全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (9): 1419~1424　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0231 1419
收稿 2015-05-25　　修定 2015-08-07
* 通讯作者(E-mail: yaoshenghua@shsid.org; Tel: 021-64555419)。
越南‘红心’火龙果黑腐病病原真菌鉴定及环境因素影响分析
姚昇华*, 范诗睿, 邢云莱, 何嘉琳
上海中学国际部, 上海200231
摘要: 应用病原形态学和真菌rDNA-ITS分子标记, 对引起上海市进口越南‘红心’火龙果黑腐病的病害进行了分离与鉴定, 明确
了一种主要的致病菌仙人掌平脐蠕孢(Bipolaris cactivora)。该菌的最适生长温度为30~35 ℃, 在40 ℃时停止生长, 而低温对该
真菌的生长也有明显的抑制效果。菌丝生长的最适pH为9。在不同的光照条件下, 真菌生长的速率没有明显的变化, 但该菌
的色素生成对不同光照条件有明显的响应。对该菌分泌纤维素酶与果胶酶的能力进行鉴定, 发现该菌能够明显产生大量纤维
素酶与果胶酶。将该菌接种到其他常见的果蔬上, 结果显示该菌能够侵染白萝卜、西红柿和梨, 具有一定的广谱寄主性。
关键词: 越南‘红心’火龙果; 黑腐病; 市场病害; 仙人掌平脐蠕孢
Pathogen Identification and Environmental Effects Analysis of Black Rot Dis-
ease of Imported Vietnamese ‘Red’ Pitaya
YAO Sheng-Hua*, FAN Shi-Rui, XING Yun-Lai, HE Jia-Lin
Shanghai High School International Division, Shanghai 200231, China
Abstract: In this study, the major pathogen that caused black rot disease of imported ‘red’ pitaya was studied
morphologically and molecularly. Bipolaris cactivora was the most important pathogen which caused black rot
on imported Vietnamese ‘red’ pitaya. The optimum living temperature for B. cactivora growth was 30–35 ℃.
The mycelium stopped growing at 40 ℃, and low temperature inhibited the growth of mycelium. The optimum
pH for B. cactivora growth was 9. Different light conditions had no significant effect on the growth of mycelium,
but it affected the production of pigments. The abilities to produce excreted cellulase and pectase were also tested
and the results showed B. cactivora can produce these cell wall degrading enzymes. B. cactivora was incubated
onto other fruits and vegetables, and the results showed that it can also infect white radish, tomato and pear.
Key words: Vietnamese ‘red’ pitaya; black rot disease; market disease; Bipolaris cactivora
火龙果(Hylocereus undatus)属仙人掌科量天
尺属植物(Mizrahi等1997; Anderson 2001), 是著名
的热带水果, 原产于西半球赤道附近中美洲热带
雨林区域(Nerd等2002), 后经人工栽培遍及中美
洲、以色列、越南、泰国、美国南部、我国台湾
地区和海南、广东等地(Merten 2003; 郑良永2004;
陈杰等2004)。近年来, 火龙果作为一种营养价值
高且口感好的水果, 受到消费者的广泛青睐, 然而,
国产火龙果数量远远满足不了人们的需求, 需要
大量依赖于进口。仅2010年1~4月, 越南、泰国等
东盟国家通过广西口岸出口到我国的火龙果就达
3.4万吨(章四平2010)。
上海市水果市场销售的火龙果也主要依赖于
从国外进口。我们在对进口火龙果市场病害调查
的过程中发现了黑腐病病害。本研究通过病原形
态学与分子生物学相结合的方法, 对越南‘红心’火
龙果黑腐病害进行分离鉴定, 结果显示仙人掌平
脐蠕孢(Bipolaris cactivora)是引起火龙果黑腐病的
主要病原菌。本研究也检测了该菌的各项生长条
件及对其他果蔬的侵染力和分泌植物细胞壁降解
酶的能力, 为进一步研究其发病机理提供了理论
依据, 也为制定更健康环保的果蔬保鲜措施提供
了新思路。
材料与方法
1 材料
供试越南‘红心’火龙果(Hylocereus undatus
Britt. et Rose)购自上海市徐汇区梅陇路400号水果
批发市场7区-54区周氏水果铺。
植物生理学报1420
2 方法
2.1 病原真菌分离与培养
用解剖刀从病斑边缘, 切取3 mm×4 mm组织
块做以下处理: 70%的酒精浸泡30 s, 无菌水冲洗1
次, 2%次氯酸钠浸泡1 min, 无菌水冲洗3次, 无菌
吸水纸吸干组织表面水分, 将组织块转移至含链
霉素的PDA固体培养基培养, 每皿放置3~4块, 平
板倒置于25 ℃培养2~3 d。待仙人掌平脐蠕孢[Bi-
polaris cactivora (Petrak) Alcorn]菌落直径长至约3
cm时, 用打孔器在菌落边缘取菌落和培养基交界
的菌落, 转入另一PDA培养基培养, 如此重复数次
(>3次), 待菌落形态稳定即得到纯化的菌株。
2.2 病原菌的形态学观察
利用光学显微镜观察菌丝及孢子的形态特征,
并在PDA培养基上观察真菌生长状态, 参考真菌
鉴定资料对致病菌进行形态鉴定。
2.3 病原菌的致病性测定
用70%酒精棉球擦拭健康果实的表面和实验
使用的器皿, 进行表面消毒。用灭菌牙签在果实
表面制造约2 mm的伤口, 将直径为0.6 mm的菌落
接种到伤口上。每个果蔬接种3~5个菌落, 重复接
种3个果实, 进行有伤接种。侵染4 d后拍照记录。
将用保鲜膜封闭的接种器皿放置于25 ℃或室
温下培养。3~5 d后测量病斑直径。
2.4 病原菌在不同温度、pH和光照条件下的培养
将6 mm直径的菌落接种于新鲜的PDA培养基
上, 然后放置于不同温度下培养5 d。实验重复2次,
每次5个平板。
将6 mm直径的菌落接种于不同pH的液体培
养基内, 30 ℃摇床培养5 d。实验重复2次, 每次3个
技术重复。
将6 mm直径的菌落接种于新鲜的PDA培养基
上, 然后放置于不同光照条件下培养5 d。实验重
复3次, 每次5个平板。
2.5 病原真菌的分子生物学鉴定
2.5.1 基因组DNA的提取
称取0.05 g在PDA培养基上生长7 d的待鉴定
病原菌菌丝, 参考刘少华等(2005)的方法提取病原
真菌基因组DNA。
2.5.2 病原真菌rDNA-ITS序列测定
利用通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAA-
CCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGA-
TATGC-3′) (White等1990)扩增病原真菌基因组上
保守的ITS序列, 用以在分子水平上鉴定病原菌。
20 μL PCR扩增体系如下: 10×buffer 2 μL, 10
mmol·L-1 MgCl2 2 μL, 2.5 mmol·L
-1 dNTPs 2 μL, 1
个单位Taq DNA聚合酶(均购于TIANGEN公司), 1
μL DNA模板, 引物浓度均为0.2 μmol·L-1。依照以
下反应程序进行扩增: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 1 min, 55
℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 30个循环; 72 ℃ 20 min。扩
增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测, 之后用胶回
收试剂盒(上海莱枫生物技术有限公司)回收纯化,
−20 ℃保存备用。回收纯化产物委托上海桑尼生
物公司测序, 测序结果在NCBI的数据库中进行比
对, 将病原菌鉴定到种。
2.6 细胞壁降解酶活性测定
果胶酶分泌检测培养基: 0.5%多聚半乳糖醛
酸(PGA); 0.2%蔗糖; 0.2% (NH4)2SO4; 1.5%琼脂。
果胶酶分泌的检测: 将培养时间相同的野生
型和突变体菌株菌落或者孢子接种到相关的培养
基上, 培养2~3 d后, 每皿加入10 mL的4 mol·L-1的
HCl, 静置10 min后, 倒出浓盐酸, 用水冲洗数次, 直
至出现透明环。
纤维素酶分泌检测培养基: 0.4% (NH4)2SO4,
0.01% MgSO4·7H2O, 0.2% K2HPO4, 1%酵母提取物,
0.1%蛋白胨, 0.5%纤维素钠, 2%琼脂。
纤维素酶分泌的检测: 将培养时间相同的野生
型和突变体菌株菌落或者孢子接种到相关的培养
基上, 培养2~3 d后, 用0.1%的刚果红水溶液侵染15
min后, 再用1 mol·L-1 NaCl水溶液脱色, 刚果红可被
未被降解的羧甲基纤维素钠(CMC)染成红色, 而分
泌纤维素酶的菌落周围则会形成透明的水解圈。
实验结果
1 致病菌的分离
从供试的市售感病进口火龙果发病部位共分
离出5株真菌, 将分离得到的病原菌依照柯赫氏法
则重新接种到健康的火龙果上, 结果显示其中的
一株具有致病性, 能够导致越南‘红心’火龙果的黑
腐病斑, 与市售感病火龙果的典型发病症状相符
合(图1-A~F)。由此确定进口火龙果的黑腐病害主
要是由这种病原真菌侵染引起, 编号为BC-1。
姚昇华等: 越南‘红心’火龙果黑腐病病原真菌鉴定及环境因素影响分析 1421
2 病原菌培养性状与形态学特征
在室温条件下, 致病菌BC-1在PDA上的气生
菌丝呈白色, 且能产生深色色素。菌落圆形, 边缘
整齐。分生孢子纺锤形、梭形, 褐色。菌丝有隔
(图1-G~K)。根据以上特征, 初步鉴定为半知菌亚
门丝孢纲丝孢目平脐蠕孢属(Bipolaris sp.)。
3 病原菌rDNA-ITS分子鉴定
采用真菌rDNA-ITS分子标记法将BC-1鉴定
到种。以病原真菌的基因组DNA为模板, 利用通
用引物扩增得到BC-1的rDNA-ITS序列近500 bp。
BLAST比对结果表明, BC-1的rDNA-ITS序列与仙
人掌平脐蠕孢的同源性高达99%, 由此可以确定,
越南‘红心’火龙果上的主要致病真菌就是仙人掌
平脐蠕孢(图2)。实验中所获得的另外4株真菌为
瓜枝孢菌和3株镰刀菌。
4 温度对致病菌生长的影响
将致病菌接种于PDA平板上, 并用不同温度进
行处理。结果显示, 该菌的最适生长温度为30~35
℃。在40 ℃时, 真菌停止生长。在20和25 ℃的低温
状态下, 菌丝的生长受到显著的抑制(图3-A、B)。
5 pH对致病菌生长的影响
将直径6 mm的菌落接种于不同pH值的60 mL
YEPD培养基中, 30 ℃摇床培养5 d。过滤菌丝, 用吸
水纸吸取多余水分并称重。结果显示该菌在pH 9的
培养基中质量最重, 说明其最适生长pH为9, 过酸或
过碱对菌丝的生长都有一定的抑制效果(图3-C)。
6 光照条件对致病菌生长的影响
将直径6 mm的菌落接种于新鲜的PDA平板
上, 分别置于30 ℃下光照、黑暗或者光/暗(各12 h)
交替这3种不同光照环境下。培养6 d后测量菌落
直径并拍照记录。实验结果显示, 3种光照条件对
菌丝生长的影响没有明显的差异(图4-A), 但却对
真菌色素的生成起到了不同的调控效果。在全光
照条件下, 菌落呈现白色, 色素生成受到抑制。在
图2 病原菌rDNA-ITS分子鉴定
Fig.2 rDNA-ITS molecular identification of pathogen
A: PCR扩增得到BC-1的rDNA-ITS序列电泳图。M: Marker; S: 样品。B: BC-1的rDNA-ITS序列的测序结果。
图1 越南‘红心’火龙果黑腐病症状与致病真菌
Fig.1 Symptom of black rot of imported Vietnamese ‘red’ pitaya and pathogen
A: 市售越南‘红心’火龙果感病症状。B~F: 分离所得菌株重新接种健康火龙果后的发病症状。G~K: 致病菌的形态学观察。标尺=50 μm。
植物生理学报1422
全黑暗条件下, 菌落的墨色色素沉积明显, 只边缘
一圈菌丝为白色。在光照与黑暗相交替的过程中,
菌落产生的色素呈深褐色, 且似年轮状, 一圈白色
一圈深褐色交替排布(图4-B), 与光照与黑暗条件
的转换相呼应。说明光照与黑暗这两种不同的条
件能够对该菌的色素生成起到不同的调控作用。
7 致病菌分泌型植物细胞壁降解酶的活性测定
分泌型细胞壁降解酶作为真菌侵染寄主时产
生的典型分泌型蛋白, 一直被认为是侵染过程中
的有力武器。植物细胞壁的主要成分为纤维素、
半纤维素和果胶(Cosgrove 2005)。在本研究中, 我
们亦检测了致病菌产生分泌型纤维素酶与果胶酶
的能力。按照材料与方法部分所示的配方配置培
养基, 将直径6 mm的菌落接种于酶活性测定培养
基, 30 ℃黑暗培养3 d, 最后进行染色脱色。结果显
示, 当纤维素酶测定培养基经过刚果红染色并脱
色后, 菌落边缘出现明显的透明环(图5-A), 说明致
病菌具有很强的分泌纤维素酶的能力。利用盐酸
对果胶酶测定培养基进行脱色, 结果显示菌落周
围出现明显的透明环(图5-B), 说明致病菌具有很
强的分泌果胶酶的能力。
8 致病菌的广谱寄主性检测
为了检测该致病菌是否具有广谱寄主性, 以
便在收获、运输和市场销售的过程中避免交叉感
染。本研究中, 我们将致病菌接种到了不同的常
见果蔬上。接种4 d后结果显示, 该致病菌可以侵
染白萝卜, 形成黑色的病斑。同时也能够侵染西
红柿, 以接种菌落为圆心, 在果实上长出明显的白
图3 温度及pH对致病菌生长的影响
Fig.3 Effects of different temperature and pH on the growth of mycelium
A为致病菌在不同温度下的生长状况。
图4 光照条件对致病菌生长的影响
Fig.4 Effects of different light conditions on the growth of mycelium
姚昇华等: 越南‘红心’火龙果黑腐病病原真菌鉴定及环境因素影响分析 1423
色菌丝。该菌对梨的侵染力较弱, 只在接种菌落
的周围观察到生长的菌丝及深色的病斑。对于其
他的果蔬 , 如苹果、青椒、猕猴桃、土豆、提
子、黄瓜、彩椒、胡萝卜、茭白和芦笋都不具备
侵染力(图6)。
讨　　论
1931年, Petrak从发病仙人掌中分离到一种病
原菌, 并命名为仙人掌长蠕孢(Helminthosporium
cactivorum)。随后在1971年, Ellis将其组合到德氏
图5 纤维素酶(A)与果胶酶(B)活性检测
Fig.5 Tests of cellulase (A) and pectase (B) activities
右图为一个培养基上接种的3个菌落放大, 箭头指向菌落边缘的透明环。
图6 致病菌广谱寄主性检测
Fig.6 Pathogenicity tests on different hosts
A: 白萝卜; B: 西红柿; C: 梨; D: 苹果; E: 青椒; F: 猕猴桃; G: 土豆; H: 提子; I: 黄瓜; J: 彩椒; K: 胡萝卜; L: 茭白; M: 芦笋。
植物生理学报1424
霉属(Drechslera)中。1983年Alcorn根据其分生孢
子的形态将其重新组合为Bipolaris cactivora。Durbin
等(1955)和Nakamura (1970)最早报道该病原菌可以
侵染火龙果, 引起茎腐病。随后也陆续有报道该病
菌能够侵染火龙果果实(Ben-Ze’ev等2011; Taba等
2007; 刘月廉等2011; 李敏等2013)。同时, 南沙检
验检疫局于2014年9月在一批越南进口火龙果中首
次截获仙人掌平脐蠕孢菌(http://www.ns.gdciq.gov.
cn/20_ywxx/2011_ywxx_wzxx/201409/t20140912_
38650.html)。而时隔一年之后, 作者又从上海市的
进口水果批发市场检测到该致病菌, 这就说明加强
对该致病菌的检疫, 建立快速的致病菌鉴定方式,
了解该致病菌各项生长条件刻不容缓。
本研究从发病的越南‘红心’火龙果中分离得
到一株仙人掌平脐蠕孢。随后我们检测了该致病
菌的各项生长条件, 例如温度、pH及光照。结果
显示该菌的最适生长温度为30~35 ℃。在40 ℃时,
真菌停止生长。在低温状态下, 菌丝的生长受到
显著的抑制。这项结果提示我们低温贮藏采后越
南‘红心’火龙果是预防该病害发生的有效措施之
一。随后我们检测了该菌在不同pH的液体培养基
中生长的情况, 结果显示该菌的最适pH为9, 过酸
或过碱对菌丝的生长都有一定的抑制效果。这个
结果可能提示我们在研发新型抗病药物时, 可以
注意到pH的选择, 从而帮助我们更有效地控制病
害的发生。近年来, 越来越多的研究表明黑色素
可以作为真菌的毒力因子, 具有抗氧化、吸收紫
外线、抵抗外界不良环境及宿主免疫等作用(周真
等2011)。在用3种不同光照条件处理之后, 菌丝的
生长没有出现明显的差异, 但色素的产生情况却
明显不同。在全光照条件下, 菌落呈现白色, 色素
生成受到抑制。在全黑暗条件下, 菌落的墨色色
素沉积明显, 只边缘一圈菌丝为白色。在光照与
黑暗相交替的过程中, 菌落产生的色素呈深褐色,
且似年轮状, 一圈白色一圈深褐色交替排布。这
个结果提示我们, 光照条件是调控该菌色素生成
的关键因素, 但色素的产生是否对致病性有所影
响还需要进一步大量的实验来探究。
本研究亦对该菌产生分泌型纤维素酶与果胶
酶的能力进行了检测, 结果显示其具有较强的分
泌这两种酶的能力, 这就预示着该菌可能具有很
强的侵染力, 能够通过瓦解植物细胞壁而进入寄
主体内。在随后的广谱寄主性检测实验中, 该菌
也能够侵染白萝卜与西红柿等果蔬, 体现了一定
的广谱寄主性。以上实验的结果提示我们在收
获、运输及市场销售的过程中, 一定要避免这几
种果蔬间的交叉感染, 以免扩大经济损失。
通过研究仙人掌平脐蠕孢对温度、pH和光照
的反应, 产生分泌型细胞壁降解酶的能力及广谱
寄主性, 充分了解了该病原菌的生物学特点, 对预
防该病的发生具有较好的指导作用。
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