全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 10期, 2010年 10月 1025
收稿 2010-07-01 修定 　2010-07-16
资助 上海农业科学技术成果及高新技术产业化项目(沪农科
产字[2 0 0 4 ]第 3 号)。
* 通讯作者(E-mail: lzl@njau.edu.cn; Tel: 025-84396370)。
荷花液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆与特性分析
郭会敏, 顾春笋, 刘兆磊 *, 陈发棣, 徐迎春
南京农业大学园艺学院, 南京 210095
提要: 采用简并引物和RACE等技术从荷花中分离出液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1的全长 cDNA序列, 命名为
NnNHX1。该基因全长2 237 bp, 预测其编码一个由538个氨基酸组成的多肽, 其N-端是一个由11个跨膜结构组成的疏水
区域, C-端是一个亲水的尾巴。序列比对表明, NnNHX1与葡萄NHX1等的同源性较高, 并且都具有高度保守的氨氯吡嗪
咪结合位点序列LFFIYLLPPI。系统进化树表明NnNHX1与液胞膜型Na+/H+逆向转运蛋白关系较近, 而与质膜型Na+/H+逆
向转运蛋白关系较远。qRT-PCR结果显示NnNHX1基因在植株中属于组成型表达, 但经NaCl诱导后, 根中NnNHX1的表
达量急剧增高后又迅速下降, 而叶中的表达量却先缓慢增加后又剧烈下降。
关键词: 荷花; 液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因; 克隆; 荧光定量PCR
Cloning and Characterization Analysis of a Vacuolar Na+/H+ Antiporter Gene
NnNHX1 from Nelumbo nucifera
GUO Hui-Min, GU Chun-Sun, LIU Zhao-Lei*, CHEN Fa-Di, XU Ying-Chun
College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: The cDNA of NHX1 gene which was then designated as NnNHX1 was successfully isolated from
Nelumbo nucifera by RACE cloning method. The full-length cDNA of NnNHX1 was 2 237 bp and it was
predicted to encode a 538-amino acid protein with 11 hypothetical transmembrane domains in the N-terminal
part while a hydrophilic tail in the C-terminal part. The bioinformation analysis of NnNHX1 showed it had high
identities with NHX1 from Vitis vinifera and other NHX1s, and all of them had a high degree conserved amiloride
binding-site sequence LFFIYLLPPI. The phylogenetic tree analysis showed that NnNHX1 shared the same
group with vacuolar Na+/H+ antiporter protein, but distinguished from the plasma Na+/H+ antiporter protein. The
result of fluorescence quantitative real-time PCR showed that NnNHX1 was constitutive expressed, but under
the NaCl stress, the expression level of NnNHX1 in roots increased sharply before decreased rapidly; while the
expression level of NnNHX1 increased mildly at first, then decreased dramatically in leaves.
Key words: Nelumbo nucifera; vacuolar Na+/H+ antiporter gene; cloning; fluorescence quantitative real-time
PCR
土壤中过多的 Na + 会引起植物体内离子失
衡、水分亏缺和离子毒害(Tes ter 和 Davenport
2003; Zhu 2003; Serrano和 Rodriguez-Navarro
2001), 导致植物细胞的膜功能失调、代谢活动衰
减及其他次生影响, 使植物的生长受到抑制, 直至
细胞死亡(Yeo 1998; Glenn等1999), 所以土壤盐渍
化是限制植物生长的主要因素之一(Niu等 1995)。
为了减轻盐胁迫的伤害, 植物会形成一些调节机制
使细胞内的Na+含量维持在一个较低的水平, 其中
通过Na+转运体降低植物细胞内Na+浓度的耐盐机
制近来受到越来越广泛的关注(Zhang等 1999; Su
等 2002)。一般说来, 植物可以分别通过液泡膜型
和质膜型Na+/H+逆转运蛋白实现Na+的区隔化和
Na+的外排(Blumwald等 2000; Apse和 Blumwald
2007)。
通过转化拟南芥的液泡膜型Na+/H+逆向转运
蛋白基因AtNHX1 (Apse等1999)已经获得了耐盐性
能显著提高的转基因植株(Apse等 1999; Zhang和
Blumwald 2001; Zhang等 2001; Ruiz和 Blumwald
2002); Fukada等(1999)从水稻中克隆了OsNHX1基
因, 并且超表达该基因可以明显增强转基因水稻的
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耐盐性(Ohta和Yashia 2002)。鉴于NHX1在植物
耐盐中的重要作用, 目前已从许多植物中克隆到
NHX1基因(Hamada等2001; Wang等2002; 吕慧颖
等 2004; Vasekina等 2005; 严一诺等 2007)。
荷花为莲科莲属多年生水生植物, 是中国十大
传统名花之一, 具有极高的观赏价值和经济价值, 多
分布于淡水湖泊地区, 耐盐能力差。而生长于温带
沿海地带的‘冬荷’, 具有在一定程度上淡化海水的
功能(王其超和张行言 2005)。因此, 本研究从 ‘冬
荷 ’中分离出 NHX1这一优异的耐盐基因, 并对该
基因的序列及其在NaCl胁迫下的表达情况进行了
分析, 为拓宽荷花基因库并最终选育出荷花耐盐新
种质奠定了基础, 具有重要的经济和社会意义。
材料与方法
试验材料为荷花品种‘冬荷’ (Nelumbo nucifera
Gaertn. ‘Dong He’), 引自江苏省南京市艺莲苑。
总 RNA提取试剂 TRNzol Reagent、Taq酶、
M-MLV反转录酶和DNA凝胶回收试剂盒均购自
TaKaRa (大连)公司; TA克隆试剂盒、5RACE试
剂盒购自 Invitrogen公司; 大肠杆菌DH5α感受态
细胞购自天根生化科技(北京)有限公司; 荧光定量
PCR试剂盒购于东洋纺(TOYOBO上海)生物科技
有限公司; 所用引物由 Invitrogen公司合成。
待植株长出叶片后取其嫩叶用液氮速冻后提
取总 RNA, 提取方法参照总RNA提取试剂盒的说
明书。根据GenBank中公布的拟南芥等的 NHX1
基因的保守序列, 设计一对简并引物 F1和 R1。以
总RNA为模板, 经反转录后合成 cDNA第一链, 以
F1和R1为引物进行PCR扩增, 反应体系为 25 μL,
反应程序为: 95 ℃预变性5 min; 94 ℃变性1 min, 55
℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 35个循环; 然后 72
℃延伸 10 min。PCR产物经 1.2%琼脂糖凝胶电
泳检测后, 用凝胶回收试剂盒回收目的条带, 将回
收产物与pGEM-T连接并转化大肠杆菌DH5α感受
态细胞, 37 ℃培养过夜后挑取阳性克隆并经 PCR
检测后送华大基因测序。
以Oligo dT adapter为接头引物, 将总 RNA反
转录得到 cDNA第一链。根据上述测序结果设计
3RACE引物GSP3-1和GSP3-2, 并分别和 adapter-
R进行巢式PCR, 反应体系和程序同上。将PCR产
物检测并回收后, 连接、转化、筛选、检测并测
序; 根据已经获得的荷花NHX1基因的部分序列, 设
计 5RACE引物GSP5-1、GSP5-2和 GSP5-3, 按
5RACE试剂盒的操作说明进行巢式 PCR反应, 回
收目的片段并测序。将获得的片段进行拼接后设
计全长引物 Full-F和 Full-R, 经PCR并测序后获得
荷花 NHX1基因的 cDNA全长序列。
荷花 NHX1基因的开放阅读框(open reading
frame, ORF)分析通过NCBI网站(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov)进行操作, 用BioXM 2.6软件预测蛋白
的理论分子量和等电点, 跨膜和疏水性分析分别用
TMHMM Server v.2.0在线程序(http://www.cbs.dtu.
dk/services/TMHMM/)和 http://www.ch.embnet.org/
software/TMPRED_form.html进行, 磷酸化位点用
Net Phos2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/
NetPhos)分析, 氨基酸序列的同源比对和系统进化
树分析用DNAMAN软件进行。
将生长状况良好且长势一致的 ‘冬荷 ’幼苗置
于200 mmol·L-1 NaCl溶液中进行胁迫处理, 分别于
0、1、3、6、1 2、2 4 h 时取根和叶片并提取
总 RNA, 并经反转录合成 cDNA。分别以荷花肌
动蛋白基因 actin和NnNHX1基因为基础设计内参
引物Actin-F、Actin-R和特异引物 SP-F、SP-R进
行荧光定量PCR, 反应程序为95 ℃ 1 min; 95 ℃ 15 s,
60 ℃ 15 s, 72 ℃ 45 s, 40个循环; 然后72 ℃ 10 min,
设定一阈值得到各个反应的CT值, 并根据2-ΔΔCT的
方法(Livak和 Schmittgen 2001)计算出 NnNHX1基
因在不同器官和时间点的相对表达量。
实验结果
1 NnNHX1基因全长 cDNA的克隆
以 ‘冬荷 ’的总RNA为模板反转录合成cDNA
第一链, 通过简并引物经PCR后得到一保守区域的
片段(图 1-A), 并经 3RACE和 5RACE反应后, 分
别得到荷花 NHX1基因的 3和 5端序列(图 1-B、
C), 将各个序列拼接后设计全长引物, 经 PCR扩增
后得到荷花 NHX1基因的全长序列(图 1-D)。将该
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基因命名为NnNHX1并登陆GenBank数据库, 基因
登录号为AB501188。
2 NnNHX1基因的序列分析
分析表明NnNHX1基因的开放阅读框(ORF)为
1 617 bp, 5非编码区(5-UTR)和 3非编码区(3-
UTR)分别为 426 bp和 194 bp (图 2)。预测该基因
编码一个由538个氨基酸残基组成的多肽, 且理论
分子量为 59.12 kDa, 等电点为 8.15。对NnNHX1
的二级结构进行分析发现, 该蛋白中约有45.17%的
α-螺旋、34.39%的无规则卷曲和 20.45%的延伸
的构象。此外NnNHX1还含有 28个磷酸化位点,
其中有 21个丝氨酸(Ser)位点、5个苏氨酸(Thr)位
点和2个酪氨酸(Tyr)位点, 这些磷酸化位点可能在
细胞的信号传导过程中发挥着重要的作用。
疏水性及跨膜区域分析发现, NnNHX1的N-
端高度疏水, 且疏水区域较长, 含有 11个明显的跨
膜结构(图 2、图 3-A)及一个没有跨越液泡膜的疏
水区域(图 3-A), 而C-端虽然较短却高度亲水。进
一步研究表明, NnNHX1的N-端终点面向细胞质
(图 3-B), 推测N-端的疏水区域可能含有与Na+结
合的重要氨基酸残基, 并且可以形成跨膜螺旋, 同
时那个没有完全跨越液泡膜的疏水结构的方向可能
决定了离子移动的趋势; 而几乎全部存在于液泡内
的C-端亲水尾巴(图3-B)可能在对Na+和K+的选择
表 1 试验中所用引物及其用途
Table 1 Primers and their usage in this experiment
引物 序列(5→ 3) 用途
F1 CCGGAACTTCATGACCATCatnhtnttygg 简并 PCR
R1 GCAGGTGCTGAACCAGgayganacncc
Oligo dT adapter AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT 3RACE
adapter-R AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC
GSP3-1 TGGTTACTGGTCTGCTCA
GSP3-2 CGGTATTGTGATGTCCC
GSP5-1 GGGACATCACAATACCG 5RACE
GSP5-2 AGCAGACCAGTAACCACT
GSP5-3 TGTACCAACAGCACCGA
Full-F GCATCCCAAGTTCCGTTGGCTG 全长
Full-R GCTACACTTACACAGCCTCCAC
Actin-F ACCTTCAATGTGCCTGCC RT-PCR
Actin-R GCAAGGTCCAACCGAAGG
SP-F TGCCTTCACCGAAACACT
SP-R ACCCCAGTAATAGTGAACAG
图 1 NnNHX1基因的 PCR扩增
Fig.1 The PCR amplification of NnNHX1
M: DNA marker; A: NnNHX1中间保守片段; B: NnNHX1 3RACE; C: NnNHX1 5RACE; D: NnNHX1 cDNA全长。
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图 2 NnNHX1基因 cDNA序列及其编码的氨基酸序列
Fig.2 The cDNA and deduced amino acid sequence of NnNHX1
下划线表示推测的跨膜区域(TM); 方框部分为氨氯吡嗪咪结合位点; 星号表示终止密码子。
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图 3 NnNHX1的疏水性分析及跨膜区域预测
Fig.3 The hydrophobicity and putative transmembrane
domains analysis of NnNHX1
性吸收过程中发挥调节作用。如将人Na+/H+逆向
转运蛋白NHE1的C-端去掉之后会改变该蛋白对
胞液pH值的敏感性(Wakabayashi等1992); 将拟南
芥AtNHX1的亲水C-端去掉后, 则可导致Na+/H+运
输的相对比率的增长(Yamaguchi等 2003)。因此,
NnNHX1的跨膜结构和亲水尾巴可能在Na+的转运
过程中起着重要作用。
氨基酸序列比对表明, 荷花NnNHX1的序列与
葡萄VvNHX1、水稻OsNHX1、大麦HvNHX1、菊
花CmNHX1及拟南芥AtNHX1等的序列有着较高的
同源性, 相似性依次为 81.52%、77.18%、75.46%、
74.95%和 73.75%, 尤其在这些蛋白的跨膜区域更
是高度相似。与其他 NHX1 蛋白一样, 在荷花
NnNHX1中也存在着高度保守的氨氯吡嗪咪结合位
点 LFFIYLLPPI (Leu81~Ile91) (图 4), 该位点可以识
别Na+/H+逆向转运蛋白的竞争性抑制剂氨氯吡嗪
咪及其类似物, 从而抑制NHX1的转运活性。
将荷花NnNHX1与其他Na+/H+逆向转运蛋白
构建系统进化树, 结果显示Na+/H+逆向转运蛋白可
以明显的分为两簇(图5), 即质膜型Na+/H+逆向转运
蛋白SOS1和液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白NHX1,
而NnNHX1显然属于液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋
白。在NHX1中又可以分为单子叶型NHX1和双
子叶型NHX1两个亚簇, 而荷花NnNHX1与葡萄
VvNHX1等双子叶植物NHX1的亲缘关系较近, 与
芦苇PaNHX1等单子叶植物NHX1的关系相对较远,
这也可以从基因进化角度为荷花这一古老的被子植
物虽具有单子叶植物的许多特征, 但在系统分类上
却应属于双子叶植物的观点提供一定的依据。
3 NaCl胁迫下NnNHX1基因的表达分析
荧光定量 PCR 结果显示, 正常条件下荷花
NnNH X1 基因在植株的根和叶中均有表达, 即
NnNHX1为组成型表达, 且无明显的组织特异性。
但经NaCl诱导后, NnNHX1在植株中的表达量开始
增加, 其中根中 1 h时的表达量便接近最高, 之后
表达量急剧下降, 至 3 h时达到极低水平并基本维
持在这一水平; 而叶片中NnNHX1基因的表达量在
6 h时达到最高, 约为对照的 5倍, 之后表达量开始
下降, 24 h时降至对照的 1/6左右(图 6)。荷花
NnNHX1基因的这种表达特性与拟南芥AtNHX1基
因(Apse等 1999; Gaxiola等 1999)、菊芋HtNHX1
基因(严一诺等 2007)和番杏 TtNHX1基因(吕慧颖
等 2004)等的表达情况基本一致。而NnNHX1基因
在根和叶中不同的表达模式可能与这两种器官之间
的差异有关, 即由于叶肉细胞中含有丰富的大液泡
使得叶片成为NnNHX1基因最主要的功能器官, 因
此, 在NaCl诱导之后叶片中的表达量理应高于根中
的表达水平; 但由于根系是植株中最早遭受盐胁迫
的部位, 使根中NnNHX1基因的表达量在胁迫后的
短时间内便升至最高。
讨　　论
植物的耐盐性是一个由众多耐盐机制和多个
耐盐相关基因相互调控协作的复杂的数量性状(Shi
等 2000), 但转单一的Na+/H+逆向转运蛋白基因如
N H X 1 却可以显著地提高转基因植株的耐盐性
(Apse等 1999; Zhang和 Blumwald 2001; Porat等
2002; Ruiz和 Blumwald 2002), 因为 NHX1基因编
码的蛋白可以将细胞中过多的Na+区隔化于植物的
液泡中, 这就避免了Na+在细胞质中的过度积累, 从
而减轻了Na+对细胞的伤害。因此, 发掘并研究这
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一类优异的耐盐基因对了解植物的耐盐机制和培育
耐盐新种质具有重要的意义。
本实验以花期较晚且耐盐性较强的荷花名品
‘冬荷’为材料, 通过同源克隆的方法分离到了一个
液泡膜型 Na +/H+逆向转运蛋白基因, 并命名为
NnNHX1。序列分析和进化树分析都表明该基因
与其他已知的NHX1基因高度同源, 具有相似的跨
膜结构和亲疏水性, 而与位于细胞质膜上的负责调
控Na+外排的质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因亲缘
关系较远。虽然关于NHX1基因在NaCl胁迫下的
图 4 NnNHX1与其他物种NHX1的氨基酸序列比较
Fig.4 The amino acid sequences comparison of NnNHX1 with other Na+/H+ antiporters
图中下划线表示氨氯吡嗪咪结合位点, 背景颜色从深到浅依次表示相似性大于或等于 10 0%、7 5% 和 50 %的氨基酸。各氨基
酸序列的来源及登录号为: AtNHX1 (拟南芥 Arabidopsis thaliana, AF510074)、OsNHX1 (水稻Oryza sativa, AB021878)、VvNHX1
(葡萄 Vitis vinifera, AY634283)、CmNHX1 (菊花 Chrysanthemum morifolium, EF396235)、HvNHX1 (大麦 Hordeum vulgare,
AB0 8 91 9 7 )。
表达情况已有一定的研究(Apse等1999; Gaxiola等
1999; 吕慧颖等 2004; 严一诺等 2007), 但对水生植
物中NHX1基因的表达特性的研究还相对较少, 尤
其是著名观赏植物荷花的NHX1基因在盐胁迫下的
表达特性至今未有相关报道。本研究通过高灵敏
的荧光定量 PCR方法对荷花NnNHX1基因的表达
特性进行了分析, 并初步掌握了其在NaCl胁迫下的
表达规律, 即NnNHX1基因在植株的根和叶中均有
表达, 但短时的盐胁迫可促使其表达增强, 且在叶
片中的最大表达量高于在根中的最大表达量, 而该
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基因的表达量的增加可以使植物体内合成更多的
Na+/H+逆向转运蛋白, 提高将细胞中多余的Na+进
行区隔化的效率, 从而从根本上提高植物的耐盐
性。因此, 本试验中对 NnNHX1基因的研究为下
一步对该基因进行遗传转化与功能验证、并最终
通过转基因手段培育出高耐盐的荷花新种质, 丰富
咸水与盐水湖泊中水生植物的种类, 以及进行水体
淡化等工作奠定基础, 具有重要的经济和社会意
义。
图 5 NnNHX1的系统进化树分析
Fig.5 The phylogenetic analysis of NnNHX1
图 6 NnNHX1基因的荧光定量 PCR分析
Fig.6 Fluorescence quantitative PCR analysis of NnNHX1
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