶基因家族共有17个成员,
各成员在功能上可能存在冗余, 因此采用过量表达
的方法来研究漆酶基因的功能是阐明漆酶家族基
因在植物生长发育中功能的一种重要途径。
本文采用转基因方法构建了拟南芥漆酶基因
AtLAC2启动子驱动GUS基因表达的转基因植物
pAtLAC2:GUS以及35S启动子驱动AtLAC2表达的
AtLAC2过量表达植株35S:AtLAC2, 通过分析At-
LAC2基因的表达模式以及AtLAC2过量表达植株
的表型来研究AtLAC2基因在拟南芥生长发育中的
功能。
材料与方法
1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia-0生
态型。拟南芥种子先用70%乙醇溶液表面消毒30 s
后, 加入10%次氯酸钠消毒10 min, 无菌水冲洗4~5
次后均匀铺种于MS平板上。4 ℃下保湿黑暗冷藏
3 d打破休眠后, 移至拟南芥培养房中培养, 培养10
d后移至土壤中生长, 培养温度为(22±2) ℃, 光暗周
期为16 h光照 /8 h黑暗 , 光照强度为120~150
μmol·m-2·s-1。
2 方法
2.1 转基因拟南芥的获得
GUS基因的植物表达载体为pCAMBIA1303,
利用引物5′-TGTGAGCTCTGGTTAGTAAATTGT-
GTATG-3′和5′-TTACCATGGACGTAACCATGT-
TCAATATTTG-3′把含有目的启动子连接的T载体
克隆, 测序正确的启动子片段用SacI和NcoI双酶切
后, 与经相同酶切后的植物表达载体连接。过量
表达载体为改造过的pCAMBIA1390, 利用引物
5′-AGTTCTAGAATTGAACATGGTTACGTGG-3′
和5′-ACTGGATCCTCAACATTTAGGGAAATC-3′
把AtLAC4基因的编码序列(CDS)连接到T载体克
隆, 测序正确的基因片段用XbaI和BamHI双酶切
后, 与经相同酶切后的植物表达载体连接。分别
以pCAMBIA1303和pCAMBIA1390质粒为对照,
连接后的质粒转化农杆菌LBA4404, 采用花粉管
浸泡法转化拟南芥, 潮霉素筛选转基因植株并用
PCR进行检测, 幼苗黄绿比为1:3的单位点插入的
纯合转基因株系用于后续实验。
2.2 半定量RT-PCR
采用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA后, 用
DNaseI (TaKaRa)处理以消除基因组DNA的污染。
定量后取等量的RNA用PrimeScriptTM反转录试剂
盒(TaKaRa进行cDNA第一链合成, 再取等量的
cDNA为模板进行PCR反应。PCR反应总体系为25
μL, 包括10×PCR缓冲液(含Mg2+, TaKaRa) 2.5 μL、
cDNA模板2 μL、2.5 mmol·L-1的dNTP混合物(Ta-
KaRa) 2 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL、
Taq DNA聚合酶(TaKaRa) 0.25 μL、双蒸水17.25
μL。反应条件为: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30
s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 26个循环。取15
μL PCR产物进行电泳检测。
检测目的基因AtLAC2的引物为5′-AATTC-
CCAGGACCTAGAGTTACCGC-3和5′-AAGGT-
CACCGTCCAAAACAACCC-3′; 内参Actin基因的
引物为5′-GTATGTGGCTATTCAGGCTGT-3′和
5′-CTGGCGGTGCTTCTTCTCTG-3′。
2.3 GUS组织化学染色
参考Jefferson等(1987)的方法, 略有改动。在
含有1 mmol·L-1 EDTA、0.1% Triton X-100、100
μg·mL-1氯霉素、2 mmol·L-1铁氰化钾、2 mmol·L-1
亚铁氰化钾的50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)中加
入100 mg·mL-1 X-Gluc母液(N,N-二甲基甲酰胺溶
解), 使X-Gluc终浓度为1 mg·mL-1。取幼苗或组织
剪成小块置于1 mL配制好的上述染色液中, 37 ℃
温育12 h, 期间摇动数次, 70%乙醇脱色至透明, 在
Nikon显微镜下(10×10倍)观察并拍照。X-Gluc为
Genview公司产品。
2.4 木质素含量的测定
参考Zhou等(2009)的方法。取生长40 d植株
的地上部分, 在液氮中研磨成粉末后用70%乙醇在
70 ℃条件下提取。60 ℃真空干燥后, 样品在170 ℃
条件下用4 mol·L-1的氢氧化钠水解2 h。水解产物
用2 mol·L-1的盐酸酸化至pH=2.0后, 所释放出的木
质素单体用乙醚提取并真空干燥。干燥后的残留
物用吡啶和N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺溶解后,
再用气-液色谱对其中的酚类物质进行分析。酚类
化合物的结构通过比较与标准样品的保留时间来
张盛春等: 拟南芥漆酶基因AtLAC2调控植物生长发育的研究 599
进行鉴定。所有的样品均进行2次分析。G-型木
质素(愈创木基木质素)为香兰素、乙酰香兰素以
及香草酸的总和, S-型木质素(紫丁香基木质素)是
丁香醛、乙酰丁香醛和丁草酸的总和, 总木质素
含量为G-型和S-型木质素之和。
2.5 表型分析
开花标准按Boyes等(2001)所分时期的5.10期,
即第一个花芽可见时期(抽薹)。采用绝对时间(播
种至抽薹的天数)和相对时间(抽薹时莲座叶的数
目)统计分析。株高的测量采用游标卡尺, 测量培
养面到植株最高点(通常为植株顶端的花序)的距
离。采用游标卡尺测量所选择植株的第6~9片真
叶, 每个转基因株系测量8株, 计算总的叶长(含叶
柄)平均数。以野生型为对照, 观察转基因植株及
突变体在不同生长发育时期的生长状况, 拍照并
测定相关数据。所有表型分析实验均在相同条件
下进行3次生物学重复。
实验结果
1 转基因植株的获得
采用常规的载体构建方法把拟南芥漆酶基因
AtLAC2启动子构建到植物表达载体pCAMBIA1303
中, 把AtLAC2基因的CDS构建到改造过的植物表
达载体pCAMBIA1390中。将上面构建成功的植
物表达载体转化农杆菌后, 采用农杆菌浸泡法将
上述构建的两种载体及空载体分别转入野生型拟
南芥中, 转化植株收种后用含潮霉素的MS平板筛
选种子, 能够正常长出真叶和根的绿苗为拟转基
因植株, 经过几代黄绿苗分离比例鉴定, 直到全
部长出绿苗为止。最终得到13个pAtLAC2:GUS转
基因纯合株系, 其中5个为黄绿比为1:3的单位点插
入; 35S:AtLAC2转基因纯合株系共有25个, 其中有
13个为单位点插入。
2 AtLAC2的时空表达模式
采用AtLAC2基因启动子与GUS报告基因融合
表达系统研究了AtLAC2基因的时空表达模式。将
长日照条件下萌发36 h的pAtLAC2:GUS转基因纯
合植株的幼苗或者生长14 d的转基因幼苗进行
GUS染色的结果表明, 前者中, AtLAC2在子叶叶脉
及根维管束中表达明显(图1-A); 后者中, AtLAC2在
子叶和真叶的叶脉及维管束都有非常强的表达,
且在真叶的叶尖和叶缘排水器中的表达尤为明显
(图1-B和C), 同时, AtLAC2在茎尖分生组织和叶柄
(图1-D)以及主根和侧根维管组织(图1-E和F)中也
有较强的表达。进一步取生长45 d的pAtLAC2:GUS
转基因植株的花器官进行GUS染色, 发现AtLAC2
在花萼(图1-G)、雌蕊柱头(图1-H)以及花丝(图1-I)
中均有较明显的表达。以上结果表明AtLAC2在拟
南芥多个组织器官中均有表达。
3 AtLAC2过量表达抑制开花
为了研究AtLAC2在调控植物生长发育中的功
能, 我们将野生型拟南芥(Col)与纯合35S:AtLAC2
转基因株系的种子同时播种培养, 研究它们在整
个生长发育过程中的表型差异。结果表明, 与野
生型和转化空载体的转基因植株相比, 生长40 d的
13个单位点插入的35S:AtLAC2转基因纯合株系均
表现出不同程度的晚花、植株矮小以及初级花序
轴分枝增多的表型(图2-A), 取不同程度表型的株
系进行基因表达分析, 发现所有35S:AtLAC2植株
中AtLAC2的表达均明显升高, 并且表型越明显的
株系AtLAC2的表达越强(图2-B), 其中有5个株系的
表型非常一致, 初级花序轴分枝较多, 植株矮小呈
丛生状。
选取表型明显的3个35S:AtLAC2转基因株系
(#4、#11、#13)进行具体的表型分析。从图3可以
看出, 萌发后生长35 d时, 野生型植株已经抽出较
长的花薹, 而AtLAC2过量表达植株则刚开始抽薹
或者还未见抽薹。
拟南芥的开花时间通常用抽薹时间或者开花
时的莲座叶数目来表示, 抽薹时莲座叶数目越多
则表示开花越晚。通过对野生型及所选的3个At-
LAC2基因过量表达植株的抽薹时间及开花时莲座
数目的测定, 发现野生型的抽薹时间为26.69 d, 而
35S:AtLAC2转基因株系#4、#11、#13的抽薹时间
分别为30.63、30.44、31.56 d, 平均比野生型晚4 d
左右; 3个转基因株系的开花时莲座叶数目均比野
生型多2.5片左右(表1)。表明AtLAC2基因的过量
表达能够明显推迟拟南芥的开花时间。
4 AtLAC2过量表达促进植物的初级分枝
拟南芥抽薹开花后, 主花序轴快速生长, 生长
到一定高度后莲座叶中的腋芽打破休眠生长成为
初级分枝。一些基因突变后会促进拟南芥莲座叶
植物生理学报600
图2 AtLAC2过量表达植株的表型和分子鉴定
Fig.2 Phenotype and molecular identification of the AtLAC2 over-expressing plants
A: AtLAC2过量表达植株的表型; B: RT-PCR检测AtLAC2基因的表达。Col: 野生型植株; Vec: 转化空载体的转基因植株; #2、#5、
#1、#7、#4、#11: AtLAC2过量表达株系。
图1 pAtLAC2:GUS转基因植株的GUS组织化学染色
Fig.1 Histochemical localization of GUS activity in pAtLAC2:GUS transgenic plants
A: 萌发36 h的幼苗; B~F: 生长14 d幼苗的子叶(B)、莲座叶(C)、茎尖分生组织(D)、根维管组织(E和F); G~I: 生长45 d植株的花萼
(G)、柱头(H)、花丝(I)。标尺=200 mm。
张盛春等: 拟南芥漆酶基因AtLAC2调控植物生长发育的研究 601
5 AtLAC2过量表达影响莲座叶的生长发育
从图2~4中均可以看出, 无论是生长35 d还是
生长40 d的35S:AtLAC2转基因植株的莲座大小均
明显比野生型要小, 而拟南芥莲座的大小主要是
由第6~9片莲座叶所决定的, 因此, 我们推测At-
LAC2的过量表达可能影响了叶的生长发育。对生
长35 d的野生型与AtLAC2过量表达植株第6~9片
莲座叶拍照观察的结果显示, 35S:AtLAC2转基因
植株的莲座叶明显比野生型的要小(图5)。
进一步对生长35 d的野生型与转基因植株4个
叶片(第6~9片莲座叶)的叶长、叶宽以及长宽比进
行统计的结果显示, 35S:AtLAC2转基因株系#4、
#11、#13的叶长分别为0.74、0.73和0.74 cm, 叶宽
分别为0.60、0.65和0.58 cm, 叶的长宽比分别为
1.25、1.15和1.27; 而野生型植株叶长为1.16 cm, 叶
宽为0.81 cm, 叶的长宽比为1.43 (表3)。可见, At-
LAC2过量表达后能导致莲座叶变短、变窄, 且莲
座叶的长宽比变小。
6 AtLAC2过量表达降低植株木质素含量
目前已报道的漆酶基因功能大都与木质素的
腋芽即初级分枝的生长, 具体表现为主花序轴开
始生长的同时, 莲座叶腋芽也随即打破休眠开始
生长, 主花序轴的生长受到明显的抑制, 初级花序
轴分枝增多, 最后植株表现为矮化、丛生状。从
图3中可以看出, 生长35 d的野生型只有主花序轴
的生长而未见莲座叶腋芽的生长 , 但是同期的
35S:AtLAC2转基因植株却有2~3个花序轴与主花
序轴同时生长; 生长40 d的转基因植株表型更加明
显(图4)。
图4 AtLAC2基因促进拟南芥初级分枝
Fig.4 AtLAC2 gene promotes primary branching in Arabidopsis
Col: 野生型植株; #4、#11、#13: AtLAC2过量表达植株株系。
表1 35S:AtLAC2转基因株系的抽薹时间及抽薹时莲座叶数
Table 1 Bolting time and rosette leaf number of the
35S:AtLAC2 transgenic plants
基因型 抽薹时间/d 莲座叶数/片
Col 26.69±2.02 12.13±1.13
35S:AtLAC2 #4 30.63±1.71 14.90±2.85
35S:AtLAC2 #11 30.44±2.47 14.88±1.46
35S:AtLAC2 #13 31.56±2.25 14.63±1.20
通过对生长40 d的野生型及35S:AtLAC2转基
因株系的株高及初级花序轴数进行统计, 发现At-
LAC2过量表达植株与野生型相比, 花序轴数目明
显增多, 每株转基因植株均超过3个花序轴, 而同
期的野生型则基本只有1个花序轴, 极个别的野生
型植株能够从莲座叶腋芽处长出1个较短的分枝
(表2)。
表2 生长40 d植株的初级分枝数
Table 2 The primary branch number of 40-day-old plants
基因型 花序轴数/个
Col 1.2±0.40
35S:AtLAC2 #4 3.0±0.63
35S:AtLAC2 #11 3.2±1.30
35S:AtLAC2 #13 3.2±0.83
图3 AtLAC2基因抑制拟南芥开花时间
Fig.3 AtLAC2 gene inhibits Arabidopsis flowering time
A: AtLAC2过量表达植株开花时间变晚; B: RT-PCR检测At-
LAC2基因的表达。Col: 野生型植株; #4、#11、#13: AtLAC2过量
表达植株株系。
植物生理学报602
表3 生长35 d植株的叶长和叶宽
Table 3 The leaf length and width of 35-day-old plants
基因型 叶长/cm 叶宽/cm 叶长/叶宽
Col 1.16±0.18 0.81±0.18 1.43±0.09
35S:AtLAC2 #4 0.74±0.11 0.60±0.20 1.25±0.17
35S:AtLAC2 #11 0.73±0.26 0.65±0.33 1.15±0.19
35S:AtLAC2 #13 0.74±0.30 0.58±0.22 1.27±0.06
表4 AtLAC2过量表达植株的木质素含量
Table 4 Lignin content in the AtLAC2 over-expressing plants
植株种类 G-型木质素/mg·g-1 (FW) S-型木质素/mg·g-1 (FW) 总木质素/mg·g-1 (FW)
Col 34.78±0.63 23.17±0.49 57.95 (100%)
Vec 35.43±0.27 24.04±0.31 59.47 (103%)
35S:AtLAC2 #4 23.56±0.53 13.52±0.86 37.08 (64%)
35S:AtLAC2 #11 20.17±0.44 12.61±1.25 32.78 (57%)
35S:AtLAC2 #13 19.81±0.08 10.16±1.72 29.97 (52%)
合成有关, 因此我们推测AtLAC2过量表达植株出
现的晚花、植株矮小、叶片变小等表型可能也与
木质素含量的改变有关。采用色谱方法测定了生
长40 d植株地上组织中的G-型和S-型木质素含量,
与野生型及转化空载体的对照植株相比, AtLAC2过
量表达植株中的木质素含量明显降低, 最低的只有
野生型的52% (表4)。以上结果表明, AtLAC2可能
通过影响木质素的合成来影响植物的生长发育。
讨　　论
目前有关漆酶基因功能及其作用机制的研究
还较少, 除了Liang等(2006)发现AtLAC2的缺失突
变在PEG诱导条件下能够影响植株根的发育外, 有
关AtLAC2的过量表达及AtLAC2基因其他方面的功
能研究还未见报道。GUS组织化学染色结果发现
AtLAC2基因在多个组织器官中均有表达, 尤其在
茎尖分生组织区及叶中的表达最为明显(图1)。
AtLAC2过量表达转基因研究结果显示, 大部分
35S:AtLAC2植株均表现出莲座叶变小(图5和表
3)、开花时间变晚(图3和表1)及初级分枝数目增
多(图4和表2)的表型, 而开花及分枝均与植物的茎
尖分生组织密切相关。AtLAC2基因在植物幼苗根
中的表达相对较弱, 我们用其缺失突变体以及过
量表达植株的幼苗, 观察正常培养及PEG胁迫条件
下根发育的变化, 但是并没有出现明显表型(结果
未列出)。由此可见, AtLAC2基因的功能与其表达
部位及表达强度基本一致。
在漆酶家族中, 目前已有证据表明漆酶基因
AtLAC4与植物木质素合成相关(Zhou等2009), At-
LAC4与AtLAC17的双缺失突变体lac4 lac17在连续
光照条件下茎维管束中的木质素含量降低, 植株
变矮(Berthet等2011)。最近还有研究报道一个细
胞壁蛋白通过调控植物的木质素含量来影响植物
的开花时间(Shi等2011)。木质素是维管组织细胞
次生壁的重要组分, 主要储存在次生细胞壁中, 影
响维管的发育(Boerjan等2003); 木质部中木质素的
图5 AtLAC2基因影响莲座叶的生长发育
Fig.5 AtLAC2 gene affects t growth and
development of rosette leaves
6~9表示第6~9片莲座叶。
张盛春等: 拟南芥漆酶基因AtLAC2调控植物生长发育的研究 603
含量对植物次生细胞壁的形成、植物的维管系统
以及细胞的分裂分化密切相关(Scheres等1995;
Zhong等1997; Caño-Delgado等2000), 如果植物中
木质素含量降低, 细胞的分化进程则会被推迟。
而植物的维管组织起源于原形成层细胞, 这些细
胞来源于植物的顶端分生组织, 因此, 木质素合成
及含量的改变最终会影响到植物茎尖顶端分生组
织细胞的分裂与分化, 木质素含量降低后茎尖分
生组织细胞分裂能力加强, 分化速度减弱(Fukuda
2004)。研究结果表明, AtLAC2基因过量表达后植
株的木质素含量明显降低, 甚至只有野生型与转
基因对照植株的一半(表4), 因此我们推测AtLAC2
基因过量表达所出现的植物矮化、分枝增多以及
叶片形态发生改变等表型可能是由于转基因植株
的木质素含量降低所致, AtLAC2基因过量表达引
起植物木质素含量降低后导致植物茎尖分生组织
以及维管系统发育的改变 , 从而使植株出现晚
花、矮小、叶片形状改变的表型。另外, 木质素
含量降低后能够引起AtLAC2过量表达植株茎尖分
生区的细胞分化能力降低, 分裂能力增强, 从而导
致分枝数的增多。因此, AtLAC2基因可能与漆酶
家族中的其他成员如AtLAC4具有相反的生物学功
能, 是木质素合成及次生壁形成的负调控因子, 其
调控表型形成的具体机制还需要利用细胞生物学
及分子生物学手段进行详细的研究才能阐明。
另外, 由于植物矮化、分枝增多以及莲座叶
叶形变化的表型与植物生长素有密切关系, 而生
物信息学分析发现在AtLAC2基因的启动子区域存
在较多的生长素相关的顺式作用元件(结果未列
出), 因此, 研究AtLAC2与生长素的关系对于进一
步阐明AtLAC2基因调控植物生长发育的机制将至
关重要。
目前, 有关漆酶基因调控植株分枝和叶片发
育的研究还未见报道, 并且对拟南芥漆酶基因功
能及其作用的分子机制的研究还不是很深入, 因
此, 在将来的研究中, 利用分子生物学来揭示At-
LAC2基因的作用机制能够为植物漆酶家族基因的
研究提供重要的理论依据。
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