全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 2期，2010年 2月 135
收稿 2009-11-16 修定 　2009-12-07
资助 国家自然科学基金(30 4 60 0 1 6)、云南省自然科学基金
(2006C0030M)和云南省教育厅基金(09Y0145)。
* 通讯作者(E-mail: gongming63@163.com; Tel: 0871-
5 5 1 7 3 9 4 )。
钙信使系统对机械刺激诱导的烟草悬浮培养细胞中H2O2爆发的调控
李忠光, 龚明 *
云南师范大学生命科学学院, 教育部生物能源持续开发利用工程研究中心, 昆明 650092
提要: 机械刺激可诱导烟草悬浮培养细胞H2O2的爆发, 外源Ca2+有强化作用, 而Ca2+螯合剂EGTA、质膜Ca2+通道阻塞剂
La3+、胞内Ca2+通道阻断剂钌红, 以及钙调素拮抗剂氯丙嗪和三氟拉嗪则削弱机械刺激诱导的氧化爆发。这暗示以钙和钙
调素为核心的钙信使系统对机械刺激诱发的烟草悬浮培养细胞中H2O2的爆发有调控作用。
关键词: 烟草悬浮培养细胞; 机械刺激; H2O2爆发; 钙; 钙调素
Regulation of Calcium Messenger System on Mechanical Stimulation-Induced
H2O2 Burst in Tobacco (Nicotiana tabacum L.) Suspension Culture Cells
LI Zhong-Guang, GONG Ming*
Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy, Ministry of Education, School of Life
Sciences, Yunnan Normal University, Kunming 650092, China
Abstract: Mechanical stimulation (MS) could induce H2O2 burst in tobacco (Nicotiana tabacum) suspension
cells. The formation of MS-induced oxidative burst in tobacco suspension cells could be strengthened by
exogenous Ca2+ treatment, while weakened significantly by Ca2+ chelator EGTA, plasma membrane Ca2+ channel
blocker La3+, intracellular Ca2+ channel blocker ruthenium red, calmodulin antagonists chlorpromazine and trif-
luoperazine treatment, respectively. These results suggested that calcium messenger system involved in MS-
induced H2O2 burst in tobacco suspension culture cells.
Key words: tobacco suspension cells; mechanical stimulation; H2O2 burst; calcium; calmodulin
陆生植物固着生长的特性决定了其在整个生
长发育过程中不可避免地会遭受各种各样生物的或
非生物的环境刺激或胁迫, 以风吹、雨淋、触
摸、土壤阻力、冰雹袭击、动物啃食等为代表
的机械刺激(mechanical stimulation, MS), 是自然界
中普遍存在而又容易被忽视的一种环境胁迫因子,
它贯穿于植物生长发育的整个过程(Braam 2005;
Monshausen等 2009; Chehab等 2009; Porter等
2009)。早期人们对MS的研究主要集中在其对植
物生长发育及形态建成的影响, 即所谓的接触形态
建成作用(Biddington 1986; Telewski和 Jaffe 1986;
Trewavas和Knight 1994)。近年来的研究表明, MS
对植物细胞核和细胞器在胞内的迁移与定位、生
理生化反应、基因表达等一系列过程均有影响
(Braam 2005; Monshausen等 2009; Chehab等 2009;
Porter等 2009)。
植物如何把外界的刺激或胁迫信号转导到胞
内, 以及这些信号如何在细胞间传递, 均是目前植
物生理学研究中的热点之一, MS诱发的信号转导
和信息传递也不例外。Trewavas和Knight (1994)
报道, MS可在数秒钟内诱发烟草细胞中 Ca2+浓度
的迅速升高; 升高的 Ca2+诱导钙调素(calmodulin,
CaM)和 CaM类似基因等触摸基因(touch-induced
gene, TCH)的表达, 以此应答植物对MS的适应过
程(Braam 2005; Monshausen和Gilroy 2009; Chehab
等 2009; Porter等 2009)。此外, 在大豆和荷兰芹
的悬浮细胞中, 搅拌、挤压、触摸等MS都可诱
发细胞中 H 2O 2的迅速积累(Legendre 等 1993;
Yahraus等 1995; Gus-Mayer等 1998)。我们的前
期研究也表明, MS可诱发烟草悬浮细胞中H2O2的
爆发(李忠光和龚明 2008; 李忠光等 2009), 并且证
实细胞壁过氧化物酶(cell wall peroxidase, CWPOD)
可能是MS诱发的烟草悬浮细胞中H2O2爆发的主要
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酶之一(李忠光等2009), 以此作为MS启动信号诱
导烟草悬浮细胞耐热性的形成(李忠光和龚明
2008)。这些结果暗示, 以钙和 CaM为核心的钙
信使系统与以H2O2为代表的活性氧(reactive oxy-
gen species, ROS)在MS诱发的信号转导和信息传
递过程中可能存在着某些对话(cross-talk)。但在
烟草悬浮细胞中的情况尚不清楚。本文以烟草悬
浮培养细胞为材料, 证实MS可诱发烟草细胞中
H2O2的爆发, 以钙和CaM为核心的钙信使系统对
MS诱发的烟草悬浮培养细胞中H2O2的爆发有调
控作用。
材料与方法
烟草(Nicotiana tabacum L.)品种‘Bright Yellow’
的愈伤组织由其幼嫩的茎髓诱导而成, 悬浮细胞的
具体培养方法见前文(李忠光等 2005b)。
培养5 d (对数生长期)的烟草悬浮培养细胞从
转速为 120 r·min-1和温度为 26 ℃的摇床中转到转
速为 150 r·min-1和温度为 26 ℃的另一摇床中进行
MS处理 50 min (对照一直培养在转速为 120 r·min-1
的摇床中)后, 按前文方法(李忠光等2007)测定烟草
悬浮细胞介质中的H2O2含量。
探讨Ca2+和CaM对MS诱发的H2O2爆发效应
时, 烟草悬浮细胞在MS处理前 15 min分别用不同
浓度的CaCl2 (培养介质中的Ca2+浓度为3 mmol·L-1,
即图 1中的 3 mmol·L-1)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)
四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA)、
La C l 3、钌红( r u t hen i um r ed , R R )、氯丙嗪
(chlorpromazine, CPZ)或三氟拉嗪(trifluoperazine,
TFP)处理, 按上述方法测定H2O2含量。
为了探讨MS和上述不同浓度的试剂对烟草
细胞存活率的影响, 在完成MS处理后, 测定培养
介质中 H2O2含量的同时, 还用苔盼蓝染色法(de
Pinto等 1999)测定烟草细胞的存活率。
所有实验均重复 3次, 每次实验的测定重复 2
次, 数据均为平均值 ±标准误。
结果与讨论
1 细胞中Ca2+水平对MS诱发的烟草悬浮细胞中
H2O2爆发的影响
培养5 d的烟草悬浮细胞其培养介质中的H2O2
含量约为(0.525±0.015) μmol·g-1(DW), 经过MS处
理后其培养介质中的 H2O2含量上升为(17.825±
0.512) μmol·g-1(DW), 约是未经MS处理的对照的
35倍, 形成H2O2爆发(图 1-a、2-a、3-a、4-a; 李
忠光和龚明 2008)。在MS处理前, 分别用不同浓
度的Ca2+、EGTA、La3+或RR预处理, 表现出Ca2+
在低浓度下促进MS诱发的H2O2爆发, 高浓度则削
弱氧化爆发(图 1-a), 而EGTA、La3+和 RR对H2O2
爆发的削弱程度则随着三者本身浓度的增加而加强
(图 2-a、3-a)。此外, 考虑到MS处理或不同浓度
的 Ca2+、EGTA、La3+或 RR处理对烟草细胞存活
率的影响, 我们在检测H2O2的同时还测定了细胞的
存活率, 结果是高浓度(≥ 50 mmol·L-1) Ca2+明显降
低细胞的存活率(图1-b), 这可能是高浓度Ca2+是一
种细胞毒害剂之故(Knight 2000; McAinsh和Pittman
2009)。而 EGTA、La3+和 RR则在一定的浓度范
围内对细胞存活无影响(图 2-a、3-a)。
图 1 外源Ca2+对MS诱导的烟草悬浮培养细胞中
H2O2爆发和存活率的影响
Fig.1 Effects of exogenous Ca2+ on MS-induced H2O2 burst
and survival percentage in tobacco suspension cells
*P<0.05, **P<0.01, 与 3 mmol·L-1 Ca2+处理相比。
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图 2 外源 EGTA对MS诱导的烟草悬浮培养细胞中
H2O2爆发和存活率的影响
Fig.2 Effects of exogenous EGTA on MS-induced H2O2
burst and survival percentage in tobacco suspension cells
**P<0.01, 与 0 mmol·L-1 EGTA处理相比。
此外, CWPOD是植物细胞产生H2O2的主要酶
之一, 其活性受 Ca2+/CaM (Mura等 2005) 和 pH调
节(Bolwell等 1995; 李忠光等2009), 它参与生物的
或非生物的环境胁迫诱发的氧化爆发过程(Kukavica
等2009; Minibayeva等2009), 我们以前的研究结果
也另有表明, CWPOD参与MS诱发的烟草悬浮细
胞H2O2爆发过程(李忠光等 2009)。Monshausen和
Gilroy (2009)认为, MS可引发质膜 Ca2+通道开放,
促进细胞中Ca2+水平的迅速增加, 激活质膜上的H+
转运器, H+跨膜进入细胞质后, 导致细胞壁的pH值
增加, 以此激活CWPOD活性, 诱发H2O2爆发的形
成(图 1-a、2-a、3-a、4-a; 李忠光和龚明 2008;
李忠光等 2009)。所以, 本文用外源 Ca2+处理强化
MS诱导的烟草悬浮培养细胞中的氧化爆发(图 1-
a), 而用 Ca2+螯合剂EGTA、质膜Ca2+通道阻塞剂
La3+和胞内Ca2+通道阻断剂RR下调细胞中的Ca2+
水平, 都不同程度地削弱H2O2爆发(图 2-a、3-a)。
这些结果说明, MS诱发烟草悬浮培养细胞中H2O2
图 3 外源 La3+和RR对MS诱导的烟草悬浮培养细胞中
H2O2爆发和存活率的影响
Fig.3 Effects of exogenous La3+ and RR on MS-induced
H2O2 burst and survival percentage in
tobacco suspension cells
**P<0.01, 与 0 mmol·L-1 La3+或 RR处理相比。
的爆发需要Ca2+调节CWPOD的活性和动员胞内外
的 Ca 2+库。
2 抑制细胞CaM活性对MS诱发的烟草悬浮细胞
中H2O2爆发的影响
CPZ和TFP是常用的2种CaM拮抗剂(李忠光
等 2005a; 李忠光和龚明 2009), 培养 5 d的烟草悬
浮细胞在MS处理前, 分别用不同浓度的 CPZ或
TFP预处理的结果(图4-a)表明, 不同浓度的CaM拮
抗剂预处理的细胞, 其由MS诱导的烟草悬浮培养
细中H2O2爆发都受到不同程度的削弱。为了观察
不同浓度的CaM拮抗剂CPZ或TFP对烟草细胞存
活率的影响, 我们在检测细胞存活率时发现, 低浓
度CaM拮抗剂(≤ 0.1 mmol·L-1)对细胞存活率的影
响不明显, 而较高浓度 CaM拮抗剂(1 mmol·L-1)则
显著降低细胞的存活率(图 4-a)。所以我们认为,
在使用 CaM拮抗剂 CPZ和 TFP时, 要注意选择适
宜浓度的拮抗剂, 以免对细胞或植株的生长甚至存
活产生负面影响。
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图 4 CaM拮抗剂CPZ和 TFP对MS诱导的烟草悬浮细胞
中H2O2爆发和存活率的影响
Fig.4 Effects of CaM antagonists CPZ and TFP on
MS-induced H2O2 burst and survival percentage
in tobacco suspension cells
**P<0.01, 与 0 mmol·L-1 CPZ或 TFP处理相比。
如前所述, CWPOD是一种 Ca2+/CaM结合蛋
白, 其活性受Ca2+/CaM调节(Mura等2005), 因此用
不同浓度的CaM拮抗剂CPZ或TFP预处理细胞后,
MS诱导的烟草悬浮培养细中H2O2的爆发都受到不
同程度地削弱, 这暗示CaM对MS诱导的烟草悬浮
培养细胞中H2O2的爆发有调控作用。
总之, 以 Ca2+和 CaM为核心的钙信使系统通
过直接(与CWPOD结合)或间接(调节细胞壁pH值)
调节CWPOD活性的方式, 都可调节由MS诱发的
烟草悬浮培养细胞中H2O2爆发的形成。
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