全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 785
收稿 2009-05-27 修定 　2009-06-22
资助 国家自然科学基金(30600368, 30770200)。
致谢 美国加州大学洛杉矶分校林辰涛先生曾给予指导。
* 通讯作者(E-mail: sw_xml@hnu.cn; Tel: 0731-8821721)。
受光调节的拟南芥锌指蛋白DBB (Double B-Box)亚家族基因的转录表达
汪启明, 屠小菊, 赵小英, 唐冬英, 刘选明 *
湖南大学生命科学与技术研究院, 生物能源与材料研究中心, 长沙 410082
提要: 整合微阵列数据和采用实时荧光定量PCR分析拟南芥锌指蛋白DBB亚家族中8个基因在不同光周期和不同光质条
件下转录表达的结果表明, 在长日和短日照条件下该家族中6个基因的转录都具有光周期节律性, 并且其中4个基因的表
达受光诱导, 有1个基因的表达受光抑制, 1个基因的表达不受光调节。
关键词: 拟南芥; 光周期; 锌指蛋白; 生物钟节律
Transcription of Zinc Finger Protein DBB (Double B-Box) Subfamily Respond
to Light in Arabidopsis thaliana
WANG Qi-Ming, TU Xiao-Ju, ZHAO Xiao-Ying, TANG Dong-Ying, LIU Xuan-Ming*
Bioenergy and Biomaterial Research Center, Institute of Life Science and Technology, Hunan University, Changsha 410082, China
Abstract: The transcripts expression of eight members of DBB (double B-box) subfamily in Arabidopsis under
different photoperiods or light quality conditions were investigated using microarray and real-time quantitative
PCR. The results showed that the transcription of six members of DBB genes were under the control of
circadian clock: four of them were up-regulated, one was down-regulated and one wasn’t regulated in responsed
to light.
Key words: Arabidopsis thaliana; photoperiod; zinc finger protein; circadian clock rhythms
光周期和不同光质光都对拟南芥的生长有作
用, 并调控其基因的表达。这种调节由植物体内各
种转录因子完成。拟南芥中已发现了大约1 600种
转录因子(Riechmann等 2000), 归纳为不同的亚族,
其中锌指蛋白 B-box家族是最为重要的一种(Klug
和 Schwabe 1995; Mackay和 Crossley 1998;
Sanchez-Garcia和 Rabbitts 1994; Laity等 2001)。
CO (constans)是最具代表性的一个基因(Putterill等
1995), 它是植物光信号传导途径调控开花的关键因
子(Robson等 2001; Valverde等 2004)。CO蛋白N
端有 2个 B-box锌指结构, C端为 CCA结构。另
外还有一个与CO同源的DBB蛋白亚族基因, 它们
不具有C端CCT结构, 但其N端有2个B-box结构,
并且这 2个 B-box结构域为 8~15个氨基酸隔开。
在拟南芥中 DBB亚家族主要包括以下 8个基因:
DBB1a (At2g21320)、DBB1b (At4g38960)、
DBB2 (At4g39070)、DBB3 (At1g78600)、DBB4
( A t 4 g 1 0 2 4 0 )、S T O ( A t 1 g 0 6 0 4 0 )、S T H
(At2g31380)和 STH2 (At1g75540) (Kumagai等
2008)。
至今已发现DBB家族中有4个基因在光介导
的植物生长发育中起作用, STO是耐盐的基因, 其
蛋白在光敏色素和蓝光信号途径中起负调控作用
(Indorf等 2007)。STH与 STO类似, 都与 COP1相
互作用(Datta等 2007)。DBB3和 STH2都调节下
胚轴的伸长、叶绿体的早期形成和花青素的积累,
在拟南芥去黄化过程中起正调控作用。它们能与
HY5和 COP1相互作用且蛋白的表达受HY5调节,
并为 COP1降解(Datta等 2007, 2008; Chang等
2008)。中日照情况下DBB亚家族部分基因与生物
钟节律相关(Kumagai等 2008), 但这个家族基因在
不同光周期下的转录表达节律性和受不同光质光的
调节情况, 仍不清楚。
本文通过综合 Diurnal、Genevestigator和
ExpressionBrowser等网站的生物信息学信息和采
用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR)技
术检测和分析DBB亚家族基因感应光的转录表达
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月786
和研究该家族基因受光调控的转录表达特征。
材料与方法
用生物软件 ClustalW (www.arabidopsis.org/
Blast/index.jsp)对DBB亚家族基因蛋白序列进行分
析比较, 画出 DB B 亚家族基因的聚类分析图。
Diurnal网站(http://diurnal.cgrb.oregonstate.edu/)是由
美国俄勒冈州立大学基因组及生物计算研究中心建
立, 综合多个实验室的基因芯片结果, 提供了拟南
芥基因的生物节律性表达情况。登录Diurnal网站,
分别将 D B B 家族的所有基因的基因编号(如
At2g21320)都输入Diurnal search tools的对话框中,
收索得到长日照和短日照条件下该家族各个基因的
转录水平表达情况。Genevestigator网站(https://
www.genevestigator.ethz.ch)综合数百个基因芯片
结果, 为研究者提供了广泛的拟南芥基因受胁迫调
控的表达信息, 登录Genevestigator网站输入DBB
家族各个基因的基因编号, 得到在不同的光质培养
下这些基因的转录表达量。黑暗条件(对照)下的
基因表达量设定为 1, 不同光质光下培养的基因转
录表达量与对照的转录表达量作对比后得到的比值
绘成柱状图。ExpressionBrowser (www.expression-
browser.com)网站综合 142个Affymetrix的拟南芥
微列阵实验结果, 得到拟南芥中所有的基因表达和
蛋白质共调节的信息, 登陆该网站, 寻找光信号和
生物钟信号途径中受DBB亚家族调控的基因。
实验的材料为野生型拟南芥[Ara bidop s is
thaliana (L.) Heynh.] Col-4, 属于哥伦比亚生态型。
拟南芥种子用 70%的乙醇表面灭菌 30 s, 以 10%
次氯酸钠灭菌 10 min, 然后用无菌水冲洗 4~5次,
播种于含有 0.8%琼脂的MS培养基上。播种后将
其放入 4 ℃下处理 4 d, 然后分别放在长日照(16 h
光照, 8 h黑暗)和短日照(8 h光照, 16 h黑暗)条件
下培养 10 d, 从第 1天起以不同光周期培养, 后 2 d
放在全日照下培养, 每隔3 h取拟南芥幼苗样品, 前
后 72 h共取 24次样品。此外, 取 4 ℃冰箱冷处理
4 d后的拟南芥种子, 先放在黑暗条件下生长8 d, 再
分别转移到白光、蓝光、红光和远红光下处理 1
d后取样(Zhao等 2007)。光源分别为: LED-蓝光
(波长为 470 nm, 半幅宽为 30 nm), LED-红光(波长
为 660 nm, 半幅宽为 20 nm), LED-远红光(波长为
740 nm, 半幅宽为 25 nm, 光照强度为 6 μmol·m-2·s-1)
和白色荧光灯(飞利普)。蓝光(光照强度为 8 0
μmol·m-2·s-1)、红光(光照强度为 28 μmol·m-2·s-1)、
远红光(光照强度为6 μmol·m-2·s-1)和白光(光照强度
为80 μmol·m-2·s-1)的光照强度用Li-250量子光度计
测量。
采用安比奥公司生产的 RNA提取试剂盒, 提
取总RNA。按照Promega试剂说明书在总RNA溶
液中加适量的 RNase free DNase I得到去DNA的
RNA, 然后, 用核酸浓度测定仪测定所提取RNA的
浓度及纯度。取约 2 μg的总RNA用M-MLV逆转
录酶转录得到 cDNA (李妍等 2008)。用实时荧光
定量 PCR技术检测基因的表达量。实时荧光定量
PCR采用 JumpStart Taq Ready Mix Kit (Sigma公
司), 荧光染料为 SYBR Green I (Invitrogen公司)和
Rox (Invitrogen公司), 在Mx3000P Q-PCR System
(Stratagene公司)仪器上完成。PCR条件为: 95℃
预变性10 min; 95 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 57
℃时采集荧光数据, 共 40个循环(部分基因的延伸
温度和读数温度有所改变)。以 ACT7和 ACT2基
因作为内参基因, 通过Mx3000P软件分析结果。
每个定量PCR结果至少重复3次, Q-PCR的体系如
表 1所示, 所用的 PCR引物如表 2所示。
表 1 实时荧光定量 PCR的反应体系
Table 1 The system of real-time quantitative PCR
试剂 体积 /μL
去离子水 20.25
JumpStart Taq Ready Mix (2×) 2 5
25 mmol·L-1 MgCl2 0.75
SYBR Green I (20×) 1.25
Rox 0.25
正向引物(25 μmol·L-1) 0.25
反向引物(20 μmol·L-1) 0.25
cDNA 2
总体积 5 0
结果与讨论
1 DBB家族基因的聚类分析
通过生物软件ClustalW对DBB亚家族基因蛋
白序列进行分析比较(图1), DBB家族基因按蛋白序
列同源性高低可分为 3类: STO、STH与DBB3为
一类; DBB4、DBB1a与DBB1b为一类; STH2与
DBB2为一类。
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 787
表 2 实时荧光定量 PCR引物序列
Table 2 Primer sequences used in real-time quantitative PCR analysis
基因名称 正向引物序列 反向引物序列
DBB1a 5-CTCTCCATCTTCCGCTTCA-3 5-TTTTTACTCAAACGATTAGTCTCAC-3
DBB1b 5-CCGTTTTTTTTCCTTCCTTCTG-3 5-ACAACATAAACCTTCCCTCTTCAAC-3
DBB2 5GACATTACCGGGTTGGAGAGT’3 5-ACCATCATAAACCCTATAAGACTCAC-3
DBB3 5-TTCCACAGATTCAGTCTCCACCTA-3 5-GCCGTTTCCCAACCCTTT-3
STO 5-GGATCAAAGTAGCTCTGACCTC-3 5-GTTGTTGGAAGGCTCAGGTT-3
STH 5-CACTTGATTCGCATAGTCTTC-3 5-TTAGCCTGCTACTTACAGTGATA-3
图 1 锌指蛋白DBB亚家族的聚类分析
Fig.1 Cluster analysis of DBB subfamily
2 不同光质光和不同光周期下DBB家族基因的表
达
为了了解不同光质光和不同光周期下DBB家
族的转录表达, 通过Genevestigator网站得到的结果
显示, DBB1a、DBB3、STO和 STH的表达受光
诱导, 而DBB2、DBB4和 STH2的表达受光抑制,
只有DBB1b在光处理后的表达无明显变化, 并且在
各种光质光下的各个基因的表达变化趋势相同(图
2); 通过Diurnal网站搜索的结果显示, 长日照和短
日照条件下 DBB1a、DBB1b、DBB2、DBB3、
STO和 STH这 6个基因均表现出生物钟节律。
3 不同光周期下DBB家族基因节律表达的实时荧
光定量PCR检测
为了验证生物芯片的结果, 提取长日照和短日
照下培养的拟南芥中的RNA, 实时荧光定量PCR检
测的结果显示, 实时荧光定量PCR的结果与生物芯
片的结果相似度较高 , 长短日照培养条件下
DBB1a、DBB1b、DBB2、DBB3、STO和 STH
这6基因的转录表达都具有节律性, 但是各个基因
的表达量峰值不完全相同, 其中光照后14 h与长短
日照下DBB2的表达量峰值不在同一个时间点,
其余的 5个基因均集中在光照后的前 6 h, 并且
长短日照下同一基因的表达量峰值均在同一个
时间点(图 3 )。
图 2 不同光对DBB基因亚族基因转录的影响
Fig.2 Graphic analysis of transcript levels of DBB subfamily under different lights
结果为不同光质光处理与黑暗条件表达量的比率。这些微列阵结果来自Genevestigator 数据库(http://www.genevestigatior.ethz.ch/)。
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月788
图 3 长、短日照下DBB亚家族基因表达的定量 PCR检测
Fig.3 Q-PCR analysis of expression of DBB subfamily genes under LD and SD day
图中 a、c、e、g、 i 和 k 分别是在长日照下 D B B 1 a、D B B 1 b、S T O、D B B 3、S T H 和 D B B 2 的 m R N A 表达情况；b、
d、f、h、j 和 l 分别是在短日照下 D B B1 a、D B B1 b、S TO、D B B3、S TH 和 D B B2 的 mR N A 表达情况。图下白色 / 黑色棒代
表光 / 暗周期，白色 / 灰色棒代表连续照光。将第一天照光时开始取样的时间点定位 0 h。
4 不同光质培养条件下DBB家族基因节律表达的
实时荧光定量PCR检测
光照是植物维持生物钟节律的重要因素
(Somers等 1998), 通过实时荧光定量 PCR检测不
同光质光下培养的具有生物节律的DBB亚家族的6
个基因表达的结果与Genevestigator芯片的结果基
本相似。图4结果显示, 具有生物节律性的DBB家
族基因的转录表达受光调控的状态不同, 其中
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 789
DBB1a、DBB3、STO和 STH受光的诱导, DBB1a
受光诱导的幅度最大; DBB2受光的抑制; DBB1b
不受光调控; 这些结果也表明, 不同光质光对基因
表达的影响不大, 它们的变化趋势都相同。
结合基因家族的聚类分析, 可以看到具有较高
蛋白同源性的DBB家族基因受光调控的转录表达
变化并不完全一致, 如DBB1a和DBB1b, 可能与两
者分别受不同转录因子转录有关。在不同的光照
周期下, 各个基因的表达量峰值也不完全相同, 这
可能是该家族基因在生物体内的生物钟信号传递过
程中的功能不同。从 ExpressionBrowser网站的结
果显示, DBB亚家族中DBB1a、DBB1b、DBB3、
STO和STH这5个基因参与调控光信号传导途径中
的HY5、COP1和 CHS, 以及生物钟信号途径中的
CCA1、LHY、ELF3、TOC1等关键基因表达, 此
外, DBB亚家族内部的各个基因之间也有相互调控
关系。根据这些结果可以推测DBB亚家族中有多
个基因参与光调控的生物钟节律信号传导途径。
在今后的研究中, 我们将对该家族基因进行系
统的遗传学分析, 确定各个基因突变体的表型和筛
选各个单基因突变体杂交后的多基因突变体, 并从
蛋白表达水平上确定该家族基因的表达情况, 从而
深入了解该家族基因的生物学功能, 特别是在光信
号传导途径中的作用, 并寻找与这些基因相互作用
的蛋白, 从而进一步了解光信号传导途径, 以实现
用光信号途径中的分子原件运用于调节植物生长发
育的目的。
参考文献
李妍, 赵小英, 郭明, 李旭, 黄绿红, 唐冬英, 郭新红, 刘选明(2008).
GA2ox8基因过量表达诱导蓝光下拟南芥光形态建成. 植物
生理学通讯, 44 (3): 421~425
Chang CJ, Li YH, Chen LT, Chen WC, Hsieh WP, Shin J, Choi G,
Hu JM (2008). LZF1, a HY5-regulated transcriptional factor,
functions in Arabidopsis de-etiolation. Plant J, 54: 205~219
Datta S, Hettiarachchi C, Johansson H, Holm M (2007). SALT
TOLERANCE HOMOLOG2, a B-box protein in Arabidopsis
that activates transcription and positively regulates light-
mediated development. Plant Cell, 19: 3242~3255
Datta S, Johansson H, Hettiarachchi C, Irigoyen ML, Desai M,
Rubio V, Holm M (2008). LZF1/SALT TOLERANCE
HOMOLOG3, an Arabidopsis B-box protein involved in
light-dependent development and gene expression, undergoes
COP1-mediated ubiquitination. Plant Cell, 20: 2324~2328
Indorf M, Cordero J, Neuhaus G, Rodrguez-Franco M (2007). Salt
tolerance (STO), a stress-related protein, has a major role in
light signaling. Plant J, 51 (4): 563~574
Klug A, Schwabe JW (1995). Protein motifs 5. zinc fingers. FASEB
J, 9: 597~604
Kumagai T, Ito S, Nakamichi N, Niwa Y, Murakami M, Yamashino
T, Mizuno T (2008). The common function of a novel
subfamily of B-box zinc finger proteins with reference to
图 4 不同光质光下DBB亚家族基因表达的定量 PCR检测
Fig.4 Q-PCR analysis of mRNA expression of DBB subfamily genes under various lights
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月790
circadian-associated events in Arabidopsis thaliana . Biosci
Biotechnol Biochem, 72 (6): 1539~1549
Laity JH, Lee BM, Wright PE (2001). Zinc finger proteins: new
insights into structural and functional diversity. Curr Opin
Struct Biol, 11: 39~46
Mackay JP, Crossley M (1998). Zinc fingers are sticking together.
Trends Biochem Sci, 23: 1~4
Putterill J, Robson F, Lee K, Simon R, Coupland G (1995). The
CONSTANS gene of Arabidopsis promotes flowering and
encodes a protein showing similarities to zinc finger tran-
scription factors. Cell, 80: 847~857
Riechmann JL, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang CZ, Keddie J,
Adam L, Pineda O, Ratcliffe OJ, Samaha RR et al (2000).
Arabidopsis transcription factors: genome-wide compara-
tive analysis among eukaryotes. Science, 290: 2105~2110
Robson F, Costa MM, Hepworth SR, Vizir I, Pineiro M, Reeves PH,
Putterill J, Coupland G (2001). Functional importance of
conserved domains in the flowering-time gene CONSTANS
demonstrated by analysis of mutant alleles and transgenic
plants. Plant J, 28: 619~631
Sanchez-Garcia I, Rabbitts TH (1994). The LIM domain: a new
structural motif found in zinc – finger-like proteins. Trends
Genet, 10: 315~320
Somers DE, Devlin PF, Kay SA (1998). Phytochromes and
cryptochromes in the entrainment of the Arabidopsis circa-
dian clock. Science, 282: 1488~1490
Valverde F, Mouradov A, Soppe W, Ravenscroft D, Samach A,
Coupland G (2004). Photoreceptor regulation of CONSTANS
protein in photoperiodic flowering. Science, 303: 1003~1006
Zhao XY, Yu X, Foo E, Symons GM, Lopez J, Bendehakkalu KT,
Xiang J, Weller JL, Liu X, Reid JB et al (2007). A study of
gibberellin homeostasis and cryptochrome-mediated blue
light inhibition of hypocotyl elongation. Plant Physiol, 145:
106~118