全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月 537
收稿 2008-12-05 修定 　2009-04-23
资助 国家自然科学基金项目(30 8 71 5 7 6)、人事部留学回国
人员科技活动择优资助项目和重庆市自然科学基金重点
项目(CSTC, 2009BA1004)。
* 通讯作者(E-mail: luokeming@hotmail.com; Tel: 023-
6 8 2 5 4 5 3 0 )。
超量表达 IPT 和 KN1 基因对转基因烟草生长发育的影响
胥珊, 孙一铭, 贾之春, 罗克明 *
西南大学生命科学学院, 三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆 400715
提要: 为了比较异戊烯转移酶基因IPT和玉米homeobox基因KN1超量表达对植物生长发育的影响, 将35S::IPT和35S::KN1
分别导入烟草。观察发现, 过量表达 IPT和KN1基因对植株再生频率、形态、生长周期和顶端优势等方面的影响均相似,
但在生根和开花结籽方面, 35S::IPT转基因植物所受影响更显著。细胞分裂素含量检测表明, 35S::IPT转基因植物叶片中
细胞分裂素的含量高于35S::KN1转基因植物。
关键词: IPT基因; KN1基因; CaMV 35S; 转基因烟草
Effects of Overexpression of IPT and KN1 on Development and Growth in
Transgenic Tobacco Plants
XU Shan, SUN Yi-Ming, JIA Zhi-Chun, LUO Ke-Ming*
Key Laboratory of Eco-Environments of Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, School of Life Sciences, Southwest
University, Chongqing 400715, China
Abstract: To compare the effects of overexpression of isopentenyl transferase gene (IPT) and Knotted1 gene
(KN1) on plant development and growth, IPT and KN1 under the control of the 35S promoter were introduced
into Nicotiana tabacum cv. xanthi, respectively. Many of these phenotypes, which were characteristics of
35S::IPT transgenic plants, were observed in plants overexpressing KN1 gene, including increase in transfor-
mation rate, alteration of leaf morphology and loss of apical dominance. However, more flowers, shoots, roots
and higher seed germination rate were observed in 35S::KN1 transgenic plants, compared to 35S::IPT transgenic
plants. Higher cytokinin content was observed in 35S::IPT leaves than that in 35S::KN1 leaves.
Key words: IPT gene; KN1 gene; CaMV 35S; transgenic tobacco
细胞分裂素是一种十分重要的植物激素, 它不
仅能促进植物细胞的分裂和分化, 还具有诱导芽的
生成和抑制细胞衰老等功能。前人的研究已证明
(Gan和 Amasino 1995; McCabe等 2001; Luo等
2006a), 植物叶片衰老的延迟对于作物产量的提高
和蔬菜采后的保鲜均具有重大经济价值。
目前, 在植物抗衰老基因工程中, 主要利用与
细胞分裂素合成相关的基因包括异戊烯转移酶基因
(isopentenyl transferase gene, IPT)和玉米 homeobox
基因 Knotted1 (KN1)等。IPT基因由Akiyoshi等
( 1 9 8 4 )首先从根癌农杆菌( A g r o b a c t e r i u m
tumefaciens)中分离得到, 并证明其产物是细胞分裂
素合成途径中的一个关键限速酶。已分离的 IPT
基因几乎都来源于微生物, 这些基因具有相当高的
同源性。利用从根癌农杆菌中分离的 IPT基因, 人
们在植物叶片抗衰老基因工程方面已经做了大量的
工作。结果显示, 组成型过量表达 IPT基因的转基
因植物中细胞分裂素的含量确实明显增加, 叶片的
衰老被延迟, 但转基因植物的生长发育以及形态均
受到了明显的影响, 表现出花粉不育、叶片变小、
侧枝增加、顶端优势丧失和根生长受抑制等表型
(Smart等 1991; Li等 1992; McKenzie等 1998)。而
对于 KN1基因, 目前已在玉米、水稻、烟草等植
物中克隆得到, 并证实了该基因在高等植物茎顶端
分生组织的分化和维持中发挥重要作用(Smith等
1992; Lincoln等 1994; Hareven等 1996; Long等
1996)。过量表达KN1也会导致转基因植物中细胞
分裂素含量的增加, 并表现出与35S::IPT转基因植
株相似的形态变化(Sinha等 1993; Lincoln等 1994;
Chuck等 1996)。例如, 35S::KN1转基因植物叶片
的衰老也被延迟(Ori等 1999; Luo等 2006a)。但迄
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月538
今为止, 还未见到将 IPT和KN1基因分别转入植物
中, 就两基因过量表达对转基因植物生长发育的影
响进行比较的研究。
本研究选取组成型启动子CaMV 35S和分别来
自根癌农杆菌的IPT基因和来自玉米的KN1基因构
建了 35S::IPT和 35S::KN1表达载体。将表达载体
导入烟草后, 对 35S::IPT和 35S::KN1转基因植株
的再生频率、根的生长、植株形态、顶端优势
和开花结籽等方面进行了详细的比较, 并检测了转
基因幼苗中细胞分裂素的含量, 希望为将来植物抗
衰老基因工程中细胞分裂素合成相关基因的选择提
供一定的实验依据。
材料与方法
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α、根癌
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LAB4404和
遗传转化中所用植物材料烟草(Nicotiana tabacum L.
cv. xanthi)均为本实验室保存。植物表达载体以
pBI121为基础, 分别构建由组成型表达载体 35S::
IPT和 35S::KN1, 具体构建过程见 Luo等(2006b)。
载体的结构图谱见图 1。
烟草遗传转化采用改进后的叶盘法, 具体操作
图 1 35S::IPT和 35S::KN1表达载体示意图
Fig.1 A schematic illustration of plant binary vectors 35S::IPT and 35S::KN1
a: 35S::IPT表达载体示意图; b: 35S::KN1表达载体示意图。35S: 来源于花椰菜花叶病毒的组成性启动子; nos: 冠瘿碱合成酶基
因终止子; NPTII: 新酶素磷酸转移酶基因; GUS: 葡萄糖酸苷酶基因; IPT: 异戊烯转移酶基因; KN1: 玉米 homeobox基因 knotted1。
见Luo等(2006b)所述。转化后的叶片首先在MSR
培养基(MS培养基 +100 mg·L-1利福平(rifamycin)+
8 g·L-1琼脂)上预培养 3 d, 再分别转入MS和MS/
NB培养基上进行筛选培养。2种培养基都含有
8.0 g·L-1琼脂、100 mg·L-1利福平和 50 mg·L-1卡
那霉素(kanamycin), 其中MS培养基未添加任何植
物激素, 培养基MS/NB为: MS培养基 +0.1 mg·L-1
NAA+1.0 mg·L-1 6-BA。将获得的再生小苗转入生
根培养基(MS培养基 +100 mg·L-1利福平 +50 mg·L-1
卡那霉素+8 g·L-1琼脂), 待根系生长发达后移栽至
土壤中, 在温室中 25 ℃条件下继续培养。
GUS组织染色时, 将再生植株叶片浸入含有
0.5 mL GUS染色液的离心管中, 于 37 ℃下保温过
夜, 用 100% (V/V)乙醇脱色处理。GUS染液配方为:
1.0 mg·L-1 5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -D-葡萄糖苷、2%
(V/V)甲醇、1.0 mg·L-1 K4Fe(CN)6、0.1% (V/V)
Triton X-100和 0.1 mol·L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。
烟草基因组DNA提取采用 CTAB法, 具体过
程参见Doyle和Doyle (1987)的方法。转基因植株
的PCR检测以GUS阳性植株的基因组DNA为模板
通过扩增标记基因 NPTII进行筛选。根据抗性筛
选标记基因NPTII的序列设计一对特异引物, 引物
序列为 5 AGAGGCTATTCGGCTATGAC 3, 5
CCATGATATTCGGCAAGCAG 3。在每个25 μL的
PCR反应体系中含有, 50 ng植物基因组总DNA、
50 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 9.0)、
1.5 mmol·L-1 MgCl2、0.2 mmol·L-1 dNTPs、2.5 U
Taq DNA聚合酶。PCR反应条件为 95 ℃预变性
5 min、94 ℃变性 1 min、54 ℃退火 1 min、72
℃延伸 1 min、72 ℃延伸 10 min, 共 35个循环。
烟草转化效率的统计参照Luo等(2006b)所述
方法, 统计来源于20个被侵染叶片上获得的转化小
苗数量, 其中以转化 pBI121载体后在MS/NB培养
基上获得的转基因阳性小苗数作为对照, 设定为
100%, 35S::IPT和 35S::KN1的阳性小苗的数量分
别与 pBI121阳性小苗数量的比值即为 35S::IPT和
35S::KN1的转化效率。
细胞分裂素含量测定参照南京农业大学提供
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月 539
的 iPA、ZRs酶联免疫吸附测定试剂盒说明书。
实验结果
1 转基因幼苗的获得
植物表达载体35S::IPT和35S::KN1通过根癌
农杆菌 LBA4404介导转化烟草, 同时以转化载体
pBI121作为对照, 通过卡那霉素筛选后获得大量卡
那抗性小苗。为了证实外源基因是否已整合到转
基因小苗的基因组上, 对移入温室中生长 3周的小
苗进行了GUS组织染色, 结果显示, 超过 80%的
卡那抗性小苗为GUS阳性(结果未显示)。选取部
分GUS阳性植株进一步进行 PCR检测, 扩增对象
为 NPTII基因, 琼脂糖电泳结果见图 2。根据图 2
的结果可知, 随机选取的 6株 35S::IPT转基因植株
中, 仅有 1株未检测到 PCR阳性信号, 其余 5株均
检测到了与预期大小一致的 548 bp的扩增条带。
而在 35S::KN1转基因植株中, 随机挑选 5株进行
PCR检测, 结果都呈阳性。说明在转基因幼苗中,
经过卡那霉素抗性筛选后, GUS阳性植株中的绝大
多数均为转基因小苗。
2 过量表达 IPT和KN1对烟草转化效率的影响
将植物表达载体35S::IPT和35S::KN1转化烟
草, 在培养基MS和MS/NB上进行筛选培养 60 d
后, 分别获得转基因小苗。为了分析过量表达 IPT
和KN1基因对烟草转化效率的影响, 分别对转基因
小苗的数量进行统计。
如表1所示, 在含有NAA和BA的培养基MS/
NB中, 各个表达载体转化烟草后均获得了大量转基
图 2 35S::IPT和 35S::KN1转基因植株的 PCR检测结果
Fig.2 Identification of transgenic 35S::IPT and 35S::KN1 plants
a. M: DNA分子量标准; 1~6: 35S::IPT转基因植株 2、3、5、9、10 和 12; 7 : 野生型植株。b. M: DNA分子量标准; 1: 野
生型植株; 2 ~ 6 : 转基因 3 5 S : :KN1 植株 1、2、4、6 和 7。
因阳性小苗, 其中转化 35S::IPT和 35S::KN1载体
获得的转基因小苗数目明显多于转化对照载体
pBI121所获得的转基因小苗数目。在培养基MS
中, 尽管未添加任何植物激素, 但由于侵染后的烟
草叶片中 IPT基因和KN1基因过量表达, 转基因植
株合成了大量内源性细胞分裂素, 从而产生了大量
的转基因阳性小苗。比较 35S::IPT和 35S::KN1转
基因植株在MS 培养基上的转化频率(2 43 % 和
表 1 不同表达载体转化烟草后转化效率
Table 1 Regeneration rate of transgenic tobacco plants containing the different vectors
载体 培养基 被侵染叶盘数 卡那霉素抗性小苗 /株 阳性小苗 a/株 转化效率 b/%
35S::IPT MS 2 0 8 5 7 0 200
MS/NB 2 0 121 8 5 243
35S::KN1 MS 2 0 7 6 7 2 206
MS/NB 2 0 105 8 6 246
pBI121 MS 2 0 3 0 0
MS/NB 2 0 3 7 3 5 100
　　a: GUS染色和 PCR检测均呈阳性的再生小苗。b: 转化效率(以转化 pBI121载体的转基因阳性小苗数量为基准)的计算见 “ 材料
与方法 ” 部分。
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月540
246%)发现, 两者无明显区别, 该数据与我们前面
工作中获得的结果相类似(Luo等 2006b)。
3 转基因幼苗的生根频率分析
前人的研究结果已证实, 过量的细胞分裂素将
抑制根的生长(Li等 1992; McKenzie等 1998)。为
了分析过量表达IPT和KN1基因对转基因烟草生根
频率的影响, 将表1中抗性筛选获得的转基因阳性
小苗转入生根培养基(MS培养基+50 mg·L-1卡那霉
素)中, 3周后对各个培养皿中转基因小苗的生根情
况进行统计。结果如表 2所示, pBI121的转基因
植株均能在生根培养基上正常生根(生根频率为
100%), 但35S::KN1和35S::IPT转基因植株的生根
均受到了不同程度的抑制。35S::KN1转基因植株
生根频率为53.3%, 高于35S::IPT转基因植株36.7%
的生根频率。
表 2 转化不同载体的转基因小苗生根频率
Table 2 Rooting frequency of transgenic plants harboring different vectors
载体 培养基 阳性小苗数 a/株 生根的转基因小苗数 /株 生根频率 b/%
35S::IPT MS 3 0 1 1 36.7
35S::KN1 MS 3 0 1 6 53.3
pBI121 MS 3 0 3 0 100.0
　　a: GUS染色和 PCR检测均呈阳性的转基因小苗。b: 生根频率(%)=(生根的转基因小苗 /阳性小苗)×100%。
4 转基因幼苗形态变化的比较
将植物表达载体 pBI121、35S::IPT和 35S::
KN1分别转化烟草, 在MS+NB培养基上培养 8周
后, 获得转基因小苗。如图 3所示, 与 pBI121转
基因烟草(图 3-a)相比, 35S::IPT和 35S::KN1转基
因植株出现较多的腋芽分枝、茎段增粗、顶端优
势不显著甚至丧失(图 3-b、c)。将转基因植株转
入温室继续培养, 45 d后对其形态进行进一步观
察。结果发现, 与 pBI121转基因烟草(图 3-a、d)
相比, 35S::IPT (图 3-b、e)和 35S::KN1(图 3-c、f)
转基因小苗个体矮小, 叶片偏小、有皱褶, 叶色呈
深绿色。比较而言, IPT基因过量表达对转基因幼
图 3 转基因幼苗形态比较
Fig.3 Morphologic comparison of transgenic plants
a: pBI121转基因植株作为对照; b: 35S::IPT转基因植株; c: 35S::KN1转基因植株; d: pBI121转基因植株叶片作为对照; e: 35S::
IPT转基因植株叶片; f: 35S::KN1 转基因植株叶片。
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苗形态的影响大于 KN1基因过量表达对转基因幼
苗形态的影响。
5 过量表达 IPT和KN1对烟草开花及结籽的影响
为了研究过量表达 IPT和 KN1对烟草育性的
影响, 分析了转基因植株开花和结籽的情况。结果
发现, 35S::IPT和35S::KN1转基因植株的花期普遍
延迟, 花蕾数量少于转基因 pBI121烟草, 花瓣的发
育严重畸形, 不能正常开花, 即使部分花蕾能够开
花, 花粉发育仍不正常、大多败育(结果未显示)。
雌蕊发育异常, 柱头矮小甚至痿缩。相比较而言,
KN1过量表达对花发育的影响明显小于IPT基因过
量表达对花发育的影响, 35S::KN1转基因植株中大
部分花粉可育。
为检测转基因植物的种子是否可育, 分别收集
35S::IPT转基因植株 2、5、9号和 35S::KN1植株
1、2、4号的种子, 种子萌发后统计F1代的小苗数。
结果发现这些转基因植株的种子萌发率很低, 多数
不育, 尤其是 35S::IPT转基因植株的种子(表 3)。
表 3 转基因植物 F0代种子萌发效率
Table 3 Germination rate of transgenic plants
转基因植株 编号 所有种子数 /粒 可育种子数 /粒 不育种子数 /粒 萌发效率 a/%
35S::IPT 2 283 4 9 234 17.3
5 1 8 0 1 8 0
9 462 155 307 33.5
35S::KN1 1 596 277 319 46.5
2 357 139 218 38.9
4 286 108 178 37.8
　　a: 萌发效率(%)= 可育种子 /所有种子× 100%。
6 转基因幼苗中细胞分裂素含量的比较
在 35S::IPT和 35S::KN1转基因植株中, 由于
细胞分裂素的大量合成, 导致植物体内激素比例发
生了改变, 从而严重影响转基因植物的生长发育。
比较转基因植株的形态变化可看出(图3), 35S::IPT
转基因小苗的形态所受的影响大于35S::KN1转基
因植株, 推测在35S::IPT转基因植株中细胞分裂素
的含量可能更高。为了分析转基因幼苗中细胞分
裂素含量的差异, 分别选取 PCR 鉴定为阳性的
35S::IPT和35S::KN1转基因烟草, 采用间接酶联免
疫法测定其叶片中细胞分裂素的含量(吴颂如等
1988)。结果表明, 35S::IPT和 35S::KN1转基因株
系叶片中的细胞分裂素含量明显高于 pBI121转基
因植株(图4), 而在IPT基因过量表达的转基因植株
叶片中, 细胞分裂素的含量略高于35S::KN1转基因
植株。
讨　　论
植物生长是以光合作用为基础的, 适当延迟叶
片的衰老, 延长植物营养生长期, 增加光合产物的
合成量, 将有助于提高作物的产量。同时, 在蔬菜
生产中, 延缓叶片的衰老不仅能够提高其产量, 而
且有利于蔬菜收获后的储藏和保鲜。
很早以前就已经发现, 采用细胞分裂素处理很
多植物都可以延迟植物叶片衰老。N o od e n 等
(1990)在衰老的的植物木质部中发现了细胞分裂素
的含量下降, 因此认为这是植物衰老的起始信号。
于是人们将编码细胞分裂素合成途径中起关键作用
的异戊烯基转移酶基因 IPT导入植物中, 希望内源
细胞分裂素水平的增加能够延缓植物衰老。已有
的报道表明, IPT基因转化植物确实可以提高细胞
中细胞分裂素的含量, 但过量的细胞分裂素也给转
图 4 转基因植株叶片中的细胞分裂素含量
Fig.4 Cytokinin content in leaves of transgenic plants
1: pBI121转基因植株作为对照; 2~4: 35S::IPT转基因植
株; 5~7: 35S::KN1 转基因植株。
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月542
基因幼苗的生长发育带来了明显不利的影响(Smart
等 1992; Li等 1992)。前人的研究还发现, 来自于
玉米的homeobox基因家族的基因KN1在转基因植
物中过量表达, 也会对其生长发育带来类似 IPT基
因过量表达的影响(Sinha等 1993; Lincoln等 1994;
Chuck等 1996)。
为了避免过量细胞分裂素产生所带来的植株
生长发育不正常的问题, Gan和Amasino (1995)将
IPT基因与植物衰老特异性表达基因 SAG12的启
动子融合在一起, 构建了一个可调控 IPT基因表达
水平的系统, 在转基因烟草中得到了发育正常但衰
老延迟的植株, 目前该系统已导入许多植物(如水
稻、莴苣、青菜等)中并获得了成功(付永彩等
1999; McCabe等2001; 袁政等 2002)。Ori等(1999)
将SAG12启动子与KN1基因融合, 也推迟了转基因
植物的衰老并且未产生明显不利生长的影响。因
此通过特异性表达 IPT基因和KN1基因, 在转基因
植物衰老过程中增加叶片细胞分裂素的含量, 能够
延迟叶片的衰老, 这对于提高作物的产量和改良蔬
菜的品质具有很大的经济价值。
我们的实验比较了过量表达 IPT基因和 KN1
基因给转基因烟草带来的影响。结果表明,转基因
烟草中, 过量表达 IPT基因和KN1基因都大大提高
了转基因小苗的转化频率(表1), 同时, 转基因幼苗
出现叶片变小皱缩、腋芽分枝明显增加、顶端优
势丧失等与预期一致的表型(图 3)。但比较两种转
基因植物的形态可以看出, 35S::IPT转基因烟草比
35S::KN1转基因烟草所发生的变化更大些。检测
转基因植物叶片中细胞分裂素的含量发现, 转基因
35S::IPT烟草中的细胞分裂素相对含量更高(图4),
这可能也是转基因 35S::IPT植株形态变化更大的
原因。我们对 35S::IPT和 35S::KN1转基因植株的
生根情况进行了分析, 结果显示, 35S::KN1转基因
烟草有更高的生根频率。在转基因植株开花和结
籽方面, 前人的结果已表明, 采用种子特异性启动
子Lectin调控 IPT基因的表达, 可以促进种子膨大,
提高幼苗萌发(王兴美 2005)。在本研究中, 过量表
达IPT和KN1均导致烟草花不同程度的败育和种子
的萌发率降低, 相比较而言, 35S::IPT转基因烟草
的花和可育种子的数量明显少于35S::KN1转基因
烟草, 推测这些差异也可能是由于不同转基因植物
中细胞分裂素水平的不一致所造成的。该结果说
明, 采用组成型强启动子调控细胞分裂素基因在植
物中表达, 对转基因植物的生长发育存在明显不利
的影响。
在同一种植物中都采用强启动子CaMV 35S控
制 IPT基因和KN1基因的表达, 为什么对转基因植
物后代的影响却不完全相同？前人的研究表明, IPT
基因是细胞分裂素生物合成的关键酶和限速酶基
因, 它直接参与细胞分裂素的合成, 而 KN1基因对
于细胞分裂素合成的影响是间接的, 它可能是作为
上游调节基因通过控制下游细胞分裂素生物合成关
键酶基因(包括IPT基因)来实现对细胞分裂素的调
控(Kamimoto 1996; Brandstatter和Kieber 1998; Ori
等1999), 但是目前还没有实验结果证实该推论, 有
待进一步研究。
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