全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 2期，2009年 2月 183
植物抗坏血酸合成的关键酶: L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)
俞乐, 刘拥海 *, 李充壁
肇庆学院生命科学学院, 广东肇庆 526061
The Key Enzyme for Ascorbic Acid Biosynthesis in Plants: L-galactono-1,4-
lactone Dehydrogenase (GLDH)
YU Le, LIU Yong-Hai*, LI Chong-Bi
College of Life Science, Zhaoqing University, Zhaoqing, Guangdong 526061, China
提要: 本文从酶的催化反应、酶学特征、分子生物学特性等方面介绍植物抗坏血酸合成的关键酶L-半乳糖内酯脱氢酶的
研究进展。
关键词: L-半乳糖内酯脱氢酶; 植物抗坏血酸; 基因表达; 抗逆性
收稿 2008-09-26 修定 2008-11-18
资助 广东省自然科学基金(06 02 9 35 4)。
* 通讯作者(E-mail: lyhai@zqu.edu.cn; Tel: 0758-2716207)。
抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)又名维生素C, 在
生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用。植
物、微生物和大多数动物体内可自行合成AsA, 但
是人类自身已经丧失了合成AsA的能力, 必须从食
物中摄取(Chatterjee 1973)。AsA是人类和动物维
持生长、繁殖和保证健康所必需的营养物质, 缺乏
AsA会导致坏血病(Carr和 Frei 1999)。作为植物
组织内广泛存在的高丰度小分子物质, AsA 对于植
物自身的抗氧化作用、光保护以及调节生长发育
等都有生理功能作用: AsA可以直接清除植物体内
因氧代谢、光合作用及环境胁迫等产生的活性氧
(reactive oxygen species, ROS), 保护植物有机体及
其正常代谢免于氧化胁迫造成的伤害(Smirnoff
1996); AsA是紫黄质脱环氧酶以及合成羟脯氨酸、
乙烯、赤霉素及花色素苷等次生代谢物所需双加
氧酶类的辅因子, 参与细胞间的酶促和非酶促反应,
调节细胞的生长(Eskling等 1997; Davey等 2000;
Muller-moule等 2002); 近年来的研究表明, AsA和
植物细胞的分裂有关, 内源AsA的降低可导致植株
嫩枝生长速率降低、细胞的分裂和生长受抑制
(Veljovic-Jovanovic等 2001; Tabata等 2001)。
Pastori等(2003)的研究表明, 叶中AsA含量可以通
过植物激素介导来调节植株生长。
作为植物体内重要的抗氧化剂与代谢物质,
AsA的合成途径一直受到人们的重视, 迄今, 研究
者们曾先后提出4条植物AsA的生物合成途径: L-
半乳糖途径(Wheeler等 1998)、半乳糖醛酸途径
(Agius等 2003)、古洛糖途径(Wolucka等 2003)、
肌醇途径(Lorence等 2004)。其中 L-半乳糖途径
得到很多试验数据的支持, 是公认的植物AsA的主
要合成途径。在该途径中, L-半乳糖内酯脱氢酶
(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase, GLDH, EC
1.3.2.3)直接氧化 L-半乳糖内酯(L-galactono-1,4-
lactone, Gal)生成AsA, 是植物AsA生物合成途径中
最后一步的关键酶(Oba等1995; Ostergaard等1997;
Pallanca和Smirnoff 1999; Siendones等1999; Bartoli
等 2000)。GLDH是一种线粒体酶, 此酶的研究迄
今已超过 40年。近年来的研究表明, 多种植物体
内AsA的含量与GLDH的活性密切相关(Tabata等
2001; Tamaoki等2003; Pateraki等2004)。Alhagdow
等(2007)认为GLDH除了与AsA的合成密切相关
外, 还可能在调节植物细胞生长过程中起重要作
用。越来越多的研究利用分子生物学手段对
GLDH基因进行调控, RNA干涉技术从分子水平上
进一步证实了GLDH在AsA合成中所起的关键作
用(Tabata等 2001; Alhagdow等 2007), 而在过量表
达GLDH基因的植株和细胞体系中, AsA含量以及
抗逆性均得到了有效提高(Bauw等1998; Tokunaga
等 2005)。本文就GLDH的生理生化特性、分子
生物学特性的研究进展作介绍。
1 GLDH的生理生化特性
1.1 催化作用 GLDH是植物AsA生物合成途径中
最后一步的关键酶, 能催化Gal产生AsA。GLDH
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最早从豌豆中得以鉴定(Mapson等1954), 此酶定位
于植物细胞线粒体内膜上, 因而AsA 的合成是在线
粒体内膜上完成的(Siendones 1999), GLDH专一地
以细胞色素 C (Cytc)作为酶反应的电子受体, 催化
还原 Cytc, 同时氧化Gal生成AsA (Imai等 1998)。
由于GLDH在合成植物AsA中所起的重要作用, 其
相关研究已在多种植物中展开, GLDH酶活性在豌
豆、菜豆、草莓、菠菜、马铃薯、玉米、甘
蓝、拟南芥、甘薯、花椰菜及番茄等多种植物
中均有报道(Alhagdow等2007), GLDH已成为众多
研究者探讨 AsA功能的切入点。
1.2 酶学特征 GLDH分子量约为56 kDa, 由单一多
肽链组成, 其最适 pH值为 8.0~8.5, 含有非共价结
合的黄素(Oba等 1995; Ostergaard等 1997; Imai等
1998)。GLDH蛋白在植物细胞内定位于线粒体内
膜的外侧, 它在线粒体电子传递链中位置可能位于
复合体 III和 IV之间(Bartoli等 2000)。Bartoli等
(2000)用从马铃薯块茎中纯化得到的线粒体作为试
验材料, 研究发现当培养基中加入底物Gal时呼吸
速率和AsA的合成均显著增加, 但当加入 Cytc氧
化酶的抑制剂氰化钾时AsA的合成停止, 说明当电
子受体Cytc的含量急剧减少时GLDH不能催化AsA
的合成。另外, GLDH对底物Gal的特异性相当高
(Oba等1995; Ostergaard等1997), GLDH活性位点
可能是面向膜间隙, 底物Gal不需要转运到线粒体
基质侧, 在线粒体膜间隙就可将电子传递给 Cytc,
Gal以及合成的AsA都可以经由线粒体外膜的膜孔
蛋白自由进出线粒体的膜间隙(Smirnoff 2000)。
GLDH可能是一个黄素蛋白, 多数植物GLDH蛋白
的氨基酸序列具有3个可预测的跨膜区和一个位于
膜外侧的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合域(Bartoli
等 2000)。在甘薯和烟草中, 核黄素(FAD的抑制
剂)能抑制由GLDH催化的Cytc的还原反应(Imai等
1998; Yabuta等2000), 而此抑制剂对花椰菜GLDH
的催化反应却无影响(Ostergaard等 1997)。另外,
玉米抽提物的研究发现石蒜碱是GLDH的有效抑
制剂, 石蒜碱能抑制从甘薯中纯化得到的GLDH的
活性(Imai等 1998), 然而从花椰菜中纯化的GLDH
却不受石蒜碱抑制(Ostergaard等 1997)。2003年,
Millar等报告呼吸链中的复合物 I也与植物AsA的
生物合成密切相关, 呼吸复合物 I甚至具有催化
AsA生物合成的活性, 是GLDH的一个同工酶; 此
外, 他们还发现用呼吸抑制剂处理拟南芥培养细胞,
对细胞的AsA合成能力竟有诱导作用, 尽管这一诱导
作用的机制尚不清楚。已有人从花椰菜(Ostergaard
等1997)和甘薯(Imai等1998)中纯化得到GLDH, 它
们由分子量为 56 kDa的单一多肽组成, 都含有对
酶活性起重要作用的半胱氨酸残基。
2 GLDH的分子生物学特性
2.1 GLDH的基因 GLDH的 cDNA已从花椰菜
(Ostergaard等 1997)、甘薯(Imai等 1998)、烟草
(Yabuta等 2000)、拟南芥(Tamaoki等 2003)、甜
瓜(Pateraki等2004)及番茄(Alhagdow等2007)等多
种植物中获得克隆, GLDH的基因在以上植物的基
因组内均以单拷贝形式存在。来源于不同植物的
GLDH基因具有相似的结构, 它们编码具有较高相
似性的 581~610个氨基酸, 蛋白质分子量约为 56
kDa。Pateraki等(2004)对甜瓜、草莓、烟草、番
茄、甘薯、花椰菜、拟南芥的 GLDH 的氨基酸
序列进行了比对分析, 发现它们在N端均存在有一
段推测的线粒体定位结构域序列, 并存在有信号肽
的切割位点 FR/YA。该信号肽的特点是相对富含
Ala、Leu、Arg和 Ser, 而少含Asp、Glu、Val和
Ile (Von Heijne 1986)。甜瓜与草莓、烟草、番茄、
甘薯、花椰菜、拟南芥GLDH氨基酸序列的相似
性分别为: 79.1%、78.9%、74%、78%、79.2%、
78.2%, 另外, GLDH的基因在以上植物中都存在有
保守的FAD结合域 “VGSGLSP”, 表明黄素基团参
与了GLDH的酶反应过程(Pateraki等 2004)。
2.2 GLDH的表达调控
不少研究表明, GLDH基因受光调控。Tabata
等(2002)的研究发现, 烟草叶片GLDH基因受到光
的调控, 其表达水平变化与AsA含量变化相一致。
Tamaoki等(2003)发现拟南芥幼苗GDLH基因的表
达呈现出昼夜变化的特点, 其表达水平在早晨较低,
白天逐渐上升, 在夜晚逐渐下降, GLDH活性和AsA
含量也表现出相似的变化, 而在黑暗中培养的植株
则观察不到mRNA水平、酶活性及AsA含量的昼
夜变化, 表明GLDH基因表达的昼夜变化受光调控,
它在调控 As A 库的大小上可能起着重要作用。
Pateraki等(2004)的研究发现甜瓜幼苗移至暗中后
GLDH的mRNA水平下降, 表明甜瓜GLDH基因表
达受光调控, 甜瓜GLDH基因在研究的所有组织中
都有表达, 但不同组织的表达水平有差异, 在茎中
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表达水平最高, 在种子和根中表达水平最低, 随着
甜瓜果实成熟, 总体上GLDH基因表达水平上升,
AsA含量也相应地增加。
2.3 GLDH的功能
GLDH在植物AsA的生物合成途径中所起的
关键作用越来越受到研究者的重视, 已有不少研究
采用分子生物学手段对GLDH基因表达进行调控,
以此来控制植物体内AsA的含量, 在此基础上进一
步研究AsA在植物生长与发育以及抗逆性等方面
所起的重要作用。Ostergaard等(1997)的研究表明
花椰菜GLDH 的cDNA克隆能够在酵母中表达, 并
大大提高了GLDH的活性。Bauw等(1998)分别采
用正义和反义RNA技术将花椰菜GLDH基因导入
烟草, 使得转基因正义烟草植株的GLDH活性比野
生型提高了2~3倍, AsA含量也相应提高了约30%;
而反义烟草植株的GLDH活性只有野生型的25%,
同时AsA含量也下降了约 60%。Tabata等(2001)
通过反义 RNA技术抑制GLDH基因的表达, 转基
因烟草细胞内AsA的含量降低 24%~27%, 细胞有
丝分裂指数低于野生型, 对细胞的分化和生长产生
不利影响, 在表型方面, 显微结构显示转基因烟草
细胞呈细长状, 明显不同于野生型。Tokunaga等
(2005)通过正义RNA技术调控GLDH基因的表达,
转基因烟草细胞内AsA含量得到提高, 为野生型的
1.5~2倍, GLDH活性也相应提高, 转基因烟草细胞
的有丝分裂指数要高于野生型, 细胞褐化明显减少,
细胞的生长以及抗衰老能力均增强, 对百草枯处理
所形成的氧化胁迫也表现出较强的抗性。
Alhagdow等(2007)对番茄GLDH基因进行了RNA
干涉, 转基因植株GLDH的活性下降 80%, 虽然与
野生型相比总AsA含量变化不大, 但AsA/DHA比
率发生改变, 番茄转基因植株的生长和结实受到明
显影响, 该研究认为GLDH基因沉默可能通过改变
线粒体的能量代谢反应和质外体抗坏血酸库的氧化
还原状态来影响番茄植株的生长和结实。
3 结语
迄今人们对 GLDH的分子结构、催化机制、
表达调控和参与的生理现象已经进行了广泛研究,
并取得一定的进展。GLDH直接氧化Gal生成AsA,
是植物AsA生物合成途径中的关键酶。AsA除了
在抗氧化作用、光合作用以及生长发育等都有生
理功能外, 还与植物的抗逆性呈正相关, AsA的含
量、氧化还原状态(AsA/DHA比率)及其合成与代
谢相关酶类活性的变化涉及植物对一系列环境胁迫
的响应, 植物细胞内AsA含量的增加, 能增强植物
抵抗高光强、干旱、水涝、盐碱、紫外辐射及
臭氧等逆境的能力(Conklin等 1996; Arrigoni和De
Tullio 2002; Sanmartin等 2003)。AsA还可能在植
物逆境反应中起信号分子的作用(Karpinski等1997;
Pignocchi和 Foyer 2003), GLDH基因的超量表达,
可以提高植物体内AsA的含量, 同时植株对逆境的
抗性也有一定程度的提高(Bauw等1998; Tokunaga
等 2005)。相信随着研究的不断深入, 尤其是生物
信息学的发展, 人们可以通过GLDH基因的调控, 实
现对多种植物AsA生物合成的调控, 为植物AsA含
量及其抗逆性的提高提供又一条可行途径。
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