全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (5): 442~448442
收稿 2011-11-29　　修定 2012-03-28
资助 国家自然科学基金(31170273)、山西省国际科技合作计
划(2009081005)、山西省回国留学人员科研资助项目
(201003)、山西省留学人员科技活动项目择优资助和太原
市科技明星专项(11014902)。
* 通讯作者(E-mail: shuqin@sxu.edu.cn; Tel: 0351-7016123)。
拟南芥At5g01510和At5g49820基因人工microRNAs的构建与鉴定
郭凯华, 李文超, 李思敏, 赵淑清*
山西大学生物技术研究所, 化学生物学与分子工程教育部重点实验室, 太原030006
摘要: 以拟南芥内源MIR319a前体为骨架, 构建沉默DUF647家族基因At5t01510和At5g49820表达的人工microRNAs, 研究其
对目的基因表达的抑制效果。利用WMD平台设计分别靶向At5g01510和At5g49820的amiRNAs序列, 通过重叠PCR改造拟
南芥MIR319a骨架序列, 使其包含我们设计的特异amiRNAs序列。构建35S::amiR-At5g0150和35S::amiR-At5g49820融合基
因, 以农杆菌介导的花苞浸染法转化获得转基因拟南芥。RT-PCR分析表明, 人工microRNAs能够显著抑制靶基因的表达,
获得了抑制效果明显的转基因植株。本工作为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。
关键词: 拟南芥; At5g01510; At5g49820; 人工microRNAs; 基因表达
Construction and Identification of Artificial MicroRNAs Targeting Arabidopsis
At5g01510 and At5g49820 Genes
GUO Kai-Hua, LI Wen-Chao, LI Si-Min, ZHAO Shu-Qing*
Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi Uni-
versity, Taiyuan 030006, China
Abstract: Using the endogenous Arabidopsis MIR319a precursor as a backbone, we constructed two artificial
microRNAs (amiRNAs) to knock down the expressions of At5g01510 and At5g49820 genes. By using the
WMD (Web MicroRNA Designer) platform, we designed two amiRNAs targeting the genes At5g01510 and
At5g49820, respectively. Both amiRNAs were engineered into the MIR319a precursor using overlapping PCR
to replace the endogenous miRNA sequences, and the amiRNAs backbones were fused to the constitutive pro-
moter within the binary vector pCHF3. The amiR-At5g01510 and amiR-At5g49820 expression constructs were
introduced into Arabidopsis wild type (Col-0) by Agrobacterium-mediated floral dipping. RT-PCR analysis
showed that the target genes were efficiently knocked down in transgenic lines harboring the overexpression
constructs. This work has laid a foundation for further study of the functions of At5g01510 and At5g49820 genes.
Key words: Arabidopsis thaliana; At5g01510; At5g49820; amiRNAs; gene expression
DUF647 (domain of unknown function 647)蛋
白家族是在真核生物中广泛存在的一个蛋白家
族。在许多植物、动物和一些真菌中都存在
DUF647蛋白。系统发生分析显示, 在真核生物进
化的非常早期就有数个DUF647亚家族的趋异进
化, 但不同的真核生物谱系显示了不同的倾向以
保持不同的DUF647进化枝成员。植物和红藻保
持了DUF647的多个直系, 大多数动物和真菌只有
单个DUF647蛋白, 而酵母和线虫却没有DUF647
蛋白。所以, DUF647蛋白可能参与了大部分真核
生物的进化过程(Leasure等2009; Ge等2010)。在
全基因组序列数据可利用的植物水稻、拟南芥和
苔藓中分别有6个编码DUF647的基因(Goff等2002;
Yu等2002; Swarbreck等2008; Rensing等2008)。
近年来, 对拟南芥DUF647家族中部分成员的
功能已有一些研究。最早通过筛选胚发育缺陷基
因分离了DUF647家族基因At5g49820 (EMB1879)
(www.seedgenes.org; Tzafrir等2003)。最近, 通过
T-DNA插入突变、快中子以及EMS诱变筛选获得
了DUF647家族基因At3g45890 (rus1)和At2g31190
的突变体(rus2/wxr1), 并且对这两个成员的功能进
行比较深入的研究(Tong等2008; Leasure等2009;
研究报告 Original Papers
郭凯华等: 拟南芥At5g01510和At5g49820基因人工microRNAs的构建与鉴定 443
Ge等2010)。研究发现, RUS1与RUS2共同作用于
根UVB感受途径, 参与拟南芥幼苗的早期形态建
成和发育(Tong等2008; Leasure等2009), 而且
RUS2/WXR1对植物生长素的极向运输和保持根中
正常水平的PIN蛋白是必须的(Ge等2010)。此外,
我们通过人工microRNAs技术得到了At1g13770和
At2g23470的基因沉默株系, 初步研究结果显示,
At2g23470基因与拟南芥的育性密切相关。目前关
于DUF647蛋白家族另外两个成员At5g01510和
At5g49820的功能尚未见报道。
基因沉默是研究基因功能的一种有效手段。
在植物系统中, 基因沉默主要由microRNAs (miR-
NAs)和短干扰RNAs (short interfering RNAs, siR-
NAs)分子来执行。miRNAs和siRNAs有很多共同
点。二者都是由长的RNA前体经过Dicer家族RNA
酶加工而来, 都被装载到含有AGO蛋白的RNA诱
导沉默复合体中, 在那里小RNA通过碱基配对抑
制靶基因的表达。miRNAs和siRNAs的主要区别
在于它们的生物合成途径不同。miRNA来自于一
条长的含有不完全配对茎环结构的单链RNA分子,
通过Dicer介导的加工, 导致优先积累其中一条小
RNA, 即miRNA。siRNAs的前体则是产生于完全
配对的双链RNA (dsRNA)分子。切割后的多个
siRNA产物在序列上并不是全都相同的, 而是对应
于前体中两条链的许多部分。对于来自转基因、
转座子和重复序列的siRNA, 其作用靶点恰好是产
生自身的那些序列 , 而miRNA的作用靶点是与
miRNA基因无关的其它mRNAs位点(Bartel 2004;
Ossowski等2008; 毛颖波等2009)。
人工microRNAs (artificial microRNAs, amiR-
NAs)是通过置换内源miRNAs前体的miRNA/miR-
NA*为amiRNA/amiRNA*, 而保留miRNAs骨架中
的碱基配对和错配模式而产生。因此, 基于基因
的功能分析, amiRNAs可靶向任何感兴趣的基因。
近年来, amiRNAs技术在拟南芥、水稻、苔藓和衣
藻等植物中都得到了快速发展(Schwab等2006;
Warthmann等2008; Khraiwesh等2008; Molnar等
2009; Zhao等2009)。amiRNAs能够在组成型、组
织特异型或诱导型启动子的驱动下有效表达
(Schwab等2006)。研究表明, amiRNAs可以像内源
性miRNAs一样特异地抑制靶基因的表达。但与
植物内源miRNAs相比, amiRNAs的作用范围更广,
可以同时沉默多个靶基因(Alvarez等2006; Warth-
mann等2008)。由于具有特异性高、稳定性强和
沉默效应可预见等优点, amiRNAs技术已经成为反
向遗传学研究的有力工具(Ossowski等2008; 叶梅
霞等2010)。
本研究针对拟南芥DUF647家族其余2个基因
At5g01510和At5g49820功能未知的情况, 利用人工
microRNAs技术特异沉默At5g01510和At5g49820
基因。我们选择MIR319a前体分子作为基本骨架,
利用重叠PCR替换miRNA序列为amiRNA序列, 构
建相应植物表达载体分别沉默目标基因At5g01510
和At5g49820, 旨在得到这两个基因沉默的转基因
株系, 以期为At5g01510和At5g49820基因的功能研
究奠定基础。
材料与方法
1 材料
大肠杆菌(Escherichia coli) Top10和根癌农杆
菌(Agrobacterium tumefaciens) AGL1由本校实验室
保存。质粒pRS300和双元载体pCHF3由美国Salk
研究所郑祖宇博士惠赠。
本研究所用拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)品
系均来自Columbia (Col-0)生态型。生长条件: 光周期
16 h (光照)/8 h (黑暗); 光照强度120 μmol·m-2·s-1, 相
对湿度50%~70%, 温度(22±2) ℃。
限制性内切酶BamHI和KpnI、T4 DNA连接
酶以及DNA消化酶RQI购自Promega公司。质粒提
取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自Qiagen公司。
TRIzol试剂、cDNA合成试剂盒(Superscript III 1st
Strand Synthesis System)购自Invitrogen公司。引物
由北京奥科生物技术有限责任公司合成。
2 方法
2.1 人工microRNA的分子设计及其克隆
利用WMD (web microRNA designer, http://
wmd2.weigelworld.org))平台设计靶向基因At5g-
01510和At5g49820的amiRNAs序列, 分别命名为
amiR-At5g01510和 amiR-At5g49820 (表1)。合成
这两个21个核苷酸amiRNAs序列的引物序列见表
2。另外两个通用引物A和B与MIR319a外围的
pRS300质粒配对, 其序列为, A: 5 CTGCAAGGC-
植物生理学报444
GATTAAGTTGGGTAAC 3; B: 5 GCGGATAA-
CAATTTCACACAGGAAACAG 3。根据Schwab
等(2006)和Ossowski等(2008)描述的重叠PCR方法,
置换mi319a骨架中的相应序列。
2.2 植物表达载体pCHF3-amiRNAs的构建
BamH I和Kpn I双酶切经测序确认正确的
amiRNAs前体片段以及pCHF3载体, 回收目的片
段, 用T4 DNA连接酶连接, 转化感受态大肠杆菌
Top10, 挑选阳性克隆, 提取质粒DNA, 酶切鉴定,
将植物表达载体分别命名为pCHF3-amiR-At5-
g 01510和pCHF3-amiR-At5g49820。
2.3 拟南芥转基因植株的获得
采用液氮冻融法(Höfgen和Willmitzer 1988)将
pCHF3-amiR-At5g01510和pCHF3-amiR-At5g49820
质粒分别转入农杆菌AGL1, 在含(50 mg·L-1 Amp和
100 mg·L-1 Spec)抗性的LB固体培养基上筛选阳性
克隆, 并用PCR法鉴定。
采用农杆菌介导的花苞浸染法(Clough和Bent
1998)转化野生型拟南芥。培养携带amiRNAs双元
载体的农杆菌至对数中期, 离心收集农杆菌, 重新
悬浮于5%的蔗糖溶液使OD600=0.8, 加入Silwet
L-77, 至终浓度0.05%。将拟南芥倒置, 使花蕾朝
下并浸入农杆菌溶液中, 保持10~60 s。然后将植
株侧置于铺有湿卫生纸的托盘中, 用塑料盖盖住
托盘以保持湿度, 低光处过夜。第2天取出湿巾纸,
放回培养室内正常条件下培养直到成熟收种。
将转化后收集的拟南芥种子置于1.5 mL离心
管中, 用70%酒精/0.1% Triton X-100消毒15 min, 用
95%酒精冲洗2 min, 然后将种子倒在无菌纸上, 在
超净台内干燥。将种子均匀撒在含有50 mg·L-1的
1∕2MS固体培养基平板上。4 ℃春化2 d后, 移入光
照培养箱。转基因幼苗具有卡那霉素抗性, 在抗
性平板上能够正常生长, 叶片为绿色, 而非转基因
幼苗由于没有卡那霉素抗性发生黄化。待平板上
的绿苗长出4片真叶时, 将其转入混有蛭石的营养
土中, 覆膜保湿1周, 然后去除塑料膜, 继续培养至
成熟, 单株收取种子。
采用CTAB法抽提转基因植株DNA, 根据MI-
R319a前体骨架的序列设计引物, 引物序列为：5′
GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGA 3′和5′
GGATCCCCCCATGGCGATGCCT TAAAT 3′, PCR
鉴定整合有amiRNA表达载体的转基因株系。
PCR反应程序为: 94 ℃预变性3 min; 然后94 ℃变
性30 s, 65 ℃复性30 s, 72 ℃延伸30 s, 35个循环; 最
后72 ℃延伸5 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶
上电泳检测。
2.4 转基因拟南芥植株中目的基因的转录分析
分别取生长3周的野生型拟南芥、amiR-
At5 g01510和amiR-At5g49820构建转基因植株的
叶片, 利用Trizol试剂抽提总RNA。用RQI消化以
去除可能存在的DNA污染。利用Super Script III
cDNA第一链合成系统, 按照反转录试剂盒说明书
进行RT-PCR, 鉴定目的基因At5g01510和At5g -
4 9820的表达情况, 以Tublin作为内参。PCR反应
表1 amiRNA序列及相应的靶基因
Table 1 Predicted amiRNA sequences and target genes
amiRNA名称 预测的成熟amiRNAs序列 靶向基因
amiR-At5g01510 5′ TCAAGTCTAATGCTCGTCGAT 3′ At5g01510
amiR-At5g49820 5′ TTGTATGCAATACTACAGGTC 3′ At5g49820
表2 合成amiRNAs的引物序列
Table 2 Sequences of primers used for amiRNAs construction
引物 amiR-At5g01510 amiR-At5g49820
I 5′ GATCAAGTCTAATGCTCGTCGATTCTCTCTTTTTATTCC 3′ 5′ GATTGTATGCAATACTACAGGTCTCTCTCTTTTGTATTCC 3′
II 5′ GAATCGACGAGCATTAGATTGATCAAAGAGAATCAATGA 3′ 5′ GAGACCTGTAGTATTGCATACAATCAAAGAGAATCAATGA 3′
III 5′ GAACCGACGAGCATAAGACTGATCACAGGTCGTGATATG 3′ 5′ GAGCCCTGTAGTATAGCATACTATCACAGGTCGTGATATG 3′
IV 5′ GATCAAGTCTTATGCTCGTCGGTTCTACATATATATTCCT 3′ 5′ GATAGTATGCTATACTACAGGGCTCTACATATATATTCCT 3′
郭凯华等: 拟南芥At5g01510和At5g49820基因人工microRNAs的构建与鉴定 445
程序为: 94 ℃预变性3 min; 然后94 ℃变性30 s, 57
℃复性30 s, 72 ℃延伸30 s, 30个循环; 最后72 ℃延
伸5 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳检测。
实验结果
1 人工microRNAs的设计及产生
我们利用WMD平台分别设计了靶向基因At5-
g0 1510和At5g49820的长为21 nt的amiRNAs序列。
amiRNA在第1位和第19位与靶基因分别有1个碱
基错配, 其它位置完全配对(图1, 星号所示)。图1黑
框显示了amiRNAs与靶基因翻译区域的结合位点。
以含有拟南芥miR319a前体的质粒pRS300为
模板, 利用amiR-At5g01510和amiR-At5g49820特异
引物分别扩增出amiRNAs前体的5臂(片段a)、中
心环(片段b)和3臂(片段c), 其长度分别为272、171
和298 bp (图2)。以这3个DNA片段的混合物作模
板, 以A和B为引物扩增出amiRNAs的整个前体片
段d, 大小为701 bp , 与预期完全一致(图2)。通过
测序确认产物d中含有目的amiRNAs序列。
2 人工microRNAs表达载体的构建
amiR-At5g01510和amiR-At5g49820表达载体
的构建如图3所示。对表达载体pCHF3-amiRNAs
的酶切鉴定显示有468 bp的amiRNAs前体片段和
10.4 kb的pCHF3片段(图4), 与预期结果完全一致,
表明pCHF3-amiRNAs表达载体构建成功。
3 转基因拟南芥植株的抗性筛选
分别将构建成功的pCHF3-amiR-At5g01510和
pCHF3-amiR-At5g49820重组质粒转化农杆菌
AGL1, 用农杆菌介导的花苞浸染法转化野生型拟
南芥。收获的种子在含有100 mg·L-1卡那霉素的
1∕2MS培养基上进行抗性筛选, 得到了抗性植株(图
表4 RT-PCR引物序列
Table 4 The sequence of RT-PCR primers
目标基因 正向引物(5′-3′) 反向引物(5′-3′)
At5g01510 CTTGGTTTCGGCATTCTGAT TGTTTTCTCGCTTGTTGCAG
At5g49820 TGGGAACTGGGTTTAGCATC TCATCCACCCATGGAAAAGT
Tubulin GAGCCTTACAACGCTACTCTGTCTGTC ACACCAGACATAGTAGCAGAAATC AAG

图3 amiRNAs表达载体构建示意图
Fig.3 Schematic diagram of the PCHF3-amiRNAs
expression vector
图1 人工miRNAs与靶基因的序列比对
Fig.1 Alignment of amiRNAs to target genes
图2 合成amiRNAs前体片段的PCR结果
Fig.2 PCR amplification of fragments of amiR-At5g01510
and amiR-At5g49820 precursors
1: 100 bp DNA Marker; 2~5分别为构建amiR-At5g01510的a、
b、c和d的扩增产物; 6~9分别为构建amiR-At5g49820的a、b、c和
d的扩增产物。
植物生理学报446
5), 抗性植株转土继续培养。
4 转基因拟南芥植株的PCR检测
提取抗性植株的基因组DNA, 用amiRNAs前
体的特异性引物进行PCR扩增, 扩增产物经琼脂糖
凝胶电泳分析, 检测到了476 bp的目标条带(图6),
说明amiRNAs前体已经整合到拟南芥基因组中,
所获得的抗性植株为转化株。
5 RT-PCR检测amiRNAs对目的基因的表达抑制
利用RT-PCR方法检测amiRNAs分子对目的基
因转录水平的影响。结果显示, At5g01510和At5g-
49820基因在转基因植株中的表达水平明显降低,
在个别转基因株系中几乎检测不到靶基因的表达
(图7)。本文筛选到8个At5g01510表达水平下调和
9个At5g49820表达水平下调的转基因株系。这些
图4 拟南芥amiRNAs表达载体的酶切鉴定
Fig.4 Restriction digestion of amiRNA expression
vetor in Arabidopsis
1: 1 kb DNA marker; 2、3: pCHF3-amiR-At5g01510的双酶切
产物; 4: pCHF3的双酶切结果; 5、6: pCHF3-amiR-At5g49820的双
酶切产物。
图5 转基因拟南芥植株抗性平板筛选
Fig.5 Resistance selection of transgenic Arabidopsis plants on plates
A: pCHF3-amiR-At5g01510转基因幼苗筛选; B: pCHF3-amiR-At5g49820转基因幼苗筛选。箭头表示抗性植株。
图6 amiRNAs转基因拟南芥植株的PCR鉴定
Fig.6 PCR identification of transgenic lines harboring the PCHF3-amiRNAs expression constructs
A: 携带amiR-At5g01510表达构建的转基因拟南芥植株; M: 1 kb DNA marker; 1: 野生型Col-0对照; 泳道2~9: amiR-At5g01510转基因株
系。B: 携带amiR-At5g49820表达构建的转基因拟南芥植株; M: 1 kb DNA marker; 1: 野生型Col-0对照; 2~10: amiR-At5g49820转基因株系。
郭凯华等: 拟南芥At5g01510和At5g49820基因人工microRNAs的构建与鉴定 447
对靶基因有明显下调作用的ami-RNAs转基因株系
的获得为进一步研究这些基因的功能奠定了良好
的基础。
讨　　论
基因功能的研究基本上有两条途径, 即正向
遗传学和反向遗传学。正向遗传学遵循从突变体
表型分析到基因功能认识的路线, 它首先关注的
是具有某种缺陷的突变体。突变表型是正向遗传
学研究工作的起点。如果一个基因突变之后没有
显著的表型改变, 那它的突变体也就很难在筛选
过程中被发现。因此, 正向遗传学不适用于研究
这类基因。事实上, 拟南芥中有许多基因都存在
功能上的冗余性, 特别是对于同一基因家族的基
因, 其中一个基因的突变往往不会产生十分明显
的表型变化, 所以这些基因无法通过正向遗传学
来揭示它们的功能, 需要反向遗传学的介入。反
向遗传学遵循的是从序列到功能的研究路线。以
选择一个(或一套)已知基因的序列开始, 通过干扰
这个(些)基因的序列, 进而希望干扰到它(们)的功
能, 从而获悉这个(些)基因的功能(Peters等2003)。
人工miRNAs技术是近年来发展起来的一种高度
特异的新的反向遗传学研究策略。
At5g01510和At5g49820是拟南芥DUF647基因
家族中2个功能完全未知的基因, 它们编码的蛋白
都含有功能未知结构域DUF647, 但二者氨基酸的
相似性只有24.8%, 所以, 即便利用amiRNA技术,
要同时抑制这两个基因也比较困难。因此, 本研
究对这两个基因进行了分别沉默, 得到了单独抑
制At5g01510和At5g49820基因表达的转基因株
系。从表型来看, 这两个基因沉默后的突变体与
野生型并没有明显差异, 其原因可能有二: 一是在
本实验条件下, 沉默靶基因并不能引起可见的表
型变化; 二是我们的靶基因与相近基因存在功能
冗余。我们将通过检查靶基因的时空表达特点来
确定哪个组织、器官或生长条件可能最适合表型
检测。另外, 我们将通过杂交创制双突变体, 观察
其表型变化, 分析这两个基因是否存在功能上的
冗余以及是否存在上下位关系, 以进一步探索这
两个基因的功能。
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图7 amiRNAs转基因植株目的基因的表达
Fig.7 Expression of target gene in amiRNAs transgenic lines
A: At5g01510在野生型和amiR-At5g01510表达构建转基
因拟南芥株系中的表达分析; 1: 野生型Col-0对照; 2~9: amiR-
At5g01510转基因株系。B: At5g49820在野生型和amiR-At5g49820
表达构建转基因拟南芥株系中的表达; 1: 野生型Col-0对照; 2~10:
amiR-At5g49820转基因株系。
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