全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (9): 1513~1523　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0226 1513
收稿 2015-04-17　　修定 2015-08-24
资助 国家科技支撑计划(2013BAD22B01和2015BAD15B03)和
青年科学基金项目(31301326)。
* 共同第一作者。
** 共同通讯作者(E-mail: cjzou@bio.ecnu.edu.cn, Tel: 021-
6223359; E-mail: hcjing@ibcas.ac.cn, Tel: 010-62836576)。
高粱SbHKTs基因的克隆及其在拟南芥中的功能验证
冯雪1,2,*, 王甜甜2,3,*, 郝怀庆2, 邹春静1,**, 景海春2,**
1华东师范大学生命科学学院, 上海200062; 2中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室, 北京100093; 3东营市园林局,
山东东营257091
摘要: 本试验克隆了高粱HKT (high affinity potassium transporter)基因家族3个成员SbHKT1;4, SbHKT1;5和SbHKT2;1, 并分
析比较了这些基因在拟南芥中转运钠、钾离子的特性以及在抗旱方面的作用。结果表明, 外界高浓度钠胁迫对各转基因
植株的生长均有一定的影响, 但这种抑制作用可在外源添加足量钾离子的情况下得到不同程度的缓解。此外，干旱胁迫
下，转基因植株表现出优于突变体的抗旱性。这些结果表明，高粱HKT基因不仅在作物耐盐方面具有重要作用, 同时在
植物抗旱中也具有一定的功能。
关键词: 高粱HKT基因; 拟南芥; 耐盐性; 抗旱性
Cloning of Sorghum HKT Genes and Their Function Validation in Arabidopsis
FENG Xue1,2,*, WANG Tian-Tian2,3,*, HAO Huai-Qing2, ZOU Chun-Jing1,**, JING Hai-Chun2,**
1School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200062, China; 2Key Laboratory of Plant Resources, Institute
of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China; 3Dongying Landscape and Greening Department, Dongying,
Shandong 257091, China
Abstract: Three sorghum high affinity potassium transporter genes, SbHKT1;4, SbHKT1;5 and SbHKT2;1,
were cloned and constitutively expressed in Arabidopsis hkt1-1 mutant, respectively, and the tolerance to salt
and drought of the transgenic lines analyzed. Upon high Na+ stress, the growth of all transgenic lines was inhib-
ited, and this phenotype could be obviously alleviated when adequate K+ was added. After water stress, we
found that transgenic lines were more tolerant to drought than athkt1-1 mutant line. These results indicated that
SbHKTs not only played a role in tolerance to salt stress, but also exerted significant function in the presence of
drought-stress.
Key words: sorghum HKT; Arabidopsis; salt resistance; drought tolerance
HKT蛋白家族(high affinity potassium trans-
porter, HKT)是一类高亲和性钾离子转运蛋白家族,
定位在细胞膜上(Waters等2013)。大量研究表明该
蛋白在盐胁迫下具有选择性吸收钠、钾离子的功
能。模式植物拟南芥中仅有的HKT基因家族成员
是AtHKT1;1, 该基因作用于根部木质部薄壁细胞
膜, 高盐胁迫下可卸载根中木质部的钠离子, 限制
其往植株地上部的运输, 从而一定程度上缓解地
上部钠离子的毒害(Rus等2004)。小麦中Nax2位点
在盐胁迫中较为重要, 其中的TmHKT1;5-A基因是
发挥作用的关键基因, 可以减少植株叶片中的钠
离子含量(Munns等2012)。TaHKT1;5-D是一个钠
离子转运体, 可卸载根部木质部导管中的钠离子,
同时限制小麦根部钠离子向地上部的运输。研究
发现, TaHKT1;5-D RNAi株系地上部叶片中的钠离
子含量明显高于正常植株(Byrt等2014)。较其他物
种相比, 水稻(Oryza sativa)中拥有较多的HKT基因
家族成员。粳稻品种‘日本晴’中有OsHKT1;5、
OsHKT2;1和OsHKT2;2等9个成员(Garciadeblas等
2003; Ren等2005)。Yao等(2010)对OsHKT2;1的研
究中发现, 在酵母和蛙卵系统中, 外源添加钾离子
与钙离子可以使OsHKT2;1调控的钠离子吸收能力
减弱。总之, HKT基因在植物遭受盐胁迫的Na+/K+
平衡中具有重要的调控作用。
作为世界第五大栽培作物, 高粱具有生物产
量高、光合效率高、耐贫瘠、耐旱、耐盐碱等特
植物生理学报1514
性, 是一种具有较大发展潜力的优质能源作物(邵
艳军2006; Adedayo等2014; Matsakasa等2014; Pra-
shant等2014)。本实验室前期的研究发现, 高粱SbH-
KT1;4基因既具有显著的Na+转运功能, 也具有在
Na+胁迫下选择性吸收K+的特性, 参与了细胞内Na+/
K+平衡的调节(Wang等2014), 这也是植物体应对外
界盐胁迫的一种自我保护机制。事实上植物响应
盐胁迫的过程可分为两个阶段, 即初期的渗透胁迫
阶段和后期的离子毒害阶段(Zhu等2004; Munns和
Tester 2008)。而盐害往往会引起植物的生理干旱,
这两种非生物胁迫均与植物对渗透胁迫的响应息
息相关。因此, 将该基因的耐盐性与抗旱性综合起
来评价将更有助于深入了解其生物学功能。
高粱SbHKT1;4、SbHKT1;5和SbHKT2;1基因
与拟南芥AtHKT1;1具有同源性, 因此, 本试验将克
隆到的基因转入拟南芥突变体athkt1-1中进行功能
互补, 以期进一步解析高粱HKT基因的功能。以高
粱HKT基因家族成员SbHKT1;4、SbHKT1;5与
SbHKT2;1的转基因拟南芥株系为材料, 比较这些
植株在盐胁迫下的生长情况, 并对其地上部鲜重
与钠、钾离子的含量进行了深入分析, 旨在阐明
SbHKT1;4、SbHKT1;5和SbHKT2;1的Na+/K+转运
特性及其与植物耐盐的关系。同时采用PEG6000
模拟干旱的方法, 通过测定主要渗透调节物质的
含量和抗氧化酶的活性对供试植株的抗旱性进行
比较, 进而获得该基因在抗旱方面的相关信息, 为
后续的作物抗逆育种奠定基础。
材料与方法
1 试验材料
供试拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)材料为野
生型Col (gl1), 突变体athkt1-1 (AT4g10310的T-DNA
插入突变株系), 转基因株系SbHKT1;5/at hkt1-1、
SbHKT1;4/athkt1-1和SbHKT2;1/athkt1-1。
2 供试转基因拟南芥植株的获得
2.1 SbHKTs基因的克隆、载体构建以及拟南芥的
遗传转化
设计特异性引物(表1), 分别扩增高粱[Sorghum
bicolor (L.) Moench]的3个HKT基因: SbHKT1;4
(Sb06g027900)、SbHKT1;5 (Sb03g021590)和Sb-
HKT2;1 (Sb10g029000)。PCR产物加A反应后连接
到Gateway系统入门载体pCR8/GW/TOPO上, 鉴定
无误的重组入门载体, 提质粒用于LR反应, 将连接
产物转化大肠杆菌DH5α菌株, 选用pMDC32为植
物过表达载体, 卡那霉素抗性, 筛选鉴定阳性单克
隆, 提质粒备用。通过农杆菌(GV3101)介导的方法
分别将重组质粒转入athkt1-1中 , 用潮霉素(27
μg·mL-1)对转化得到的拟南芥种子进行逐代筛选。
2.2 转基因拟南芥植株的SbHKTs基因表达分析
提取转基因植株总RNA, 反转录成cDNA, 取1
µL为模板, 用Actin引物以不同转基因株系的cDNA
为模板扩增, 循环数28个, 取等量PCR产物电泳。
根据电泳条带的亮度调整模板量 , 直至亮度一
致。分别用高粱SbHKTs基因检测引物(表2), 以调
整好的模板量进行PCR, 根据琼脂糖凝胶电泳的条
带亮度比较SbHKTs基因的表达差异。
表1 扩增基因所用的引物序列
Table1 Primers of SbHKT genes cloning
引物名称 序列(5′→3′) 扩增基因
Sb06g027900F ATGGCCGGAGCGCATAAGTT SbHKT1;4
Sb06g027900R CTAACTAAGTTTCCAGGCTTTGCCT SbHKT1;4
Sb03g021590F ATGAAGTCCATCTCCG TCCCTAG SbHKT1;5
Sb03g021590R TTAGCCTAGCTTCCATGCCTGAC SbHKT1;5
Sb10g029000F ATGCCTATTCGGTTCCATGTCTTG SbHKT2;1
Sb10g029000R TCACCTCCTGCG TCGCTGTC SbHKT2;1

表2 基因检测引物
Table 2 Primers of SbHKTs expression in transgenic
Arabidopsis
引物名称 序列(5′→3′) 检测基因
Sb06F GGGAGAAGCTGTCCAACG SbHKT1;4
Sb06R GAGAAGCCAACATTTCCATAA SbHKT1;4
Sb03F ATGGCGTCCTTCAAGTC SbHKT1;5
Sb03R CAGCAGGTGGTCGTAGC SbHKT1;5
Sb10F TCTCCTCTGCTGCCTGAACTGG SbHKT2;1
Sb10R CGTCCTGCACCGACAACAAT SbHKT2;1

3 转基因拟南芥植株Na+/K+转运表型分析与离子
含量测定
3.1 表型分析
各转基因植株在1/2MS培养基上发芽生长10
d后, 转移至相应表型分析培养基(Mascher等2002;
Rus等2004)。
冯雪等: 高粱SbHKTs基因的克隆及其在拟南芥中的功能验证 1515
NaCl盐敏感表型分析: 对照(基本培养基)、处
理1 (基本培养基+75 mmol·L -1 NaCl, 简写为
75Na)、处理2 (基本培养基+75 mmol·L-1 NaCl+5
mmol·L-1 KCl, 简写为75Na+5K)。
缺钾胁迫表型分析: 处理1 (缺钾培养基+20
mmol·L-1 NaCl, 简写为20Na+0K), 处理2 (缺钾培养
基+20 mmol·L-1 NaCl+5 mmol·L-1 KCl, 简写为
20Na+5K)。
于竖直板处理7 d后拍照记录表型。取照后称
重记录鲜重, 每个株系至少20株, 每处理3次重复。
3.2 离子含量测定
将各转基因拟南芥种子播种于发芽培养基中
生长3周, 挑选整齐一致的植株, 转移至液体基本
培养基和液体缺钾培养基中生长2 d。然后将NaCl
和KCl母液加入液体培养基中, 使终浓度与竖直板
的实验处理组一致(见3.1节)。48 h后取地上部,
105 ℃杀青, 65 ℃烘至恒重, 待测钠、钾离子含量
(Wang等2014)。每个株系至少取50株进行测定,
每处理2次重复。
4 干旱胁迫下供试转基因拟南芥植株的相关指标
测定
试验采用PEG6000模拟干旱的方法进行。先
将消毒后的拟南芥种子置于1/2MS培养基中培养
13 d, 稍后移入装有蛭石的育苗盘中, 用1/4Hoag-
land营养液培养(Wang等2014)。15 d后开始处理幼
苗: 设置对照(1/4Hoagland营养液)、10% (10%
PEG6000+1/4Hoagland营养液 )和20% (20%
PEG6000+1/4Hoagland营养液) 3个浓度梯度, 每处
理3次重复 , 期间量取等体积处理液灌溉幼苗3
次。于处理后第14天取样, 分别用于测定可溶性总
糖(total solubal sugar, TSS)、游离脯氨酸(free proline,
FP)的含量, 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,
SOD)、愈创木酚过氧化物酶(guaiacol peroxidase,
GPX)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和抗坏血酸过氧
化物酶(ascorbate peroxidase, APX)的活性。拟南芥
培养间的温度为21 ℃, 光周期为16 h/8 h。
TSS含量采用蒽酮法测定(高俊凤2006)。FP含
量采用磺基水杨酸法测定(Bates等1973; 张殿忠等
1990)。SOD含量采用氮蓝四唑(nitrobule tetrazolium,
NBT)光还原法测定(Hwang等1999)。GPX活性采用
愈创木酚法测定(Alves等2006), APX活性采用抗坏
血酸法测定(Zhu等2004), CAT活性通过记录单位时
间内过氧化氢的减少量来计算(Azevedo等1998)。
实验结果
1 转基因拟南芥植株的获得及基因表达分析
本试验通过PCR克隆得到高粱HKT基因Sb-
HKT1;4、SbHKT1;5和SbHKT2;1, 片段大小分别为
1 692、1 497和1 638 bp。构建拟南芥表达载体, 获
得重组质粒35S::pMDC32-SbHKT。供试的各转基因
植株均为逐代筛选后的T3代纯合株系(表3)。进一
步利用RT-PCR检测了各转基因株系的基因表达情
况, 结果(图1)显示, HKT基因在相应的转基因植株中
均有表达, 表明转化后的植株可用于后续研究。
表3 转SbHKT基因的拟南芥植株统计
Table 3 The number of SbHKTs transgenic plants in
Arabidopsis
转基因植株 阳性株系(T1) 阳性株系(T2) 纯合株系(T3)
SbHKT1;4/athkt1-1 11 6 6
SbHKT1;5/athkt1-1 9 3 3
SbHKT2;1/athkt1-1 6 5 3

图1 转基因拟南芥植株中SbHKTs基因的表达
Fig.1 Expression patterns of SbHKT genes in transgenic
Arabidopsis
2 转基因拟南芥植株的Na+/K+转运特性分析
2.1 转基因拟南芥植株的NaCl敏感性比较
由图2-A可看出, 在对照培养基上, 各供试植
株的表型无明显差异。当添加75 mmol·L-1 NaCl
后, 各植株均受到不同程度的盐胁迫, 地上部鲜重
明显降低(图2-B)。钠、钾离子含量测定结果表明,
各植株的地上部钠离子含量较对照有所上升, 而钾
离子含量则相应减少, 从而导致整个植株的Na+/K+
比显著升高(图2-C~E)。从图2-E可看出, 75 mmol·L-1
NaCl处理的SbHKT1;5/athkt1-1与SbHKT2;1/athkt1-1
植物生理学报1516
图2 转基因拟南芥植株的钠敏感表型分析
Fig.2 Analysis of Na senstive phenotype of SbHKTs transgenic lines
标尺代表1 cm; 小写字母代表同一处理不同拟南芥植株的差异显著(P<0.05)。下图同此。
的Na+/K+比显著低于SbHKT1;4/athkt1-1 (P<
0.05)。在75 mmol·L-1 NaCl+5 mmol·L-1 KCl处理中
发现, 各植株的盐胁迫表型有所恢复, 其Na+/K+比也
相应降低, 但SbHKT1;5/athkt1-1与SbHKT2;1/athkt1-1
的变化不及SbHKT1;4/athkt1-1明显。
以上结果表明, 高粱SbHKTs转基因拟南芥植
株对钠离子的敏感性不同。与SbHKT1;5和Sb-
HKT2;1相比, SbHKT1;4表现出明显的钾离子依赖
的钠离子敏感表型。
2.2 转基因拟南芥植株的缺钾胁迫表型分析
为了进一步分析SbHKTs在植株体内钾离子平
衡中的作用, 本试验对供试植株进行了缺钾胁迫
处理。在缺少钾离子并添加20 mmol·L-1 NaCl的培
养基中, 各供试植株表现出不同程度的盐胁迫表
型, 其敏感性由强到弱依次为SbHKT1;4/athkt1-1、
SbHKT2;1/athkt1-1、SbHKT1;5/athkt1-1。Sb-
HKT2;1/athkt1-1与SbHKT1;5/athkt1-1的地上部鲜
重显著高于相同处理下的SbHKT1;4/athkt1-1 (图
3-A和B)。对处理后植株的离子含量进行分析发
现(图3-C~E), SbHKT2;1/athkt1-1与SbHKT1;5/at-
hkt1-1的钠离子含量明显低于SbHKT1;4/athkt1-1,
钾离子含量较高, 表现出较低的Na+/K+比。当添加
冯雪等: 高粱SbHKTs基因的克隆及其在拟南芥中的功能验证 1517
图3 转基因拟南芥植株的缺钾胁迫表型分析
Fig.3 Analysis of K sensitive phenotype of SbHKTs transgenic lines
5 mmol·L-1 KCl后, 各植株的盐胁迫表型均有所缓
解, 钠离子含量降低, 钾离子含量升高, SbHKT2;1/
at hkt1-1与SbHKT1;5/athkt1-1呈现出低于SbH-
KT1;4/athkt1-1的Na+/K+比。
上述试验结果表明, 当培养基中缺少钾离子
时, 各转基因植株受到不同程度的钠离子胁迫。
此时, 该基因可吸收外界环境中的钠离子, 为钠离
子转运载体; 在添加足量的钾离子后, 各转基因植
株所受胁迫症状有所减轻。此时, 该基因由Na+转
运体转变为Na+-K+共转运体, 从而保证了植株体内
的Na+/K+平衡。
3 转基因拟南芥植株的抗旱性分析
3.1 干旱胁迫对转基因拟南芥植株渗透调节物质
及活性氧代谢的影响
干旱胁迫下, 在植株的耐受范围内, 与植株抗
旱性成正相关的各项指标值均呈现增长趋势(李洁
2014), 一旦所受胁迫超出其耐受范围, 相应含量就
会降低或增长率减慢。由图4和5可以看出, 干旱
处理后, 各指标测定值较对照相比均有较明显的
增加。
植物遭受干旱胁迫时, 游离脯氨酸、可溶性
总糖、甜菜碱等渗透调节物质在植株体内发挥重
要调节作用(Jones等1980; Ashraf和Iram 2005)。本
文测定了在不同程度干旱处理的各转基因拟南芥
植株体内FP与TSS的变化。结果(图4)表明, 随着
PEG胁迫浓度的增加, FP与TSS的含量均呈现先增
加后降低的趋势。20% PEG处理下, SbHKT1;4/
athkt1-1、SbHKT1;5/athkt1-1与SbHKT2;1/athkt1-1
的TSS含量均高于athkt1-1。各植株的FP含量在
20% PEG处理下的差异显著, 呈现出SbHKT2;1/
植物生理学报1518
图4 不同干旱胁迫对供试转基因拟南芥植株渗透调节物质的影响
Fig.4 Effects of different drought stress on osmotic regulation substances in transgenic lines
图5 不同干旱胁迫对转基因拟南芥植株活性氧代谢的影响
Fig.5 Effects of different drought stress on reactive oxygen metabolism in transgenic lines
athkt1-1>SbHKT1;4/athkt1-1>SbHKT1;5/athkt1-1>
athkt1-1的趋势。各供试植株的变化表明, 体内TSS
和FP含量的增加是其应对干旱的重要策略之一。
植物遭受干旱刺激时另一个重要的变化就是
体内活性氧自由基(reactive oxygen specise, ROS)
的增加, 普遍认为植株体内抗氧化酶活性的增加
有助于清除大量产生的ROS, 减轻细胞受到的伤害
(Mascher等2002)。本试验测定了在该过程中起重
要作用的SOD、GPX、APX和CAT的活性。结果
(图5)表明, 随处理浓度增长, 供试植株的SOD活性
呈现先增加后降低的趋势, 而CAT、GPX和APX活
性基本呈现增长的状态。这些结果表明, 遭遇干
旱胁迫时, SOD、GPX、APX和CAT活性不同程度
的增加有利于植株抵御干旱。
冯雪等: 高粱SbHKTs基因的克隆及其在拟南芥中的功能验证 1519
3.2 转基因拟南芥植株各指标的方差分析及相关
分析
对供试转基因拟南芥的不同测定指标进行方
差分析, 由表4可以看出, 在处理间、品种间及其
互作间, TSS、FP、SOD、GPX、CAT和APX的含
量或活性均存在极显著差异(P<0.01)。对供试转
基因拟南芥的6个生理指标进行相关分析, 得到其
相关系数矩阵(表5)。TSS分别同SOD、FP、GPX
存在极显著相关性(P<0.01), 与APX、CAT的相关
性显著(P<0.05), SOD与FP, FP与GPX, GPX与APX
之间相关性极显著(P<0.01)。由此可见, 各指标之
间存在不同程度的相关性。
表4 干旱胁迫条件下转基因拟南芥植株不同指标的方差分析F值
Table 4 F values of variance analysis of different parameters in trasgenic lines under drought stress
变异来源 TSS SOD FP GPX APX CAT
处理 4 725.610** 98.303** 1 524.189** 459.719** 638.961** 75.860**
株系 71.966** 5.453** 72.982** 94.869** 4.210** 26.176**
处理与株系 68.995** 4.282** 33.367** 36.065** 15.176** 10.663**
　　**代表P<0.01显著性水平。
表5 转基因拟南芥植株各指标的相关系数矩阵
Table 5 Correlation coefficient matrix of different indexes in
transgenic lines
指标 TSS SOD FP GPX APX CAT
TSS 1.00
SOD 0.70** 1.00
FP 0.91** 0.82** 1.00
GPX 0.73** 0.34 0.71** 1.00
APX 0.58* –0.01 0.38 0.75** 1.00
CAT 0.59* 0.15 0.46 0.38 0.39 1.00
　　**和*代表各指标之间相关性的显著性水平(P<0.01, P<0.05)。
CAT、APX三者具有较高的相关性, TSS、FP与
SOD之间的相关性较高。所有处理与植株的组合
可归类为三组(图6-B), 即“0-c”组(红色)、“1-c”组(蓝
色)和“2-c”组(绿色)。“0-c”组处于图形的左边部
分，结合图6-A可知，与“1-c”组和“2-c”组相比, 所
测定指标对“0-c”组的解释度弱一些。APX与GPX
能够很好的反映图中“2-c”组的情况, 而TSS、FP与
SOD能够较好的反映图中“1-c”组的情况。主成分1
与主成分2皆是抗旱性组分, 由此可见, “2-c”组在整
个处理过程中表现出了较强的抗旱性, 具有代表性,
故将其作为后续评价的依据(Dorostkar等2015)。
3.4 转基因拟南芥植株各指标隶属函数值分析
植物的耐旱性是一个由多种因素控制的综合
性状(Huang等2009; Zhu 2002; Miller等2008)。本
试验采用隶属函数值法对各植株的抗旱性做了综
合评价。通过计算转基因拟南芥植株在模拟干旱
条件下的TSS与FP含量, SOD、GPX、CAT和APX
活性的隶属函数值, 获得平均隶属值并对其进行
排序(表7), 由此对各株系的抗旱性做出综合评价
(张卫星等2007)。结果表明, 所有转基因植株的抗
旱性均大于athkt1-1, 其中SbHKT2;1/athkt1-1和
表6 转基因拟南芥植株各指标的主成分贡献率及系数矩阵
Table 6 Principle component loading for measured parameters of transgenic lines
主成分 变化比例/% 累计贡献率 TSS SOD FP GPX APX CAT
主成分1 62.29 62.29 –0.501 –0.342 –0.480 –0.435 –0.336 –0.315
主成分2 20.84 83.13 0.648 0.281 –0.268 –0.603 –0.244

3.3 转基因拟南芥植株各指标的主成分分析
为了明晰不同转基因株系与处理组合的抗旱
性, 本试验进一步采用了主成分分析法对数据进
行解析。其中, 主成分1与主成分2对总体变异的
解释度分别为62.29%、20.84%。总体来说, 二者
的解释度达到83.13% (表6), 能够很好地反映各因
素之间的关系。主成分1主要解释了TSS、FP和
GPX对总体变异的影响, 主成分2则重点解释了
SOD与APX对总体变异的贡献。两主成分均与植
株的耐旱性成正相关。由图6-A可以看出, GPX、
植物生理学报1520
SbHKT1;5/athkt1-1为中抗(middle resistence, MR),
SbHKT1;4/athkt1-1为弱抗性(little resistence, LR),
而athkt1-1则为不抗(no resistence, NR), Col (gl1)的
抗性高于其他株系(高抗, high resistence, HR)。该
结果进一步验证了图6-B的结果。
讨　　论
1 高粱SbHKTs在高盐胁迫下具有调节植株体内
Na+/K+平衡的功能
在外界高盐浓度下选择性吸收钾离子, 维持
体内的Na+/K+平衡, 这是植物耐盐机制的一个重要
内容。在盐芥(Thellungiella halophila)中TsHKT1;2
可以通过高钠条件下选择性吸收钾离子来维持体
内的Na+/K+平衡(Ali等2012)。小花碱茅(Puccinel-
lia tenuiflora)中的PutHKT2;1为Na+-K+共转运体,
可以在低钾及高钠条件下介导钾离子的吸收(Ar-
die等2009)。研究者从赤桉中分离得到2个HKT家
族成员: EcHKT1;1和EcHKT1;2。在异源系统非洲
爪蟾卵母细胞的表达中发现, 该基因的钾离子吸
收能力可在外界有钠离子存在时增强, 在外界无
钠离子的情况下, 也可以选择性吸收钾离子(Liu等
2001)。研究表明, 水稻No-OsHKT2;2/1基因同样
具有高Na+条件下吸收K+的特性(Oomen等2012)。
表7 转基因拟南芥植株不同指标的隶属函数值及耐旱性评价
Table 7 Subordinate function (SF) values of different transgenic lines
株系 TSS SOD FP GPX APX CAT 平均隶属值 抗旱性
SbHKT1;4/athkt1-1 0.40907 0.29804 0.27375 0.47183 0.65898 0.25060 0.3937 LR
SbHKT1;5/athkt1-1 0.22257 0.46597 0.38685 0.32308 0.15107 0.93148 0.4135 MR
SbHKT2;1/athkt1-1 0.77190 0.33514 0.55473 0.64000 0.51760 0.39506 0.5357 MR
athkt1-1 0.12737 0.58794 0.04115 0.02738 0.55418 0.25358 0.2653 NR
Col (gl1) 0.83186 0.57203 0.91878 0.82827 0.77444 0.39590 0.7202 HR

图6 转基因拟南芥植株各指标主成分分析结果
Fig.6 Biplot for measured parameters of tansgenic lines
A: 变量因素图, D: SOD; S: TSS; C: CAT; G: GPX; P: FP; A:
APX。B: 个体因素图, 0: 对照组; 1: 10% PEG处理组; 2: 20% PEG
处理组; c: Col (gl1); h: athkt1-1; 3: SbHKT1;5/athkt1-1; 6: SbH-
KT1;4/athkt1-1; 10: SbHKT2;1/athkt1-1。
本试验发现, 供试的各转基因拟南芥植株的生长
在盐胁迫下均受到不同程度的影响, 其钠离子敏
感性依次为: SbHKT1;4/athkt1-1>SbHKT2;1/at -
hkt1-1>SbHKT1;5/athkt1-1, 且此敏感性可随着足
量钾离子的添加而得到缓解, Na+/K+比值趋于正
常, 从而维持植株的正常代谢水平。这与前人关
于HKT的Na+/K+转运特性的研究结果一致(Ali等
2012; Oomen等2012), 也很有可能是高粱相比其他
植物更为耐盐的一个重要原因(Wang 等2014)。
2 高粱SbHKTs具有提高植株抗旱性的功能
2.1 干旱胁迫下植物体内渗透调节物质的响应
普遍认为, 逆境胁迫时, 植物体内渗透调节物
质的增加可以降低细胞的渗透势使其正常吸水
(Pinheiro等2001; Kavi等2005)。除此之外, 渗透物
质的积累还可以调节植物体内的氧化还原反应以
及糖的信号转导(Hare等1998)。大量研究表明, 可
溶性总糖、游离脯氨酸、甜菜碱等渗透调节物质
在植物遭遇干旱胁迫时发挥重要作用(Jones等
冯雪等: 高粱SbHKTs基因的克隆及其在拟南芥中的功能验证 1521
1980; Ashraf和Iram 2005)。作为植物体内的渗透
调节物质之一, 游离脯氨酸的含量在正常情况下
很低, 但当受到如干旱、低温等逆境刺激时, 其含
量会显著升高以抵御外界胁迫。因此, 干旱胁迫
下植物体内游离脯氨酸的积累量可以作为植物抗
旱性比较的一个重要衡量指标(Rhodes等1986; De-
launey和Verma 1993)。贾根良等(2008)认为干旱
胁迫显著增加了糜子体内的游离脯氨酸含量, 提
高了其抗逆性。在利用PEG6000模拟干旱的条件
下, 胡桃地上部和地下部的脯氨酸含量均有显著
升高, 相关分析结果表明, 游离脯氨酸含量与胡桃
抗旱性关系密切, 可将其作为筛选抗旱性胡桃的
重要分子标记(Lotfi等2009)。本试验结果表明干
旱处理后供试拟南芥植株的脯氨酸含量显著升高
(较对照), 这与前人的研究结果一致(Ashraf和Iram
2005; 赵春桥等2015)。
可溶性总糖可以在一定范围内维持植物体内
的渗透压。逆境胁迫下, 其含量的高低在一定程
度上也可以反映植物的抗逆能力。Kameli和Losel
(1995)在对小麦的研究中发现, 干旱显著提高了叶
片的可溶性糖含量。有研究表明, 糖信号与ABA
代谢途径的相互作用, 可能是植物受到干旱胁迫
时延缓衰老的重要原因(Paul 2007; Wingler和
Roitsch 2008)。干旱亦可使高粱胚和胚乳中的葡
萄糖和蔗糖浓度提高(Gill等2003)。本试验研究发
现各供试转基因拟南芥植株的可溶性总糖含量在
干旱处理后显著升高, 说明高浓度的可溶性糖有
利于植物应对干旱胁迫, 这与Sanchez等(1998)对
不同品种豌豆抗旱性比较的结果一致。
2.2 干旱胁迫下植物体内活性氧代谢的变化
SOD、GPX、APX与CAT是植物体内重要的
保护性酶。正常情况下, 这些酶类与植物体内产
生的自由基处于平衡状态 ( Z h a n g和K r i k h a m
1994)。但当受到逆境胁迫时, 植物体内会产生大
量的ROS, 原有的平衡被打破, 此时, 这些抗氧化酶
便发挥各自的功能, 清除ROS, 从而确保植物能顺
利度过逆境(Mascher等2002)。
研究者对不同花生品种的抗旱性比较后发现,
SOD和CAT是花生适应干旱环境的主要抗氧化酶
(张智猛等2013)。Ghahfarokhi等(2014)比较了6个
玉米杂交种的抗旱性认为, 干旱胁迫增加了各品
种的CAT活性, 复水后, 相应含量降低。Gao等
(2009)的研究表明, 干旱胁迫后, 二倍体杂种高山
松的SOD、CAT、GPX、APX活性均显著高于两
亲本, 抗旱性强于双亲, 从而证明了杂种优势的存
在。干旱胁迫下, 增加体内的过氧化酶活性以抵
御逆境是植物适应干旱的方式之一(Mascher等
2002)。由此可见, 将各种抗氧化酶活性的高低作
为评价植物抗旱性的方法之一是可行且可信的。
本试验结果表明 , 干旱处理后 , 各供试材料的
SOD、CAT、GPX、APX活性均存在不同程度的
升高, 这与前人的报道一致, 是植物应对干旱胁迫
的一个重要策略(Gao等2009; Mascher等2002)。
2.3 高粱SbHKTs转基因拟南芥植株抗旱性评价
干旱胁迫对植物的影响是多方面的, 因此, 很
难用某个单一指标来评价植物的抗旱性, 本试验
采用模糊数学中的隶属函数值法对同一处理各品
种的抗旱性进行了比较。该法通过计算各指标的
平均隶属值对植株某一特性进行排序, 避免单一
指标评价的片面性, 目前已普遍应用于玉米、花
椒、胡枝子、蓖麻等的抗旱性研究中(席万鹏等
2004; 张卫星等2007; 何雪银等2008; 王昌禄等
2009; 王志泰等2013)。已有报道表明, 运用隶属函
数值法可将21个甘蔗品种依据不同的抗寒性分为
3种类型: 高抗、中抗、低抗(Zhang等2015)。依据
对镉的抵抗性不同, Xie等(2014)通过此法将不同
狗牙根品种分为两类, 即耐镉型及镉敏感型。本
试验根据抗旱性不同将转基因植株进行分类 ,
SbHKT1;5/athkt1-1与SbHKT2;1/athkt1-1为中抗,
SbHKT1;4/athkt1-1为低抗, athkt1-1为不抗, Col
(gl1)为高抗。转基因植株抗旱性强于突变体, 说明
SbHKTs具有提高拟南芥抗旱性的作用。但是由于
植物抗旱是一个数量性状, 其响应逆境胁迫是一
个复杂的过程(Zhu 2002; Davletova等2005; Tran等
2007), 因此, 对于SbHKTs在植物抗旱方面的具体
功能还需要进一步的深入研究。
2.4 结论
以往对于植物体中HKT基因的的研究多集中
在其离子转运方面的作用(Rubio等1995; Pardo和
Quintero 2002; Lunde等2007)。本试验对SbHKTs转
运Na+/K+的特性进行了分析, 同时对其抗旱性也做
了深入研究。结果表明, 在外界高钠条件下, 高粱
HKT基因可选择性的吸收钾离子, 从而维持植株体
内的Na+/K+比值在正常代谢水平, 这种作用机制在
植物生理学报1522
作物耐盐方面意义重大。此外, SbHKTs在一定程
度上还提高了供试转基因拟南芥植株的抗旱性,
其抗旱性由大到小依次为SbHKT2;1/athkt1-1、
SbHKT1;5/athkt1-1、SbHKT1;4/athkt1-1、at-
hkt1-1。转基因植株的抗旱性强于突变体, 说明高
粱HKT基因在植株抗旱方面也发挥着一定的重要
作用。由此可见, 高粱HKT基因不仅在植物耐盐中
发挥作用, 在干旱应答中也行使重要功能。该结
果为后续的作物抗逆育种提供了一个新的思路。
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