全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 11 期，2009 年 11 月1110
收稿 2009-04-10 修定 　2009-10-13
* 通讯作者(E-mail: wangweijun@scau.edu.cn)。
芸苔(菜心)茎叶中的几丁质结合蛋白的分离纯化和某些特性分析
詹冬香 1, 黄九九 2, 庞学群 2, 王炜军 *
1 广东天普生化医药股份有限公司, 广州 510520; 2 华南农业大学生命科学学院, 广州 510642
Isolation and Purification and Some Characteristic Analysis of Chitin-Binding
Proteins from Stems and Leaves of Brassica campestris L.
ZHAN Dong-Xiang1, HUANG Jiu-Jiu2 , PANG Xue-Qun2, WANG Wei-Jun*
1Techpool Bio-Pharma Co., LTD., Guangzhou 510520, China; 2College of Life Sciences, South China Agricultural University,
Guangzhou 510642, China
提要: 用脱氨再生几丁质亲和层析和羧甲基 -纤维素CM52离子交换柱层析从芸苔(菜心)的茎叶中纯化了4种几丁质结合
蛋白: CBPa、CBPb、CBPc和 CBPd, SDS-PAGE显示 CBPa和 CBPb的分子量分别为 29.04 kDa和 30.68 kDa, 凝胶过滤方
法测定CBPa和CBPb的分子量分别为 29.04 kDa和 31.2 kDa, 表明两者都是单体酶。4种CBP蛋白均有几丁质酶活性, 其
中CBPa和CBPb还有溶菌酶活性。EDTA对CBPa和CBPb溶菌酶的活性均无影响, 各种类型的几丁质对CBPa和CBPb都
有较强的吸附作用, PAS染色法分析表明CBPa和CBPb均为糖蛋白。
关键词: 芸苔(菜心)茎叶; 几丁质结合蛋白; 纯化; 糖蛋白
几丁质结合蛋白(chitin-binding protein, CBP)是
一类能与几丁质特异结合的蛋白质(Ra ikhel 和
Quatrano 1986), 广泛存在于各种微生物、动物和
植物中, 有些在生物体受到伤害、病虫害侵染时会
诱导产生。已发现的 CBP 主要有凝集素、部分几
丁质酶、溶菌酶、抗微生物多肽和抗真菌蛋白等
(Broeakaert等 1989; Watanabe等 1990; Kawabata等
1996; Liu等 2002), 它们主要有抗菌抗虫功能, 有些
还参与植物发育调控或作为储存蛋白(Bormann 等
1999; Conrads-Strauch等 1990; Czapla和Lang 1990;
Yang和Tang 1993; Santos等2004)。本文从芸苔(菜
心)茎叶中分离到4种几丁质结合蛋白, 并对具有溶
菌酶和几丁质酶活性的CBPa和CBPb一些特性进行
了初步研究。几丁质酶与植物对病原微生物(特别
是真菌类病原)的抗性有关, 是一种病程相关蛋白。
本文中方法对研究芸苔属植物中抗病蛋白(几丁质
结合蛋白)和共抗病机制可能有某些参考价值。
材料与方法
芸苔(菜心) (Brassica campestris L.)网室栽培
60 d 左右, 菜心长出花蕊, 即将开花时收割。
溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)购自
Sigma 公司; CM-Cellulose CM52 购自 Whatman公
司; 考马斯亮蓝 R2 50 /G 25 0 购自 F luka 公司;
Sephadex G-75 购自 Phamacia 公司; 脱氨再生几丁
质凝胶参照王炜军和徐凤彩(1996)方法自制; 其它
试剂均为国产分析纯或生化试剂。
几丁质结合蛋白的分离纯化按王炜军和徐凤
彩(1996)文中方法。取 3 kg 菜心叶和茎洗净、切
碎, 加入 4 ℃预冷的含 0.2 mol·L-1 NaCl的 5 mmol·L-1
NaHCO3 (3:1, W/V)捣碎, 尼龙布(200目)过滤, 离心
(4 ℃, 11 000×g , 10 min), 取上清液, 加入200 mL脱
氨再生几丁质凝胶, 于 4 ℃以下搅拌吸附1 h, 然后
将脱氨再生几丁质凝胶装入层析柱(4.0 cm×20.0
cm), 先用含0.2 mol·L-1 NaCl 的5 mmol·L-1 NaHCO3
洗涤至 280 nm光密度小于 0.05 (A280<0.05), 再改
用 0.15 mol·L-1 醋酸(HAc)洗脱, 流速 3 mL· 管 -1, 6
min· 管 -1, 收集溶菌酶洗脱液。
将上述洗脱液超滤浓缩至约10 mL, 超滤至体
积约 5 mL时加入 50 mL 20 mmol·L-1 的 HAc-NaAc
缓冲液(pH 5.0), 继续超滤至体积约为 10 mL, 放入
预先用 20 mmol·L-1的HAc-NaAc缓冲液(pH 5.0)平
衡过的羧甲基 - 纤维素(carboxymethyl-cellulose)
CM52 层析柱(2.0 cm×8.0 cm), 用含 0~0.5 mol·L-1
KCl 的 20 mmol·L-1 HAc-NaAc 缓冲液(pH 5.0)进行
梯度洗脱, 流速 3 mL· 管 -1, 6 min· 管 -1, 分别收集各
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 45 卷 第 11 期，2009 年 11 月 1111
个蛋白洗脱峰, 测定其溶菌酶活性。
测定溶菌酶活性时将溶壁微球菌底物研磨后,
用 20 mmol·L-1的HAc-NaAc缓冲液(pH 5.0)配成光
密度为 A450 0.6~0.75 之间的悬浮液。活性在 25 ℃
下测定, 取 2.5 mL底物悬浮液放入比色杯中, 加入
0.1 mL 酶液, 迅速搅匀, 测定其 450 nm 处的光吸
收值的变化。以每分钟光吸收值下降0.001为一单
位酶活性(U)。
测定几丁质酶活性时以胶状几丁质凝胶为底
物, 参照 Boller 等(1983)文中方法, 缓冲液为 20
mmol·L-1 HAc-NaAc (pH 5.0), 以每小时产生 1 μg N-
乙酰葡萄糖胺所需的酶量作为一个酶活性单位(U)。
蛋白含量测定按Bradford (1976)的方法, 以牛
血清白蛋白为标准蛋白。
分子质量测定参照张龙翔等(1985)书中的方法
进行SDS-PAGE, 然后求得CBPa和CBPb的分子质
量。参照沈同和张静岩(1990)书中的方法, 用葡聚
糖Sephadex G-75凝胶过滤测定CBPa和CBPb的分
子质量。
作金属离子对CBPa和CBPb溶菌酶活性影响
时, 于反应体系中加入终浓度为 5 mmol·L-1 不同的
金属离子, 25 ℃下放置 30 min, 其间不断振摇、
混匀, 按照测定溶菌酶活性方法测定酶活性。
作生物多糖对CBPa和CBPb的吸附作用时, 将
纯化的CBPa和CBPb分别用含 0.2 mol·L-1 NaCl的
5 mmol·L-1 NaHCO3溶液于室温下透析过夜, 备用。
分别称取以下物质各 10 mg: 胶状几丁质粉、几丁
质粉、脱氨再生几丁质粉、壳聚糖、Sephadex
G-75、燕麦木聚糖、可溶性淀粉和纤维素, 然后
分别加入 0.5 mL的 CBPa 和CBPb, 不断振摇, 4 ℃
下开放吸附 1 h 后, 离心(11 000×g, 5 min), 取上清
液测定溶菌酶活性。按吸附百分率(%)＝(吸附前
酶液的溶菌酶活性-吸附后酶液的溶菌酶活性)/吸
附前酶液溶菌酶活性 ×100% 计算。
CBPa和CBPb蛋白糖基化的定性分析参照方
德福(1998)书中的高碘酸(periodic acid, PA)染色法,
CBPa和CBPb经SDS-PAGE后, 先以PA染色, 拍照,
脱色后, 再用考马斯亮蓝染色。
结果与讨论
1 菜心中 CBPs的纯化
从菜心的茎叶提取得到粗酶液的溶菌酶活性
为208 U·mL-1, 以脱氨再生几丁质凝胶亲和层析后,
洗脱液中只出现1个蛋白峰(图1), 此峰具有溶菌酶
活性。收集此峰洗脱液 27 mL 即为菜心的几丁质
结合蛋白, 它的蛋白含量为 255.55 μg·mL-1, 溶菌酶
比活性为 29 200 U·mg-1。
图 1 菜心 CBPs 的脱氨再生几丁质凝胶亲和层析分离
由于用酸碱处理, 硫酸铵分步沉淀和凝胶柱过
滤等步骤(周泽文等 1994)纯化菜心溶菌酶, 效果不
佳, 比活性仅为 3 414.6 U·mg-1。因此本文用亲和
层析后的酶液经超滤浓缩后, 再行CM-纤维素 CM52
阳离子交换柱层析, 分离出 4 个蛋白峰, 即 CBPa、
CBPb、CBPc 和 CBPd (图 2), 经 SDS-PAGE 纯度
鉴定, CBPa、CBPb、CBPc 和 CBPd 均显示为单
一谱带(图 3 ) , 表明这四个组分均达到电泳纯。
CBPa 的蛋白含量为 86.46 μg·mL-1, 溶菌酶比活性
为 59 239 U·mg-1; CBPb的蛋白含量为 14.56 μg·mL-1,
溶菌酶比活性为 137 530 U·mg-1; CBPc 和 CBPd 的
蛋白含量分别为9.37和12.13 μg·mL-1, 两者均没有
溶菌酶活性。且操作简单易行。
2 菜心中CBPs与鸡蛋清溶菌酶(HEWL)的酶活性
比较
CBPa和CBPb既有溶菌酶活性又有几丁质酶
活性, 是一种溶菌酶 / 几丁质酶双功能酶, 而 CBPc
和CBPd只有几丁质酶活性(表1), 4种CBP与鸡蛋
清溶菌酶(HEWL)相比较均有很高的几丁质酶活
性。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 11 期，2009 年 11 月1112
表 1 菜心 CBPs 的 4 个组分和鸡蛋清溶菌酶的几丁质酶 / 溶菌酶活性比较
总几丁质酶 外切几丁质酶 内切几丁质酶 溶菌酶比活性 / 溶菌酶比活性
酶 比活性 / 比活性 / 比活性 / 和总几丁质酶
U·mg-1(蛋白) U·mg-1(蛋白) U·mg-1(蛋白) U·mg
-1 (蛋白) 比活性的比值
CBPa 222.26 77.00 145.26 59239 266.53
CBPb 442.81 120.82 321.99 137530 310.58
CBPc 318.59 117.57 201.02 0 0
CBPd 229.58 57.23 172.35 0 0
HEWL 13.90 7.56 6.34 177255 12752.16
图 2 菜心 CBPs 的 CM-纤维素 CM52 层析分离
3 菜心 CBPs的分子量
一般植物中 CBP的分子量都在 24~40 kDa 之
间(Howard等 1967; Glazer等 1969), 而且都是单体
蛋白。SDS-PAGE分析CBPa 和CBPb的亚基分子
量分别为 29.04和 30.68 kDa (图 4), Sephadex G-75
凝胶过滤测定CBPa和CBPb全酶的分子量分别为
29.04 和 31.2 kDa (图 5), 表明 CBPa 和 CBPb 都为
单体酶。萝卜块根中(赖晓芳等 2006)中分离到的
CBP1 和 CBP2 的分子量分别为 26.9 和 24.8 kDa。
4 金属离子对CBPa和CBPb溶菌酶活性的影响
没有观察到 EDTA 对 CBPa、CBPb的溶菌酶
活性有影响, 说明这两种酶在各自反应过程中都不
需要金属离子的参与。M n 2 +、C o 2 +、M g 2 +、
Ca2+、Cu2+、Fe2+ 和 Hg2+ 对 CBPa 溶菌酶活性有明
显的抑制作用, 而K+对CBPa溶菌酶活性的影响不
明显。K+、Mn2+、Co2+、Mg2+、Ca2+ 和 Cu2+ 对
CBPb溶菌酶活性有一定的抑制作用, Fe2+和Hg2+对
图 3 菜心 CBPs 的 SDS-PAGE 图谱
1: 粗酶液(20 μg); 2: 亲和层析后酶液(10 μg); 3: 标准蛋白样
品; 4: CBPa (2 μg); 5: CBPb (2 μg); 6: CBPc (2 μg); 7: CBPd (3 μg)。
CBPb 溶菌酶活性有较强的抑制作用(图 6)。
5 生物多糖对CBPa和CBPb的吸附分析
某些CBP结合糖具有一定的专一性, 如链霉菌
属Streptomyces reticuli分泌的CHB2只能特异地结
合 α- 几丁质, 而对其它多糖无结合能力(Kolbe 等
1998)。马蹄形蟹血球中的抗微生物蛋白 S2 也只
能特异地与几丁质结合, 而不与纤维素、甘露聚
糖、木聚糖及海带多糖结合(Kawabata 等 1996)。
由图 7可知, 胶状几丁质、几丁质粉和脱氨再生几
丁质对CBPa和CBPb都有较强的吸附能力; 而壳聚
糖、燕麦木聚糖和纤维素对CBPb有一定的吸附作
用, 但壳聚糖、燕麦木聚糖和纤维素对 CBPa 的吸
附作用相对较弱; 葡聚糖 G-75 和可溶性淀粉对
CBPa 和 CBPb几乎没有吸附作用。表明两者酶分
子中均存在几丁质结合结构域。
6 CBPa和CBPb蛋白糖基化的定性分析
PA染色是根据希夫试剂与糖类物质生成红色
植物生理学通讯 第 45 卷 第 11 期，2009 年 11 月 1113
图 5 Sephadex G-75 凝胶过滤分析测定的 CBPa
和 CBPb 全酶的分子量
1: 牛血清白蛋白(66.2 kDa; 洗脱体积 105.5 mL); 2: 辣根过
氧化物酶(40.0 kDa; 洗脱体积 118.0 mL); 3: CBPb (洗脱体积
137.5 mL); 4: CBPa (洗脱体积 141.0 mL); 5: α- 胰凝乳蛋白酶
(25.0 kDa; 洗脱体积 151.0 mL); 6: 鸡蛋清溶菌酶(14.4 kDa; 洗
脱体积 17 5.0 mL)。
图 6 不同金属离子对 CBPa 和 CBPb 溶菌酶活性的影响
图 7 生物多糖对 CBPa 和 CBPb 的吸附作用
图 4 SDS-PAGE 分析测定的 CBPa 和 CBPb 亚基的分子量
1: 兔磷酸羧化酶 B (97.4 kDa; 电泳迁移率 0.09659); 2: 牛血
清白蛋白(66.2 kDa; 电泳迁移率 0.1534); 3: 兔肌动蛋白 (43.0
kDa; 电泳迁移率 0.2614); 4: 牛碳酸酐酶(31.0 kDa; 电泳迁移率
0.3977); 5 : CBPb (电泳迁移率 0.4091); 6 : CBPa (电泳迁移率
0.4261); 7: 胰蛋白酶抑制剂(20.1 kDa; 电泳迁移率 0.5455); 8:
鸡蛋清溶菌酶 (14.4 kDa; 电泳迁移率 0.6591)。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 11 期，2009 年 11 月1114
的希夫碱的原理鉴定糖类物质的方法。PA染色法
可与常规的考马斯亮蓝染色法联合应用于 SDS-
PAGE 凝胶染色。通过 PA 染色后, 凝胶上的糖蛋
白条带呈红色。CBPa和CBPb经 SDS-PAGE再用
PA染色呈显阳性, CBPa和CBPb对应的蛋白条带呈
现出来(图 8), 说明CBPa 和CBPb都为糖蛋白。迄
今未见有植物中具有几丁质酶活性的几丁质结合蛋
白属于糖蛋白的研究报道, 只有认为凝集素是糖蛋
白的报告。
参考文献
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图 8 CBPa 和 CBPb 的 PA和 PA-CB 染色法分析
1、4: 标准蛋白样品; 2、5: CBPa (4 μg); 3、6: CBPb (4
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