全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (6): 805~809　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0111 805
收稿 2014-03-20　　修定 2014-04-22
资助 广东省大学生创新项目(1058012034)和肇庆市科技计划项
目(2013N007)。
* 通讯作者(E-mail: shaoling@zqu.edu.cn; Tel: 0758-
2716359)。
血叶兰的组织培养与快速繁殖
朱桥, 丁俊伟, 杨学文, 梁廉, 邵玲*
肇庆学院生命科学学院, 广东肇庆526061
摘要: 以血叶兰的嫩茎段为外植体, 建立了血叶兰的组培快繁体系。结果表明: 芽诱导最适宜的培养基是MS+6-BA 5.0
mg·L-1; 最适芽增殖培养基为MS+6-BA 5.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+TDZ 0.3 mg·L-1, 芽增殖率达4.92倍; 最佳壮苗培养基为
MS+NAA 0.3 mg·L-1+GA3 1.0 mg·L
-1+15%椰汁, 芽苗高度达到4.33 cm, 芽粗为0.61 cm; 生根最适培养基为1/2MS+IBA 1.0
mg·L-1+15%香蕉+0.5 g·L-1活性炭, 生根率在93.0%以上; 炼苗后, 移栽在泥炭土+珍珠岩+松树皮(3:1:1, V/V/V)混合基质中, 存
活率高于87.0%。
关键词: 血叶兰; 组织培养; 快速繁殖
Tissue Culture and Rapid Propagation of Ludisia discolor
ZHU Qiao, DING Jun-Wei, YANG Xue-Wen, LIANG Lian, SHAO Ling*
College of Life Sciences, Zhaoqing University, Zhaoqing, Guangdong 526061, China
Abstract: This paper deals with tissue culture of Ludisia discolor by tender stem explants. The results showed
the suitable medium of initial was MS medium supplemented with 5.0 mg·L-1 6-BA. The best proliferation oc-
curred on MS medium supplemented with 5.0 mg·L-1 6-BA and 0.5 mg·L-1 NAA and 0.3 mg·L-1 TDZ, the prop-
agation coefficient of adventitious shoots reached 4.92. The best hardening medium was MS medium supple-
mented with 0.3 mg·L-1 NAA and 1.0 mg·L-1 GA3 and 15% coconut milk, with the average plantlet height of
4.33 cm and the average stem diameter of 0.61 cm. The best rooting for plantlets occurred on 1/2MS medium
supplemented with 1.0 mg·L-1 IBA and 15% banana and 0.5 g·L-1 activated carbons, with rooting rate up to
93.0%. The plantlets with acclimatization were transferred to the the mixed matrix [peat soil:vermiculite:pine
bark=3:1:1 (V/V/V)] and the outplanting survival rate was 87.0%.
Key words: Ludisia discolor; tissue culture; rapid propagation
血叶兰(Ludisia discolor)为兰科血叶兰属植
物, 多年生草本, 常匍匐生长于海拔900~1 300 m的
山坡或沟谷常绿阔叶林下的岩石上, 形似莲藕, 故
俗称石上藕、银线莲、美国金线莲等。血叶兰天
然分布在我国广东、香港、海南、福建、广西和
云南南部等地, 越南、泰国、马来西亚与印度尼
西亚等地也有分布(中国科学院中国植物志编辑委
员会1999; 林振兴2012)。血叶兰全草入药, 性味甘
凉, 具有滋阴润肺, 清热凉血, 健脾安神等功效。
同时, 血叶兰外观漂亮, 锦叶玉花, 十分精美, 可小
盆栽植, 或作为园林的点缀陪衬植物(林振兴2012;
何叡颖2009)。血叶兰用途广泛, 但其种子微小, 在
野生状态下难以大量繁殖, 远不能满足市场需要;
加上人为过度采挖, 野生资源濒临灭绝, 被列为国
家二级保护植物 (汪松和解焱2004; 易思荣等
2010)。目前, 国内对血叶兰组培快繁的研究报道
较少(饶秋容等2003; 张菊野等1988), 对其生物学
特征、观赏与药用价值有简单介绍(林振兴2012;
何叡颖2009; 庄西卿和陈璋2010)。本研究对血叶
兰组织培养技术进行系统研究, 建立血叶兰无性
繁殖体系, 可有效保护血叶兰野生种质资源, 同时
为对血叶兰进一步的研究提供理论和技术依据。
材料与方法
1 试验材料
血叶兰[Ludisia discolor (Ker-Gawl.) A. Rish.]
由广州市春回堂贸易有限公司提供, 经肇庆学院
生命科学学院陈雄伟副教授鉴定后, 种植于肇庆
学院生物园温室大棚中。
植物生理学报806
2 试验方法
2.1 外植体的处理
将血叶兰带顶芽的嫩茎段切下, 在流水下冲
洗并剥去外层1~2片叶, 放入低浓度的洗衣粉水中
漂洗3~5 min, 然后流水冲洗干净。在超净工作台
上, 用75%的酒精处理l min, 放入0.1%的HgCl2溶液
中消毒5~7 min, 无菌水冲洗4~5次。将消毒好的茎
段两端各切去0.3~0.5 cm, 切成长1.5~2.0 cm, 带有
1~2个节间的小段。
2.2 培养基与培养条件
芽诱导培养基: MS+6-BA 1.0~6.0 mg·L-1; 增
殖培养基 : MS+6-BA 5.0 mg·L-1+NAA 0~1.5
mg·L-1+TDZ 0~0.5 mg·L-1; 壮苗培养基: MS+NAA
0.2~0.5 mg·L-1+GA3 0~1.5 mg·L
-1; 生根培养基:
1/2MS+IBA 0.5~2.0 mg·L-1+15%香蕉+0.5 g·L-1活
性炭。以上培养基中均加入30.0 g·L-1蔗糖和8.0
g·L-1卡拉胶, pH 5.8。培养温度为(25±2) ℃, 光照
时间12 h·d-1, 光照强度30~40 μmol·m-2·s-1。
2.3 不定芽诱导
将已处理好的外植体接种到不同生长物质浓
度的芽诱导培养基上, 每组60瓶, 每瓶接种1个;
30 d后统计存活率, 存活率=(未被污染外植体数/接
种外植体数)×100%。将未被污染的外植体转接到
相同的培养基上, 每培养30 d统计芽诱导率, 重复3
次, 芽诱导率=培养30 d后总芽数/接种时芽数, 芽
平均诱导率为3次诱导率的均值。
2.4 增殖与壮苗培养
将诱导培养的丛芽, 切取长势基本一致的单
芽, 接种到增殖培养基中, 每一处理接种150个芽,
每瓶接种5个, 增殖培养30 d, 持续观察芽增殖情况,
统计芽增殖率; 30 d后, 切取生长整齐健壮的单芽
转接到壮苗培养基上, 接种后持续观察芽苗生长
情况, 培养30 d后统计芽增殖率、芽高与芽粗等数
据, 芽增殖率=培养30 d后的总芽数/接种时的芽数,
增殖与壮苗培养均重复3次。
2.5 生根培养
选取生长健壮且长势一致、苗高3.0~4.0 cm
的无根芽苗接入生根培养基进行生根诱导。各培
养基均接种90株芽苗, 每瓶接种3株, 重复3次。接
种后观察芽苗的生长与生根状况, 60 d后统计株
高、生根率、生根系数与根长等指标。生根率=
(生根苗数/接种苗数)×100%; 生根系数=生根总数/
接种苗数。
2.6 炼苗与移栽
生根培养60 d后, 将血叶兰组培苗移到与培养
温度相同的温室大棚中, 打开瓶盖, 炼苗1周; 取出
芽苗, 流水洗净根部的培养基, 移栽到已消毒处理
的泥炭土+珍珠岩+松树皮(3:1:1, V/V/V)混合基质
中, 放置在阴凉通风处培养, 30 d统计芽苗的存活
率及生长状况, 重复3次。存活率=(存活苗数/移栽
苗数)×100%。
2.7 数据处理分析
数据使用SPSS 21.0软件分析, 采用邓肯法在
0.01水平进行差异显著性检验。
实验结果
1 无菌繁殖体系的建立
外植体消毒后经过30 d的培养, 各培养基中外
植体的存活率各不相同(表1), 但存活率均在45.0%
以下 , 其中5.0 mg·L-1 6-BA的存活率最高 , 达
43.33%; 2.0和3.0 mg·L-1 6-BA的存活率都在30.0%
以下, 其他浓度6-BA的存活率在30.0%~40.0%之
间。未被污染的外植体, 在培养2~3周可见白色略
带黄绿色的腋芽冒出; 随着培养时间增长, 芽不断
生长, 渐转为黄绿色(图1-A、B)。将未被污染的外
植体及新芽一同转接到相同培养基后, 经过2~3次
继代培养后, 分化出繁殖能力强的丛芽, 新芽数目
不断增加。组培快繁的效率主要受培养条件影响,
其中很大程度上由生长物质种类、水平与配比控
制。6-BA是组织培养时常用的植物生长调节剂,
对促进细胞分裂和诱导芽的分化具有重要作用,
表1 无菌繁殖体系的建立与芽诱导培养
Table 1 The establishment of asepsis reproductive
system and bud induction culture
6-BA浓度/mg·L-1 接种数/个 存活率/% 芽平均诱导率/倍
1.0 60 36.67 1.91D
2.0 60 26.67 2.38C
3.0 60 23.33 2.69C
4.0 60 33.33 3.34B
5.0 60 43.33 4.29A
6.0 60 30.00 3.51B
　　表中同列数据后不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
下表同此。
朱桥等: 血叶兰的组织培养与快速繁殖 807
由表1可见, 不同浓度的6-BA对血叶兰芽诱导有极
显著差异: 在6-BA浓度低于5.0 mg·L-1的情况下, 随
其浓度的升高, 不定芽诱导率明显上升, 6-BA浓度
为5.0 mg·L-1时不定芽平均诱导率最高, 为4.29倍。
当6-BA浓度达到6.0 mg·L-1时, 其诱导率出现下降
趋势, 由此表明血叶兰芽诱导时6-BA添加浓度为
5.0 mg·L-1最合适。
2 不同生长物质浓度配比对血叶兰芽增殖的影响
芽诱导培养后, 需要大量增殖芽数量, 6-BA虽
是芽增殖培养基中的重要添加物质, 但其作用还
受到其他植物生长物质的影响 , 如NAA、TDZ
等。NAA对血叶兰不定芽的诱导与生长均有明显
的促进作用。从表2中可以看出, 芽增殖率随着
NAA浓度的递增呈先上升后下降的趋势。培养基
中添加0.5 mg·L-1 NAA后, 不定芽的增殖与生长比
不添加要好; 但继续增大NAA添加量后, 血叶兰不
定芽的增殖率与生长速率又有所减弱。TDZ具有
很强的细胞分裂素活性, 添加极少量时都对芽增
殖与生长产生重要影响, 由表2可知, TDZ与NAA
组合使用时, NAA与TDZ添加量分别为0.5 mg·L-1
和0.3 mg·L-1最适宜(图1-C), 除1.5 mg·L-1 NAA外,
其他各组合间差异均未达到极显著。
3 不同生长物质浓度配比与添加物对血叶兰壮苗
培养的影响
大量获得不定芽后, 转接到培养基MS+NAA+
GA3进行壮苗培养(表3), 芽苗的生长同样受到不同
生长物质的影响。结合表2结果显示, NAA浓度为
0.5 mg·L-1, 培养基中去掉6-BA后, 芽增殖率明显下
降, 由此可见6-BA对血叶兰不定芽增殖有着很大
影响。但NAA对促进芽苗生长的作用非常明显,
NAA的浓度为0.3 mg·L-1时芽苗生长最为粗壮, 芽
粗达0.54 cm, 但芽高变化并不明显。GA3能诱导植
物茎细胞伸长, 被普遍应用在组织培养中苗高生
图1 血叶兰的组织培养及快速繁殖
Fig.1 Tissue culture and rapid propagation of L. discolor
A、B: 外植体萌芽(5.0 mg·L-1 6-BA); C: 增殖培养(5.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA+0.3 mg·L-1 TDZ); D: 壮苗培养(0.3 mg·L-1 NAA+1.0
mg·L-1 GA3+15%椰汁); E: 生根培养(1.0 mg·L
-1 IBA); F: 生长在泥炭土+珍珠岩+松树皮(3:1:1, V/V/V)混合基质上的组培苗。
表2 不同浓度NAA与TDZ对血叶兰芽增殖培养的影响
Table 2 Effect of different concentrations of NAA and TDZ
on the multiplication culture of L. discolor
生长物质浓度/mg·L-1
芽增殖率/倍 芽生长情况
6-BA NAA TDZ
5.0 0 0 4.22AB 芽嫩绿, 芽较弱
5.0 0.5 0 4.86A 芽嫩绿, 芽粗壮
5.0 1.0 0 4.24AB 芽嫩绿, 芽短小
5.0 1.5 0 3.56B 芽黄绿, 芽短小
5.0 0.5 0.1 4.54A 芽嫩绿, 芽粗壮
5.0 0.5 0.3 4.92A 芽较绿, 芽粗壮
5.0 0.5 0.5 4.62A 芽嫩绿, 芽粗壮
植物生理学报808
长的调控, 从表3可以看出, 血叶兰芽苗高度随着
GA3的浓度增加而增高, 以1.0 mg·L
-1为最好, 芽高
达到3.64 cm; 但当GA3添加到1.5 mg·L
-1, 对血叶兰
芽粗的生长产生抑制作用, 所以在血叶兰芽苗生
长的培养过程中, NAA与GA3组合使用的最佳浓度
配比为0.3 mg·L-1与1.0 mg·L-1, 此时平均芽高、芽
粗分别达到3.64 cm与0.53 cm (图1-D)。
在壮苗培养基MS+NAA 0.3 mg·L-1+GA3 1.0
mg·L-1中添加不同的添加物, 对血叶兰芽苗生长有
不同影响(表4)。活性炭、香蕉(香蕉泥)与椰汁对
促进血叶兰芽苗生长均有利, 芽高与芽粗均高于
对照组, 但添加香蕉培养基中接种嫩芽多数出现
腐烂, 存活芽苗生长情况良好; 活性炭虽对血叶兰
芽苗生长有一定促进作用, 却不及椰汁; 土豆对血
叶兰芽苗生长不利, 芽苗矮小, 叶片较小。所以在
壮苗培养基中可加入15%椰汁。
4 生根培养与移栽
血叶兰为匍匐生长植物, 其底部根较少, 茎节
近地面长出1条根, 无分枝, 其上有细密、乳白色
的根毛(图1-E), 组织培养中难以大量生根, 生根系
数较低, 平均每株根数在3根以下(表5)。不同浓度
表4 不同添加物对血叶兰芽苗生长的影响
Table 4 Effect of different additive on shoot elongation of L. discolor
添加物 成活率/% 芽高/cm 芽粗/cm 芽苗生长情况
活性炭0.3 g·L-1 97.23 3.72B 0.52B 芽绿色加深, 叶片中等, 边缘渐出现紫红色
香蕉15% 67.97 4.27A 0.62A 芽绿色加深, 叶片较大, 边缘渐出现紫红色
椰汁15% 95.21 4.33A 0.61A 芽绿色加深, 叶片较大, 边缘渐出现紫红色
土豆15% 88.33 3.36C 0.47B 芽绿色略深, 叶片较小, 边缘渐出现淡红色
对照 96.43 3.64B 0.49B 芽绿色略深, 叶片较小, 边缘渐出现淡红色
表5 不同浓度IBA对血叶兰生根的影响
Table 5 Effect of different concentrations of IBA
on rooting of L. discolor
IBA/mg·L-1 苗高/cm 生根率/% 生根系数/条·株-1 根长/cm
0.5 4.35 83.33 1.73B 0.67AB
1.0 4.22 93.33 2.63A 0.71A
1.5 4.01 86.67 1.57B 0.38BC
2.0 3.87 76.67 1.27B 0.25C
的 IBA对血叶兰芽苗生根均有一定影响 , 添加
0.5~1.5 mg·L-1 IBA的培养基中, 芽苗培养20 d左右
均有小根出现, 而添加2.0 mg·L-1 IBA的培养基培
养到37 d才出现小根, 且根生长缓慢, 细小。IBA浓
度在1.0 mg·L-1时对生根的促进效果最好, 生根率
为93.33%, 且每株根数均匀, 根生长较快, 培养60 d
后苗高也较高, 仅略低于0.5 mg·L-1的苗高, 综合考
虑, 1.0 mg·L-1可选为生根浓度。
血叶兰组培苗经炼苗后移栽在泥炭土+珍珠
岩+松树皮(3:1:1, V/V/V)混合基质中(图1-F), 置于
温室大棚阴凉通风处, 定期浇水施肥, 培养90 d
后, 统计平均存活率达87.0%以上, 植株生长状况
较好。
讨　　论
血叶兰组织培养过程中外植体的处理与不定
芽诱导是组培繁殖能否成功的两个关键环节。其
外植体的选择较多, 叶片、茎段、新芽均可, 但叶
片与外界接触面积大, 受污染程度高; 新芽一般由
地下部分的茎节发生, 取材相对困难, 同时其在不
定芽诱导培养时由于具有顶端优势, 不定芽诱导
率较低; 所以最好挑选受污染程度较低的嫩茎段
作为外植体, 在用常规方法消毒时可根据血叶兰
肉质茎的特性适当延长消毒时间, 保证较高的消
表3 不同浓度NAA与GA3对血叶兰芽苗生长的影响
Table 3 Effect of different concentrations of NAA and GA3 on
shoot elongation of L. discolor
生长物质浓度/mg·L-1
芽增殖率/倍 芽高/cm 芽粗/cm
NAA GA3
0.2 0 2.66 2.29D 0.39B
0.3 0 2.08 2.47C 0.54A
0.4 0 2.46 2.31D 0.42B
0.5 0 2.14 2.28D 0.43B
0.3 0.5 1.96 3.32B 0.51A
0.3 1.0 1.56 3.64A 0.53A
0.3 1.5 1.84 3.69A 0.38B
朱桥等: 血叶兰的组织培养与快速繁殖 809
毒成功率, 最大程度提供无菌外植体。芽诱导培
养时存活率并不高, 最高仅为43.33% (表1), 主要原
因是外植体受污染所致, 其次培养基中添加物及
其含量对存活率也存在一定影响 , 不同浓度的
6-BA对血叶兰不定芽诱导具有极显著差异, 浓度
为5.0 mg·L-1时最适宜芽诱导培养, 芽平均诱导率
达4.29倍(表1)。在重复试验时, 由于季节变化, 存
活率也有所不同, 春季多雨潮湿, 空气中的微生物
相对较多, 外植体污染率较高, 存活率低; 相反, 秋
冬季节干旱少雨, 存活率较高, 故在材料允许的情
况下, 可选择干燥时节进行芽诱导培养。
组织培养中, 生长物质的种类、水平以及相
互组合配比对组织的产生与分化至关重要; 不同
植物生长物质互作比单一某种生长物质更能促进
丛芽或不定芽的形成与增殖(陈继富2013)。血叶
兰诱导培养基中添加一定量的NAA与TDZ后, 对
不定芽的诱导与增殖均产生促进作用(罗庆国等
2011), 将诱导出新芽移至MS+6-BA 5.0 mg·L-1+
NAA 0.5 mg·L-1+TDZ 0.3 mg·L-1的增殖培养基培
养, 芽增殖率最大, 达4.92倍(表2), 比单一使用
6-BA (5.0 mg·L-1)芽增殖率要高出16.59%, 且连续
培养, 增殖能力恒定。此时芽虽大量增殖, 但生长
速率缓慢, 芽细小嫩绿; 增殖培养后的丛芽转接到
MS+NAA 0.3 mg·L-1+GA3 1.0 mg·L
-1的壮苗培养基
培养, 芽增殖率明显下降, 仅为1.56倍(表3), 但芽苗
生长变化明显, 芽高与芽粗均有所增加, 平均芽
高、平均芽粗分别为3.64 cm与0.53 cm, 芽苗生长
状况良好, 齐整度高; 壮苗培养基中添加15%椰汁,
则培养出的血叶兰植株叶子颜色较深、茎部较粗
壮、长势较好, 添加15%香蕉虽也具有同样效果,
但对嫩芽有一定伤害, 影响存活率, 反而在生根培
养基中添加香蕉后, 血叶兰植株叶片颜色较深、
茎部粗壮、根系长势较好(吴艺东2009)。生根培
养阶段, 生根培养基中适量减少营养成分能有效
促进生根, 故采用1/2MS作为基本培养基(黄以平
2013; 韩晓红等2012), IBA对血叶兰组培苗生根具
有促进作用, 以添加量1.0 mg·L-1效果最好, 生根率
达93%以上(表5)。泥炭土保水保肥效果良好, 珍
珠岩可改善土壤的透气性和含水性, 松树皮既具
有较好的疏水性, 又富含有机质, 血叶兰组培苗移
栽至泥炭土+珍珠岩+松树皮(3:1:1, V/V/V)混合基
质, 存活率达87.0%以上, 长势状况良好。
本研究通过血叶兰组培快繁各个阶段最佳培
养基的筛选, 建立稳定而高效的血叶兰组织培养
与快速繁殖体系, 为血叶兰种苗规模化生产提供
技术支持, 有利于促进血叶兰产业的深度开发。
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