全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 11 期，2009 年 11 月 1141
收稿 2009-09-02 修定 　2009-11-02
资助 国家自然科学基金(30871389)和辽宁省优秀人才资助项
目(2 00 9 R36 )。
* 通讯作者(E-mail: liqiuli@dl.cn; Tel: 0411-82158681)。
胁迫诱导型启动子在植物抗逆基因工程中的应用
于壮, 朱丽萍, 邹翠霞, 李秋莉 *
辽宁师范大学生命科学学院, 辽宁大连 116029
Application of Stress-Induced Promoter in Plant Genetic Engineering
YU Zhuang, ZHU Li-Ping, ZOU Cui-Xia, LI Qiu-Li*
School of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian, Liaoning 116029, China
提要: 在抗逆基因工程中, 大多采用的是组成型表达启动子, 组成型表达启动子驱动外源抗逆基因表达虽然可以提高转基
因植物的抗逆性, 但会导致转基因植株生长迟缓或不育; 而胁迫诱导型启动子则可提高转基因植物的抗逆性, 不影响其正
常生长发育, 所以, 胁迫诱导型启动子已逐渐用于植物抗逆基因工程。本文介绍不同胁迫诱导型启动子在植物抗逆基因工
程中的应用。
关键词: 胁迫诱导型启动子; 植物抗逆性; 基因工程
非生物胁迫包括干旱、高盐及极端温度(低
温、高温)等环境因子。它们常通过影响植物叶
片气孔开度、细胞壁或细胞膜成分的生理、生化
过程对植物造成伤害, 影响作物的产量和种植区域
(Wang 等 2003)。随着环境的变化, 未来人均的淡
水可用性在逐渐减少, 大约20%的水田受到高盐的
影响(Flowers 和 Yeo 1995)。植物在干旱、高盐
及极端温度逆境条件下发生一系列生理生化及发育
方面的应答反应来减少逆境对其细胞的损伤, 并且
某些基因表达也产生相应的变化, 激活一系列逆境
应答基因的表达, 从而提高植物多方面的抗逆性, 例
如增加胁迫蛋白的产量、提高抗氧化剂基因的表
达水平、增加可溶性物质的积累等( 杨献光等
2006)。
一般来说, 大部分作物对逆境都非常敏感, 即
抗逆性较差。采用植物基因工程技术培育抗逆作
物新品种一直是这一领域研究中的热点之一。人
们已经用基因表达谱分析、比较基因组学分析和
同源克隆等方法发现了一些抗逆基因及其等位基
因, 而且通过转基因方法有效地提高了作物的抗逆
性(Bressan 等 2009)。Wang 等(2007)报道, CaMV
35S启动子驱动玉米(Zea mays)钙调磷酸酶B类蛋
白 CBLs (calcineurin B-like proteins)在拟南芥
(Arabidopsis thaliana)中表达, 在 100~175 mmol·L-1
NaCl处理后, 与非转基因植株相比, 转基因植株种
子萌发和生根状态更好, 说明转基因植株能更好地
适应高盐逆境。Zhang等(2008)用 CaMV 35S 启动
子驱动拟南芥AtCYSa (Cystatins)和AtCYSb的表达,
转基因拟南芥经过 200 mmol·L-1 甘露醇处理后, 生
根明显好于非转基因植株, 说明 AtCYSa 和 AtCYSb
在转基因植株中的过量表达可提高拟南芥的抗旱
性。Wang 等(2008)分析 CaMV 35S 启动子驱动水
稻(Oryza sativa)脱水响应元件结合蛋白转录因子
OsDREB1F (dehydration-responsive element-binding
protein transcription factor)在拟南芥中表达结果显
示, 4 ℃下 2 d 后, 转基因拟南芥生长良好, 非转基
因植株则萎蔫死亡, 说明转基因拟南芥中OsDREB1F
的过量表达可提高拟南芥的抗寒性。
以上的转基因植物大部分采用的是组成型表达
启动子(constructive promoter), 而此种启动子虽然
可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力, 但是有研
究显示, 正常条件下, 烟草和马铃薯中组成型表达
海藻糖 -6- 磷酸合酶(trehalose-6-phosphate synthase,
TPS)基因或海藻糖-6-磷酸磷脂酶 (trehalose-6-phos-
phate phosphatase, TPP)基因对植物有负作用, 如影
响植株生长和生根等(Goddijn和Vam1999; Romero
等 1997; Pilon-Smits 等 1998)。CaMV 35S 驱动拟
南芥转录因子AtWRKY18在转基因拟南芥中的高表
达是阻碍生长的, 而且有些呈畸形发育(Chen 和
chen 2002)。正常环境下, 细胞内组成型表达抗逆
蛋白是一种能量浪费, 而且还可能导致植物的正常
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代谢受阻, 以致转基因植物的发育异常(Kasuga 等
1999)。解决此问题的方法一般采用逆境胁迫诱导
型启动子(stress-inducible promoter), 用环境胁迫诱
导型启动子与抗逆基因融合, 促使植物在逆境胁迫
下表达相应的蛋白, 于是转基因植物即可更好地适
应逆境胁迫(Kasuga 等 1999)。以下介绍胁迫诱导
型启动子及其在植物抗逆基因工程中的应用。
1 rd29A启动子
rd29A 启动子是一种干旱、盐碱、低温诱导
表达的启动子, 其序列中含有2个与逆境胁迫应答
有关的顺式作用元件 DRE (dehydration-responsive
element), 是植物抗逆基因工程中理想的逆境诱导型
启动子(Narusaka 等 2003)。Zhao 等(2007)报道,
rd29A驱动拟南芥DREB1A/CBF3 (C-repeat-binding
factor)在高羊茅(Festuca arundinacea)中表达, 干旱
下 30 d 后, 非转基因植株全部萎蔫, 而转基因植株
只有少部分萎蔫。重新补充水分后, 转基因植株可
恢复正常生长, 而非转基因植株则不能恢复。这表
明, 胁迫诱导型启动子rd29A可有效驱动DREB1A/
CBF3 的表达, 从而提高转基因植株的抗旱性。
赵恢武等(2000)研究 rd29A 驱动酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae) TPS在烟草中表达的结
果表明, 植株生长到 4 个月左右后, 于干旱下处理
10 d, 非转基因植株明显萎蔫, 许多叶子枯黄, 而转
基因植株受到的影响明显轻一些。这显示, 转基因
烟草的耐旱性有所增强。
Roy 等(2008)用 rd29A 驱动芥菜(Brassica
juncea)的 gly I (Glyoxalase I)表达后, 在 150 mmol·L-1
NaCl 条件下, 转基因拟南芥的种子萌发率达到
75%, 而非转基因拟南芥的种子萌发率只有 15%。
这表明, 转基因植株耐盐性有提高。
Zhuo 等(2007)研究拟南芥 rd29A 启动子驱动
外源甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,
BADH)基因在枫香(Liquidambar formosana)中的表
达结果表明, 在 200 mmol·L-1 NaCl 胁迫条件下, 转
基因植株与非转基因植株相比, BADH表达明显上
调。这显示, rd29A启动子可驱动外源 BADH在枫
香中表达, 因而其抗盐能力增强。
Behnam等(2007)报道, rd29A启动子驱动拟南
芥DREB1在马铃薯(Solanum tuberosum)中表达后,
其抗寒性提高。Northern 杂交分析表明, 4 ℃条件
下, 前 30 min 转基因马铃薯与非转基因马铃薯
DREB1均没有表达, 30 min后转基因马铃薯DREB1
表达, 而非转基因马铃薯则没有表达。-20 ℃条
件下, 1 min 内转基因马铃薯的 DREB1 表达, 而非
转基因马铃薯没有表达。这表明, rd29A 启动子驱
动 DREB1 在植物中的表达受低温诱导。
Gao等(2005)分析拟南芥rd29A启动子与玉米
Ubi启动子驱动大豆(Glycine max)脱水响应元件结
合蛋白 GmDREB 在小麦中表达的结果表明, 10%
聚乙二醇处理 2个星期后, 94%的非转基因植株的
叶子开始卷曲, 根系不发达, 而转基因植株则很少
有此现象; 以 0.6% NaCl 处理后, 非转基因植株萎
蔫, 而转基因植株则能存活。这说明 rd29A启动子
和Ubi启动子都能有效驱动GmDREB的表达, 从而
提高转基因植株的抗盐与抗旱能力。
Kasuga等(1999)将rd29A与CaMV 35S启动子
驱动 DREB1A 在拟南芥中的表达进行对比的结果
表明, 正常生长条件下, 转基因植株的抗逆性都提
高, 但CaMV 35S启动子驱动的转基因拟南芥表现
为生长延迟; 在胁迫条件下, 转 rd29A 启动子的拟
南芥的生长受到的影响很小, 而且抗逆性更强于
CaMV 35S启动子。Kasuga 等(2004)研究 rd29A驱
动 DREB1A/CBF3 在烟草中的表达显示, 正常条件
下, rd29A转基因烟草生长发育受到的影响极微, 而
非转基因烟草则生长延迟。这些表明, 诱导型启动
子驱动抗逆基因较小影响转基因植株的生长, 且能
提高转基因植株的抗逆性。
Bhatnagar-Mathur等(2007)报道, rd29A驱动拟
南芥转录因子 DREB1A 在花生(Arachis hypogaea)
中的表达。rd29A驱动的转基因植株与CaMV 35S
驱动的转基因植株相比, 其长势良好(图1), 致死率
低。rd29A 驱动的转基因植株比非转基因植株的
蒸腾效率高, 蒸腾作用弱。这表明, 诱导型启动子
可驱动DREB1A在转基因植株中适时表达, 不影响
其生长, 且可提高其抗旱性。
2 SWPA2启动子
SWPA2 (sweetpotato peroxidase)启动子是具有
氧化特性的干旱胁迫启动子。在多种胁迫条件下,
SWPA2启动子驱动的外源基因表达比CaMV 35S启
动子更明显(Kim等2003)。Ahmad等(2008)用SWPA2
启动子驱动细菌中的胆碱氧化酶A (cholineoxidase A,
codA)基因转化马铃薯的结果表明, 干旱处理后, 转
基因马铃薯的水含量与干重比非转基因马铃薯高,
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恢复浇水 7 d 后, 转基因植株可恢复生长, 而非转
基因植株则不能恢复。Tang 等(2006)研究 SWPA2
启动子驱动 Cu/Zn 超氧化物歧化酶(superoxide
dismuta se , SOD)基因和抗坏血酸过氧化物酶
(ascorbate peroxidase, APX)基因在马铃薯中表达的
结果显示, 42 ℃处理 10 h后, 非转基因马铃薯已经
萎蔫, 而转基因马铃薯植株仍然正常生长; 20 h后,
转基因马铃薯的光合作用活性只下降了 6%, 而非
转基因植株则下降了 29%。这些表明, SWPA2 可
驱动外源基因在转基因植株中的表达, 提高转基因
植株的抗寒性。
3 诱导型启动子IND (6xABRE+2mini CaMV 35S)
和Pabp9
陈铮等(2008)研究IND (6xABRE+2mini CaMV
35S)和Pabp9启动子分别驱动ABP9在拟南芥中表
达的结果显示, 正常生长条件下, 两种诱导型启动
子驱动ABP9表达的转基因拟南芥比组成型启动子
驱动 ABP9 表达的转基因拟南芥根系生长良好(图
2), 这表明诱导表达可在一定程度上解除组成型表
达所导致的生长延迟。
4 ABA诱导启动子
AB A 诱导启动子来源于 ABA 响应复合物
(ABA-response complex, ABRC3)。Fu 等(2007)报
道, 玉米Ubi-1启动子和ABA诱导启动子驱动大麦
(Hordeum vulgare)抗旱基因HVA1在匍匐型剪股颖
(Agrostis stolonifera var. palustris)中表达, 在干旱条
件下, ABA诱导启动子和Ubi-1启动子驱动HVA1的
转基因植株的相对含水量均高于非转基因植株, 转
图 1 试管培养和温室培养条件下的转 CaMV 35S:DREB1A 和 rd29A:DREB1A 基因植株的表型(Bhatnagar-Mathur 等 2007)。
a: 试管培养条件下转 rd29A:DREB1A 植株开始生根; b: 试管培养条件下转 CaMV 35S:DREB1A 植株不能生根, 株型矮小; c: 温室
培养条件下含有 CaMV 35S:DREB1A 的转基因植株表现株型矮小; d: 温室培养条件下含有 rd29A:DREB1A 的转基因植株生长正常。
图 2 正常条件下各转基因拟南芥株系的根系
生长比较(陈铮等 2008)
pCHF3: 转空载体植株; Pabp- ABP9: 含 ABP9 启动子植株;
IND-ABP9: 含 IND 启动子植株; 35S-ABP9: 含 CaMV35S 启动子
植 株 。
基因植株均受到较小程度的损害, 转ABA诱导启动
子植株受到的损害最小。这显示, ABA 诱导启动
子能更有效地驱动HVA1在干旱条件下表达, 从而
提高转基因植株的抗旱性。
Hsieh等(2002a, b)分析CaMV 35S启动子驱动
拟南芥CBF1在番茄(Lycopersicon esculentum)中表
达的结果表明, 组成型过量表达 CBF1 虽然可提高
番茄的抗逆性, 但却出现转基因番茄株型矮小、果
实与种子数量减少的现象。为了让转基因番茄更
优化, 其株型和产量受到的影响小, Lee等(2003)研
究大麦HAV22的ABA-响应复合物(ABRC1)启动子
驱动拟南芥 CBF1 在番茄中的表达, 结果显示, 缺
水处理4个星期后, 非转基因植株的成活率为零, 而
转基因植株的成活率为 83.3%~96.7%; 另外, 200
mmol·L-1 NaCl处理4个星期后, 非转基因植株的成
活率为零, 而转基因植株的成活率为83.3%~96.7%。
正常条件下, 转基因植株的果实和种子的数量以及
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植株鲜重均与非转基因植株基本相同; 而在冷、缺
水和盐胁迫条件下, 转基因植株果实和种子的数量
以及植株鲜重均明显高于非转基因植株。这些表
明, 胁迫诱导启动子驱动胁迫应答基因的表达可提
高转基因植株的抗逆性, 且不影响植株生长和产
量。
5 干旱诱导启动子OsLEA3-1
LEA是干旱和盐胁迫响应基因, 其全长cDNA
定义为OsLEA3-1, OsLEA3-1启动子是从旱稻(Oryza
sativa) IRAT109 中分离出来的。Xiao 等(2007)用
旱稻干旱诱导 OsLEA3-1 启动子、CaMV 35S 启动
子和水稻Actin1启动子分别驱动OsLEA3-1在水稻
中表达的结果显示, 3 种启动子驱动的转基因植株
抗旱性均强于非转基因植株, 其中 OsLEA3-1 启动
子驱动的转基因植株抗旱性稍强于CaMV35S启动
子。这表明, 采用诱导型启动子驱动干旱响应基因
表达更有利于提高转基因植株的抗旱性。
6 结语
干旱、高盐及极端温度导致全球农作物产量
的损失巨大, 采用基因工程技术改良作物的抗逆性
是最为经济, 也是最有前景的有效方法。近年来,
胁迫诱导启动子的研究日益增多, 胁迫诱导启动子
可以驱动外源抗逆基因在转基因植物中的表达, 并
且能提高转基因植物的抗逆性, 这与CaMV 35S启
动子的功能相同。胁迫诱导启动子有一个优点, 这
就是它能调节基因表达的时空性, 促使外源基因在
逆境胁迫条件下表达相应的蛋白, 既节约能量, 也
不影响植物的正常生长发育, 最终可以避免外源基
因对植物的不良效应(如转基因植株的生长延迟和
畸形发育), 于是转基因植物抵抗逆境的能力提高。
所以, 胁迫诱导启动子驱动外源基因表达可能是未
来这一领域研究的一种趋势和热点。总之, 随着更
多胁迫诱导启动子的发现, 胁迫诱导启动子将会更
广泛的用于植物抗逆基因工程的研究, 进而应用于
生产实践。
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