全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (1): 83~87 83
收稿 2013-08-12　　修定 2013-11-13
资助 甘肃省科技支撑计划(0804NKCG082)、国家自然科
学基金(30960043)和甘肃省中小企业创新基金(1110-
FCCG112)。
* 通讯作者(E-mail: luoguanghong@163.com; Tel: 0936-
8280003)。
锁阳种子生活力测定及前处理的方法
王进1,3, 罗光宏1,2,*, 张勇1,3, 颜霞1, 祖廷勋2,3, 张有富1
河西学院1农业与生物技术学院; 2凯源生物技术开发中心; 3甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室, 甘肃张掖
734000
摘要: 以野生充分成熟的锁阳净种子为材料, 研究了附属物清除、硬实破除及生活力测定的方法。结果表明, 清除锁阳种
子附属物最有效的方法是开水烫种 , 冷至室温浸种24 h后用尼龙纱网搓揉和1%的NaOH溶液处理。破除硬实 ,
去除种皮最适宜的方法是1.0 mol·L-1的NaOH处理5 h、1.5 mol·L-1的NaOH处理4~5 h、2.0 mol·L-1的NaOH处理3~5 h。测定
锁阳种子生活力的最佳方法是20 ℃光照条件下离体培养15 d。
关键词: 锁阳种子; 生活力; 离体培养; 硬实; 附属物
Pretreatment Methods and Determination of Seed Viability in Cynomorium
songaria Rupr Seeds
WANG Jin1,3, LUO Guang-Hong1,2,*, ZHANG Yong1,3, YAN Xia1, ZU Ting-Xun2,3, ZHANG You-Fu1
1College of Agriculture and Biotechnology, 2Kaiyuan Bio-Tech Development Center, 3Microalgae Engineering Research Center of
Gansu Province, Hexi University, Zhangye, Gansu 734300, China
Abstract: Using wild, fully mature and wet seeds of Cynomorium songaria as materials, the different methods
to remove appurtenances, break hard seedness and determinate seed viability were studied. The results showed
that the most effective method to remove seeds appurtenances was boiling seeds, soaking seeds for 24 h after
cooling to room temperature, and then rubbing with nylon gauze and treating with 1% NaOH solution. The
most suitable method for breaking hard seeds was treating with 1 mol·L-1 NaOH for 5 h, 1.5 mol·L-1 NaOH for
4–5 h, and 2 mol·L-1 NaOH for 3–5 h. The best method to measure seed viability was culturing in vitro for 15 d
under the condition of light of 20 ℃.
Key words: Cynomorium songaria; seed viability; culturing in vitro; hard seeds; appurtenances
锁阳为锁阳科(Cynomoriaceae)锁阳属(Cyno-
morium)多年生肉质寄生草本种子植物(马毓泉
1989), 多寄生于蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属
(Nitraria)、霸王属(Zygophyllum) (陈叶等2010)、
骆驼蓬属(Peganum) (王进等2011)植物的根部。于
寄主的分布系统相同, 锁阳多生于干旱沙漠地带
及荒漠区的湖盆边缘和洪积、冲积扇缘地带的盐
渍化沙地(马毓泉1989; 黄林芳等2010), 被列为名
贵中药材的上品, 素有“沙漠人参”之称。现代研究
表明, 锁阳在抗肿瘤、调节人体免疫、延缓衰老
和防治心血管疾病等方面也具有重要作用(国家药
典委员会2005; 王一峰等2006; 陶晶等1999)。除药
用价值外, 锁阳还可提炼栲胶, 用于酿酒和饲料
等。因此它具有重要的经济和药用价值(陈圆华等
2005; 张思巨和张淑运1991)。近年来由于掠夺式
采挖, 使药源不断减少, 锁阳野生资源已处于濒临
枯竭状态(高永1996)。为拯救和保护锁阳资源, 结
合生态恢复和盐碱地改造, 在西北干旱地区进行
人工种植锁阳刻不容缓(金自学2001)。
附属物和种子硬实是物种传播延续对环境的
一种特殊适应, 附属物是为了更好的完成传播途
径, 而硬实特性是对极端环境的一种适应(王进等
2010)。影响锁阳种子发芽的原因之一就是种子表
面的附属物和本身具有的硬实特性。因此, 对附
属物清除和硬实破除前处理显得尤为重要。
同时, 种子生活力是种子发芽的潜在能力, 对
预测休眠种子的发芽力和快速预测种子发芽率具
有重要意义。研究锁阳种子生活力测定方法, 对
植物生理学报84
锁阳种子质量标准制定、种子质分级及提高接种
率具有重要意义。在测定种子生活力的方法中,
应用最广的是德国莱康(Lakon)于1942年提出的
TTC (2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride)法、红墨
水染色法、溴麝香酚蓝染色法和离体胚培养法等
(尹燕枰等1997; 傅家瑞等1992; 沈宇峰等2008)。
本实验采用物理机械方法和化学方法, 清除种子
外的附属物质及破除种子硬实, 后用TTC染色法、
红墨水染色法、溴麝香酚蓝染色法、靛蓝洋红染
色法和离体胚培养法处理去种皮种子, 确定最佳
方法, 为进一步了解锁阳种子的萌发特性提供科
学依据。
材料与方法
1 材料来源
2008年8月于甘肃省武威市民勤县泉山镇西
六村一社(38°51′N, 103°23′E)海拔1 334 m处, 采集
到充分成熟的寄生于唐古特白刺根部的锁阳(Cyno-
morium songaria Rupr)果穗, 在实验室内经过脱粒
清选精选, 获净种子300 g, 置入4 ℃冷藏箱中备用。
2 试验方法
2.1 不同处理对锁阳种子附属物清除及硬实破除
的试验
取锁阳种子100粒, 置入30 mL烧杯中, 用6种
不同方法处理种子。(1)用500万单位的果胶酶:纤
维素酶(1:1)混合液在30 ℃下处理24 h; (2)用开水
烫种, 冷至室温浸种24 h后用尼龙纱网搓揉; (3)用
浓硫酸处理60 min, 用尼龙纱网搓揉; (4)用1%的
NaOH溶液浸种3 h; (5)用浓HCl浸种60 min; (6)用
10%的NaClO浸种60 min。以冷水浸种24 h后尼龙
纱网搓揉的种子为对照, 测定附属物清除率。附
属物清除率(%)=清除附属物的种子数/供试种子
数×100%。硬实率(%)=硬实种子数/供试种子数×
100%。每个处理重复4次。
2.2 不同浓度NaOH处理对锁阳种子硬实率和种
胚生活力的影响
取开水烫种处理的种子 , 用1、2、3、4和
5 mol·L-1的NaOH处理0.5、1.0、1.5和2.0 h, 之后
用蒸馏水浸泡24 h, 测定硬实率。同时用NaOH处
理去皮的种子在20 ℃、36 μmol·m-2·s-1的恒温培养
箱内做离体胚培养, 测定生活力。以上每处理重
复4次, 每重复100粒种子。
2.3 不同锁阳种子生活力测定方法
从种子中取出种仁, 用0.1%的HgCl2消毒2
min, 用以下6种方法测定生活力。TTC染色法: 用
1%的TTC溶液在黑暗条件下35 ℃染色24 h。溴麝
香草酚蓝法: 将种子置于0.1%的溴麝香草酚蓝
(BTB)琼脂凝胶薄层培养皿中, 加盖后置于35 ℃的
恒温箱中培养5 h。红墨水染色法: 用5%的红墨水
在35 ℃下染色20 min, 倒去红墨水后用水冲洗至
溶液无色。靛蓝洋红染色法: 用2%的靛蓝洋红在
35 ℃下染色200 min, 倒去靛蓝洋红后用水冲洗至
溶液无色。离体胚培养法: 将种子置于培养皿, 在
20和25 ℃的恒温箱中, 在36 μmol·m-2·s-1光照条件
下培养15 d。以上处理重复4次, 每重复100粒种
子, 以用开水浸泡10 min的种仁为对照处理。
2.4 统计分析
以SPSS 10.0统计软件对数据进行统计分析,
以单因素方差分析(One-way ANOVA)最小显著差
法(LSD)和新复极差法(Dance)在0.05和0.01概率水
平确定各平均值间的差异显著性。分析结果以平
均数±标准差表示。
实验结果
1 不同处理对锁阳种子附属物清除及硬实破除的
影响
从表1可见, 开水烫种处理和1%的NaOH溶液
处理的种子附属物清除率极显著高于其他处理。
果胶酶+纤维素酶混合液处理和NaClO处理种子对
附属物的清除有一定效果, 但清除率极低。HCl处
理对种子上的附属物无清除。冷水浸种后纱布搓
表1 不同处理对锁阳种子附属物清除及硬实破除的影响
Table 1 Influence of different treatments on removing
appurtenances and breaking hard seeds of C. songaria
处理 附属物清除率/% 硬实率/%
对照 33.00±3.00Cc 100±0Aa
果胶酶+纤维素酶 11.33±2.52Dd 100±0Aa
开水 99.67±0.58Aa 100±0Aa
浓硫酸 64.00±4.00Bb 75±4.58Cc
1% NaOH 100.00±0Aa 12±4.00Dd
浓HCl 0±0Ee 100±0Aa
10% NaClO 9.00±2.64Dd 86±3.06Bb
　　同列中不同大写字母表示在0.01水平差异显著, 不同小写字
母表示在0.05水平差异显著。下表同此。
王进等: 锁阳种子生活力测定及前处理的方法 85
揉可使部分附属物清除。
从不同处理对种子硬实破除效果来看, NaOH
处理的种子硬实率为12%, 极显著低于其他处理
(P<0.01), 其次是浓硫酸处理, 第三为NaClO处理,
其硬实率极显著低于剩余4种处理(P<0.01), 其他
处理对硬实率无影响, 仍然是100%。综上所述, 清
除锁阳种子附属物最有效的方法是开水烫种处理
和1%的NaOH溶液处理, 破除硬实最有效的方法是
NaOH溶液处理。
2.2 不同浓度NaOH处理对锁阳种子硬实率和种
胚致死率的影响
从表2来看, 同一NaOH浓度下, 随处理时间的
延长, 硬实率极显著降低(P<0.01); 而在相同时间
处理下, 随NaOH浓度的提高, 硬实率显著降低
(P<0.05)。1.0 mol·L-1的NaOH处理5 h、1.5 mol·L-1
的NaOH处理4~5 h和2.0 mol·L-1的NaOH处理3~5 h
都将硬实率降低为0。
随处理时间的延长, 锁阳种子致死率在同一
浓度下显著降低(P<0.05)。在相同时间处理下, 随
表2 不同浓度NaOH处理对锁阳种子
硬实率和致死率的影响
Table 2 Influence of different concentrations of NaOH
treatment on hard seeds rate and lethality
rate of C. songaria seeds
NaOH浓度/mol·L-1 处理时间/h 硬实率/% 致死率/%
0.5 1 96.25±0.75Aa 1.75±0.96ABCabc
2 82.75±0.85Bb 2.00±0.82ABab
3 73.00±1.47Cc 2.50±1.00Aa
4 51.25±2.56Ef 2.50±0.58Aa
5 33.50±1.55Gh 0.75±0.96BCDd
1.0 1 69.5±2.40Cd 1.00±0.82BCDbcd
2 35.75±1.18FGh 2.00±0.82ABab
3 12.00±0.41Ij 2.00±0.82ABab
4 2.00±0.41Ik 0.50±1.00CDd
5 0±0Jk 0±0Dd
1.5 1 60.00±1.47De 0.50±0.58CDd
2 27.50±1.26Hi 0.25±0.50Dd
3 2.50±0.29Jk 0.25±0.50Dd
4 0±0Jk 0±0Dd
5 0±0Jk 0±0Dd
2.0 1 39.25±1.65Fg 0.25±0.50Dd
2 3.25±0.63Jj 0±0Dd
3 0±0Jk 0±0Dd
4 0±0Jk 0.25±0Dd
5 0±0Jk 0±0Dd
NaOH浓度的提高, 测定的种子致死率有降低趋
势。1.0 mol·L-1的NaOH处理5 h、1.5 mol·L-1的
NaOH处理4~5 h和2.0 mol·L-1的NaOH处理2~5 h都
将将致死率降低为0 (表2)。
锁阳种子生活力很高, 随NaOH处理时间的延
长和浓度的增加, 种子致死率下降, 破除锁阳种子
硬实 , 去除种皮最适宜的方法是1.0 moL·L-1的
NaOH处理5 h、1.5 moL·L-1的NaOH处理4~5 h、
2.0 moL·L-1的NaOH处理3~5 h。
2.3 不同测定锁阳种子生活力的方法
从TTC对种子的染色情况看, 14%种仁通体鲜
红, 86%种仁乳白色, 无染色迹象(图1-A), 从TTC染
色理论判断, 锁阳种子生活力为14%。从溴麝香草
酚蓝染色情况看, 20%种仁表面泛黄色, 52%种仁
乳白色, 28%种子表面微呈蓝色, 种子周围无蓝色
晕圈, 完全死亡种子周围有蓝色晕圈(图1-B), 从其
染色理论看, 种子生活力为20%。从红墨水染色情
况看, 20%种仁浅表染成粉红色, 80%种仁乳白色,
无染色迹象(图1-C), 从其染色理论看, 种子生活力
为80%。从靛蓝洋红染色情况看, 28%种仁通体染
成淡蓝色, 72%种仁乳白色, 无染色迹象(图1-D),
种子生活力为72%。从离体胚培养的结果来看, 在
25 ℃下培养的种仁, 有3%的种仁遭霉菌污染, 其
余种仁新鲜有光泽且种仁长度增加(图1-E), 种子
生活力为97%。在20 ℃下, 所有种仁都新鲜有光
泽, 种仁长度增加(图1-F), 种子生活力为100%。
TTC染色法和溴代麝香草酚蓝法随处理时间的延
长和种子处理条件的改变, 有生活力表现的种子
会显著增加。红墨水染色法、靛蓝洋红染色法结
论则与TTC染色法和溴代麝香草酚蓝法相矛盾。
综上所述, 锁阳种仁质地紧密, 胚呼吸极弱,
用快速染色的方法无法快速测定其生活力, 25 ℃
下离体培养, 会使部分种子遭受霉菌污染而散失
生活力。测定锁阳种子生活力的最佳方法是20 ℃
光照条件下离体培养15 d。
讨　　论
1 种子附属物的种类与清除
种子附属物是种子上的保护物质, 对物种的
延续和在逆境中的繁衍具有重要意义, 其成分与
成熟环境和母体营养有关。生长在干旱荒漠中区
植物生理学报86
锁阳, 其种子着生在富含淀粉的果穗表面, 其表面
的附属物可能是淀粉、果胶和纤维类物质, 因此
遇到强酸或碱, 就会因化学反应而清除。在遇到
热水处理后用机械搓揉的办法也可将其清除, 说
明附属物与种子结合并不太紧密。
2 种皮软化与破除硬实
锁阳种子细小圆滑且有坚硬的种皮, 种子发
芽缓慢, 软化种皮, 使种仁外漏, 是进行生活力测
定的前提。热水处理、浓H2SO4化学处理、NaOH
处理、砂纸机械处理和低温冷冻处理是打破硬实
种子休眠的有效方法, 但结合锁阳种子特征, 选用
NaOH溶液处理种子, 使其种皮中的脂类溶解, 色
素析出, 种子吸胀, 硬实破除。
3 种子生活力测定方法的选择
有研究认为, 硬实种子是充分成熟的种子, 具
有高活力。但该试验中, 因锁阳种子胚乳结构致
密, 种胚呼吸弱, 种胚深埋于胚乳中(苏格尔和包玉
英1999; 李天然等1994), 用TTC染色法、溴麝香草
酚蓝法、红墨水染色法及其原理不能检验其活力
状况(Bekendam和Gob 1979; Woodstock 1973), 这
一结果与陈贵林等(2011)所述锁阳种子生活力的
结论不一致(种胚在强光下用0.5% TTC染色)。本
着成本低廉、省时快速、方法简便, 不受休眠限
图1 不同测定方法的锁阳种子
Fig.1 Different methods of C. songaria seeds
A: TTC染色法; B: 溴麝香草酚蓝法; C: 红墨水染色; D: 靛蓝洋红染色; E: 25 ℃离体胚培养; F: 20 ℃离体胚培养。
制和结果准确的原则, 用离体胚培养法, 根据胚在
培养过程中的变化, 可以判断种子生活力变化。
温度影响种子的呼吸和生长, 但也影响微生
物的活动。对大多数植物, 20 ℃是种子萌发的适
宜温度。由于锁阳种子萌发受休眠限制, 萌发非
常缓慢, 在种仁离体胚培养过程中, 在20 ℃下培养
15 d, 种仁新鲜有光泽; 但在25 ℃下培养15 d, 部分
种仁因微生物污染而水肿或腐烂, 就无法判断其
生活力。因此, 选择20 ℃下种仁培养15 d能更准
确判断种子生活力。
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