全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 6 期，2009 年 6 月598
收稿 2009-03-10 修定 　2009-05-05
资助 国家自然科学基金重点项目(3 07 30 07 8)。
* 通讯作者(E-ma i l : lyhsh en@1 2 6 .c om; T el : 0 4 5 1 -
8 2 1 9 1 7 8 3 )。
富含多糖的芜菁根皮中磷酸化蛋白的Pro-Q Diamond/SYPRO荧光染料分
析技术和质谱鉴定方法
闫海芳 1, 安春鹏 1, 河鳍实之 2, 李玉花 1,*
1 东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 150040; 2 东京大学大学院农学生命研究科, 日本东京 113-8650
Analysis Technique and Mass Spectrometry Method of Phosphoproteome in
Swollen Hypocotyls of Turnip (Brassica rapa L. subsp. rapa ‘Tsuda’) Rich in
Polysaccharides by Pro-Q Diamond/SYPRO Fluorescence Stain
YAN Hai-Fang1, AN Chun-Peng1, KAWABATA Saneyuki2, LI Yu-Hua1,*
1College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2Graduate School of Agricultural and Life
Sciences, University of Tokyo, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo, 113-8657, Japan
提要: 介绍了利用Pro-Q Diamond/SYPRO荧光染料分析磷酸化蛋白在芜菁根皮中的表达。比较了酚法、SDS法、Tris-HCl
法、TCA-丙酮法、裂解液直接裂解法和改良的酚2 h沉淀法所提取芜菁根皮中总蛋白的浓度和纯度。最后用改良酚法提
取了芜菁的总蛋白, 双相电泳分离后, 用Pro-Q Diamond/SYPRO荧光染料染色对磷酸化蛋白进行染色分析, 并对磷酸化蛋
白点做了质谱鉴定。
关键词: Pro-Q Diamond/SYPRO; 芜菁; 磷酸化蛋白; 质谱鉴定
蛋白质磷酸化(protein phosphorylation)修饰是
常见的一种蛋白翻译后修饰(post- transla tional
modifications, PTMs)方式。随着蛋白质组学技术
的不断发展, 磷酸化蛋白质组学已成为蛋白质组学
研究的一个重要课题。分离高质量的磷酸化蛋白
对这些研究是非常重要的。许多植物, 例如芜菁的
根皮中, 含有大量的多糖和次级产物, 蛋白质提取
的难度远远高于其他组织(闫海芳 2003)。而且磷
酸化蛋白质在细胞内丰度低、磷酸基团很容易在
分离过程中丢失, 对分离方法要求高。为此, 本文
以富含多糖和次生代谢产物的芜菁根皮为材料, 针
对目前常用的蛋白提取方法——酚法、SDS 法、
Tris-HCl 法、三氯乙酸(TCA)- 丙酮法和裂解液直
接裂解法(Chitted和 Peng 2007; Sheoran等 2009)进
行了比较, 并对酚法做了改进和优化。同时采用磷
酸化蛋白特异染料 Pro-Q Diamond 和总蛋白染料
SYPRO两种荧光染料染色, 分析磷酸化蛋白和总蛋
白的表达情况, 同时对磷酸化蛋白作了随机质谱鉴
定。本文从蛋白提取方法的优化到磷酸化蛋白的
分析鉴定, 建立了一套较为有效的分析富含多糖的
芜菁根皮中磷酸化蛋白的分析方法。
材料与方法
1 材料
以温室中生长至2个月的‘津田’芜菁(Brassica
rapa L. subsp. rapa ‘Tsuda’)膨大根的根皮为试验
材料, 放在液氮中速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中
贮存待用。
2 方法
2.1 总蛋白的提取
2.1.1 提取液 文中采用的酚法、SDS 法、Tris-
HCl 法、TCA- 丙酮法、裂解液直接裂解法和改良
的酚 2 h 沉淀法(Chitted 和 Peng 2007; Sheoran 等
2009)均按照参考文献进行的。(1)酚法提取液为
0.9 mol·L-1 蔗糖、0.5 mol·L-1 Tris-HCl、0.05 mol·L-1
EDTA、0.1 mol·L-1 KCl, 2% β- 巯基乙醇现用现
加; (2) SDS 法提取液为 1.175 mol·L-1 Tris-HCl (pH
8.8)、5% SDS、15% 甘油、0.03 mol·L-1 DTT;
(3) Tris-HCl法的提取液为50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH
8.8)、5 mmol·L-1 EDTA、20 mmol·L-1 DTT、100
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mmol·L-1 KCl、2 mmol·L-1 苯甲基磺酰氟(PMSF);
(4) TCA- 丙酮法的提取液为 10% TCA和 1% DTT
的丙酮(使用前-20 ℃预冷); (5)裂解液直接裂解法
的裂解液为含有 7 mol·L-1 尿素、2 mol·L-1 硫脲、
4% 3-[(3- 胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1- 丙磺酸
(CHAPS)、1% DTT、2% 两性电解质(ampholyte,
pH 3~8)。
2.1.2 提取方法 从低温冰箱中取出芜菁根皮, 加入
液氮后研磨成粉, 取 0.15 g粉末分别加入到提取液
中。酚法的操作过程如下: 0.15 g 粉末加入到 700
μL 提取液中, 迅速混匀, 加入等体积的饱和酚, 温
和混匀 10 min; 4 ℃下以 2 500×g离心 10 min, 吸取
上层酚相; 剩余液体重新用 700 μL饱和酚抽提, 再
吸取酚相, 合并两次提取的酚相于 10 mL 管中, 加
入5倍体积的沉淀液(含0.1 mol·L-1醋酸铵和2% β-
巯基乙醇的甲醇溶液), -70 ℃过夜沉淀或者沉淀 2
h (改良酚法); 10 000×g离心30 min, 沉淀分别用预
冷的沉淀液和70%乙醇洗3次, 洗沉淀时要充分悬
浮沉淀; 所得沉淀在冷冻真空干燥仪中干燥成粉末
备用。SDS 法: 0.15 g 粉末加入到 700 μL 提取液
中, 温和混匀 20 min, 转入 10 mL管中, 加入 4倍体
积的-20 ℃预冷过的丙酮, 混匀, 于-20 ℃下沉淀2
h; 4 ℃下以 15 000×g 离心 20 min 后, 弃去上清液;
以于-20 ℃预冷 80% 丙酮洗沉淀至无色; 离心后
弃去上清液, 沉淀在冷冻真空干燥仪中干燥成粉末
备用。Tris-HCl 法: 0.15 g 粉末加入到 700 μL 提
取液中, 温和混匀 20 min, 4 ℃下放置 30 min,
15 000×g 离心 20 min, 吸取上清液于 10 mL 管中;
沉淀重新抽提 1 次, 合并 2 次上清液; 加入 5 倍体
积-20 ℃下预冷过的丙酮, 混匀, -20 ℃下沉淀2 h;
4 ℃下以15 000×g离心20 min, 弃去上清液; 以-20 ℃
下预冷过的80%丙酮洗沉淀3次, 沉淀在冷冻干燥
仪中干燥至粉末备用。TCA- 丙酮法: 0.15 g 粉末
加入700 μL提取液, 混匀, -20 ℃下放置2 h; 4 ℃下
以 15 000×g离心 20 min, 沉淀用含 1% DTT、-20 ℃
下预冷过的 80% 丙酮洗至无色; 冷冻真空干燥仪
中冷冻干燥沉淀至粉末备用。裂解液直接裂解法:
0.15 g 粉末加入 500 μL裂解液, 温和混匀, 室温溶
解 2 h; 4 ℃下以 15 000×g 离心 20 min, 取上清于新
管中备用。
2.1.3 蛋白裂解方法 以上各法提取的蛋白, 用 100
μL 裂解液(同直接裂解法)室温溶解沉淀, 15 ℃下
以 15 000×g 离心 20 min, 去除未溶解部分, -40 ℃
下保存备用。以Bradford法(汪家政和范明 2000)测
定蛋白浓度, 试剂盒购自碧云天生物技术研究所。
2.2 双相电泳 双相电泳的第一向等电聚焦电泳采
用Amersham Biosciences生产的24 cm胶条, pH 3~11,
上样量为600 μg, 上样体积为450 μL。用Amersham
Biosciences 生产的 Ettan IPGphor 进行第一向的等
点聚焦。30 V溶胀 12 h, 然后分别调节电压为 200
V 1 h, 500 V 1 h, 1 000 V 1 h, 8 000 V 梯度上升 30
min, 8 000 V 4 h。聚焦结束后用 12.0% 的 SDS- 聚
丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行第二向分离, 于
240 V 电泳 5~7 h。电泳参数参考 Amersham Bio-
sciences 提供的双向电泳参数。电源用 Electro-
phoresis Power Supply EPS601。
2.3 Pro-Q Diamond和 SYPRO荧光染色 Pro-Q
Diamond染色(Steinberg等 2003; Bio-Rad公司提供
的手册): 电泳结束后, 凝胶置于聚丙烯塑料盒中, 固
定液(40% 甲醇和 10% 冰乙酸)固定 3 h, 1 h后更换
新的固定液, 这样固定效果会更好。凝胶用 Milli-
Q 去离子水洗 3 次, 每次 20 min, 水洗后加入 500
mL Pro-Q Diamond, 摇床上震荡, 染色 1 h, 回收染
色液, 以脱色液(25%乙腈和50 mmol·L-1乙酸钠, pH
4.0)洗 3 次, 每次 30 min, 后用 Milli-Q 去离子水洗
3 次, 每次 10 min, 之后即可用 Typhoon 9400 荧光
扫描仪采集图像。
SYPRO 荧光染色(Steinberg 等 2003; Bio-Rad
公司提供的手册): Pro-Q Diamond 染色后的凝胶,
扫描后用 Milli-Q 去离子水洗 1 次后, 加入 500 mL
SYPRO荧光染色液, 染色 3 h, 回收染色液, 凝胶用
10% 甲醇和 7% 冰乙酸洗 1 h, 有助于去除非特异
的点, Milli-Q 去离子水洗后即可用于采集图象。
2.4 质谱鉴定 采用 GE 公司的 Spot Picker 工作站
自动随机挖取 3 个 Pro-Q Diamond 染色后的磷酸
化蛋白质点, 将挖取的蛋白点置于 0.5 mL 的离心
管中, 编号。质谱样品处理参照 AB 公司提供的
手册。
实验结果
1 总蛋白检测
用6种方法提取的总蛋白质, 进行SDS-PAGE
电泳检测和浓度测定的结果(图 1、表 1)。采用
SYPRO荧光染料进行染色, 结果表明, 等量的材料
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和提取液, 酚法得率最高, SDS 法和 Tris-HCl 法次
之, TCA- 丙酮法和裂解液直接裂解法最差。将相
同体积蛋白溶解液(10 μL)进行 SDS-PAGE 电泳的
结果(图 1)显示, 酚法样品的条带较 SDS 法和 Tris-
HCl法多, 而TCA-丙酮法和裂解液直接裂解法的样
品则无条带。酚法样品的条带虽然多, 但是很多条
带不清晰, 而在改进的酚法样品中条带很清晰, 得
率未受到明显影响。
图 1 6 种不同提取方法所得芜菁根皮总蛋白的
SDS-PAGE 图谱比较
上样量为 10 μL。1: 酚法; 2: SDS 法; 3: Tris-HCl 法; 4 :
TCA- 丙酮法; 5 : 裂解液直接裂解法; 6 : 改良的酚法。
表 1 6 种不同提取方法所得芜菁根皮总蛋白的浓度和得率
提取方法 浓度 /μg·μL-1 蛋白得率 /μg·g-1
酚法 1.62 1 080
SDS法 1.16 773
Tris-HCl 法 1.08 720
TCA- 丙酮法 0.26 173
直接裂解法 0.24 160
改良的酚法 1.59 1 060
　　直接裂解法显示浓度为测定浓度 × 5。
2 Pro-Q Diamond染色和 SYPRO荧光染色双向
电泳结果
采用改良的酚法提取芜菁根皮的总蛋白质, 并
进行双向电泳, 用Molecular Probe公司生产的专门
用于磷酸化蛋白染色的荧光染料Pro-Q Diamond染
色的结果见图 2-a。染色结果用 Amersham Bio-
sciences 公司的 Image-master 软件分析, 在参数设
定为 Smooth=3、Mini area=17、Saliency=200 条
件下, 经软件自动检测蛋白点后, 人工去除错误的
蛋白点, 并增加未被检测的点后, 出现了 181 个磷
酸化蛋白点, 这些点集中分布在酸性端, 而且分子
量也比较集中。凝胶用 Pro-Q Diamond染色后, 再
用 SYPRO 对总蛋白进行染色分析的结果见图 2-
b。染色结果的分析软件和条件与 Pro-Q Diamond
图 2 芜菁根皮总蛋白 SDS-PAGE 图谱
以 IPG (pH 3~11) 24 cm 的胶条为第一向和 12.0% SDS-PAGE 为第二向分离总蛋白。a 为 Pro-Q Diamond 染色的总磷酸化蛋白
结果。至少检测到 1 81 个蛋白点, 1、2、3 分别为随机抽取 3 个点进行质谱分析磷酸化蛋白。b 为继 Pro-Q Diamond 染色后, 用
SYPRO 进行 2 次染色的结果, 至少检测到 642 个点。利用 Amersham Biosciences 公司的 Image-master 软件, 分析条件为 Smooth=3,
Mini area=17, Saliency=200。
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染色的相同。在此条件下, 检测到 642 个蛋白点。
这些点分布于整个胶上, 无论是高 pH 还是较低的
分子量都检测到蛋白点。这一结果表明用改良后
的酚法提取的蛋白完全可以满足分析磷酸化和总蛋
白的需要。
3 质谱鉴定
从Pro-Q Diamond染色的磷酸化蛋白中, 随机
挖取 3 个点, 质谱进一步分析的结果表明, 这 3 个
表 2 磷酸化蛋白质的谱分
磷酸化蛋白名称 分子量 /kDa 等电点 肽段数量 可信度得分
热激蛋白 81-3 (heat shock protein 81-3) 80.2869 4.95 8 100
液泡 ATP 酶亚基 B (vacuolar ATP synthase subunit B) 54.1876 4.98 8 100
受翻译调节的肿瘤蛋白同系物(translationally-controlled tumor protein homolog) 19.1414 4.63 6 100
　　肽段数量: 质谱分析中与已知蛋白氨基酸序列吻合的肽段数量; 可信度得分: 蛋白鉴定结果的准确度。
蛋白分别为热激蛋白 81-3 (heat shock protein 81-
3)、液泡 ATP 酶亚基 B (vacuolar ATP synthase
s u b u n i t B ) 和受翻译调节的肿瘤蛋白同系物
(translationally-controlled tumor protein homolog) (表
2)。它们在水稻和橄榄型油菜磷酸化蛋白研究中
都有过报道, 是被磷酸化修饰的蛋白。说明这种改
良的酚法可以分离到高质量的蛋白质, 而且 Pro-Q
Diamond染色后的磷酸化蛋白也可以满足质谱鉴定
的需要。
讨　　论
高质量磷酸化蛋白的获得, 对于磷酸化蛋白质
组学的研究是非常必要的。但是提取过程中很多
步骤会影响蛋白的质量, 例如样品的研磨是否完
全、迅速, 是否能充分利用变性剂、表面活性
剂、两性电解质、还原剂等成分实现蛋白的有效
溶解(徐幼平等 2007), 而且还要考虑提取时间, 时
间过长则已释放的蛋白酶还有可能会产生活性而降
解蛋白质。这些都是能否获得高质量蛋白质的关
键性步骤。
其次, 还根据植物材料的不同来选取不同的提
取方法。TCA- 丙酮法是目前最常用的蛋白提取
法。而本文中的芜菁根皮富含多糖等次生代谢产
物, 用酚法比较适合, 但长时间的沉淀, 对沉淀蛋白
的质量有一定的影响, 因此缩短沉淀时间对提高蛋
白的纯度有利。与水稻、黄瓜不同, 普通的酚法
就可以分离到高质量的蛋白(Chitted和 Peng 2007;
李凤玉等 2008)。对番茄叶片来说, 则 TCA- 丙酮
法最适合(徐幼平等 2007)。因此, 在提取植物蛋白
之前了解所研究材料的特点是必要的。
目前研究磷酸化蛋白的主要方法有: 固相金属
亲和色谱分离和纯化磷酸化蛋白(Muszynska 等
1986); 免疫沉淀选择性分离磷酸化蛋白(Conrades
和 Veenstra 2005); 磷酸肽疏水性不同通过高效液
相色谱分离(车发云等 2000)等。但是因为磷酸化
蛋白质在细胞内丰度较低, 磷酸化蛋白质的磷酸基
团很容易在分离过程中丢失。这些都给磷酸化蛋
白质的研究带来一定的困难。提取总蛋白后直接
电泳后以Pro-Q Diamond染料染色可以减少操作步
骤和磷酸化蛋白的丢失。而且SYPRO染料还可以
在Pro-Q Diamond染色后的胶上重新对总蛋白进行
染色, 这对同一块胶上分析磷酸化蛋白和总蛋白很
方便。
磷酸化蛋白由于磷酸基团的修饰作用, 主要集
中在酸性端, 我们的染色结果也有这样的特点。这
种在酸性端集中分布的情况与水稻根中的磷酸化蛋
白分布相似, 无论是高盐胁迫与否的条件下, 也是
大部分集中在酸性端(Chitted和 Peng 2007)。至于
图 2-a 和 b 所检测到的蛋白点, 磷酸化蛋白数量和
总蛋白数都是数量上磷酸化蛋白占总蛋白点的
28.2% (181/642), 比一般植物材料中的5%~10%高
出很多, 这可能与植物材料的部位特异性有一定的
关系(Agrawal和Thelen 2006)。而且检测到的蛋白
点偏少, 这可能与上样量和所用胶条的 pH 范围都
有关系。我们认为, 对此, 可以根据磷酸化蛋白分
布的特点, 选择 pH 范围较窄的胶条(pH 4~7)加以
克服, 可得到较好的分离效果, 蛋白点也多。这说
明该染色方法对研究磷酸化蛋白和总蛋白非常适合。
总之, 这种提取蛋白的改良酚法, 还可以减少
糖类等次生代谢产物的污染, 提高蛋白的纯度, 而
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且可以减少提取的时间, 一般在4 h内就可以完成。
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