全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (9): 879~884 879
收稿 2011-05-31　　修定 2011-08-31
资助 浙江省自然科学基金(Y3090249)。
* 通讯作者(E-mail: ljcheng@zju.edu.cn; Tel: 0571-63742885)。
缺Cu2+和Zn2+对水稻OsNRAMP家族基因表达与主要金属离子吸收的影响
孙丽娟, 程龙军*
浙江农林大学林业与生物技术学院, 浙江临安311300
摘要: 对野生型水稻进行缺Cu2+和Zn2+处理, 利用定量RT-PCR技术分析OsNARAMP家族不同基因的表达情况, 并采用ICP-
MS技术检测在水稻根、茎叶中Fe、Zn、Cu和Mn等元素的积累情况。结果表明水稻中OsNRAMP家族有9个基因, 可分为3
个亚类; OsNRAMP5可能参与了Cu2+的吸收和转运, 而OsNRAMP2和OsNRAMP3可能参与Zn2+吸收和转运。同时缺Cu2+和
Zn2+能刺激Fe2+离子在水稻根和茎叶中的积累, 减缓Mn2+离子在根中的吸收; 而缺Cu2+减缓水稻中Zn2+离子的吸收。这些金
属离子吸收的情况和OsNRAMP家族可能存在密切关系。
关键词: OsNRAMP; Cu2+; Zn2+; 金属离子吸收; 水稻
Effects of Deficiency of Copper and Zinc on OsNRAMPs Expression and Main
Metal-Ions Uptake in Oryza sativa L.
SUN Li-Juan, CHENG Long-Jun*
College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin’an, Zhejiang 311300, China
Abstract: The expression of OsNRAMP family were analyzed by quantity RT-PCR with deficiency of copper
and zinc in rice, the accumulation of iron, zinc, copper and magnesium were also measured by ICP-MS. The
results showed OsNRAMP family of nine genes could be divided into three sub-categories. OsNRAMP5 was
possibly involved in the uptake and transportation of copper, and OsNRAMP2 and OsNRAMP3 also played an
important role in the uptake and transportation of zinc. The deficiency of copper and zinc could stimulate the
accumulation of iron and decrease the uptake of manganese, and the deficiency of zinc also slowed down the
accumulation of copper. OsNRAMPs family may be closely related to the metal-ions uptake.
Key words: OsNRAMP; Cu2+; Zn2+; metal-ion uptake; Oryza sativa L.
植物中金属离子的运输和平衡对其生长和发
育以及抗逆具有非常重要的作用。研究参与这个
过程的基因尤其是编码转运体蛋白相关的基因,
对了解植物体吸收、运输、分配金属离子的机制
意义重大(Clemens 2001; Curie等2000)。NRAMP
(natural resistance associated macrophage protein)基
因家族编码的蛋白就是生物中参与金属离子转运
和分配功能的重要成员之一。该类基因首先在哺
乳动物中发现并克隆, 在细菌、藻类和植物中也
广泛存在, 且进化保守。研究发现他们具有非常
广谱的二价金属离子运输功能, 包括Fe2+、Zn2+、
Mn2+、Co2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+等, 而且能同
时运输它们中的两种或两种以上, 运输模式采用
质子共运输的形式(Gunshin等1997; Nevo和Nelson
2006)。同时, NRAMP转运体还负责生物体内的金
属离子平衡作用。
Cu和Zn都是植物中重要的营养元素, 同时它
们的过度积累又会对植物造成伤害, 因此植物在
这些金属元素的吸收、运输和贮存方面必须保持
平衡, 这对植物的生长发育也至关重要。植物中
转运金属离子的载体很复杂, NRMAP家族的基因
就是其中的重要一类。但目前针对NRAMP家族基
因与Cu2+、Zn2+吸收转运的关系仍缺乏相应的研
究。Belouchi等(1997)首先从水稻中克隆了3个
NRAMP基因OsNARAMP1、OsNARAMP2和Os-
NARAMP3。本研究以此为基础, 进一步在全基因
组水平搜寻了NRAMP基因的同源基因, 研究了在
缺Cu2+和Zn2+条件下这些基因的表达, 以及Fe2+、
Cu2+、Zn2+和Mn2+在水稻中的吸收和转运, 为进一
步研究水稻NRAMP基因的功能以及金属元素吸收
植物生理学报880
之间的关系奠定了基础。
材料与方法
1 供试材料和试剂
水稻(Oryza sativa L.)为野生型材料‘日本晴’
(Nippobare)。实验生化试剂主要购自TAKARA公
司, RNA提取Trizol试剂购自Invitrogen公司。其他
实验试剂均为国产试剂。
2 方法
2.1 OsNRAMP基因的生物信息学分析
分别以OsNRAMP1、OsNRAMP2和OsNRAMP3
的蛋白序列在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
进行tblastn比对, 搜寻与它们同源性较高的基因,
并利用PFAM蛋白数据库对结果中的蛋白进行功
能预测。然后, 将这些基因利用CLASTALW软件
进行多序列联配 , 分析它们的同源特征。并用
MEGA和PHYLIP软件构建OsNRAMP基因家族的
进化树, 对其进行进化上的分类。
2.2 缺Cu2+和缺Zn2+条件下不同OsNRAMP基因的
定量RT-PCR表达分析
水稻培养液按国际水稻所标准营养液配方
(Yoshida等1976)进行配制。溶液配好后, 调溶液
pH值为5.5。取发芽的野生型种子在生长箱中培
养, 培养温度: 白天30 ℃, 夜晚22 ℃; 相对湿度
80%; 光照强度450 mmol·m-2·s-1。正常水稻培养液
中生长20 d至4叶期, 然后转移至不加Cu2+或不加
Zn2+水稻培养液中进行培养, 以正常培养的作为对
照。培养3 d后, 用Trizol试剂提取水稻的根和茎叶
组织中RNA, 进行逆转录, 作为模板, 设计定量RT-
PCR引物(表1)后, 以OsACTIN为内参基因在Bio-
Rad CFX96定量PCR仪上进行基因定量表达实验,
每个处理重复3次。根据相对定量表达公式2-ΔΔCt
计算不同基因的相对表达结果。
2.3 缺Cu2+和缺Zn2+条件下水稻根、茎叶中Fe2+、
Cu2+、Zn2+和Mn2+含量的测定
将缺Cu2+、缺Zn2+和正常培养的水稻苗继续
培养18 d, 分别取地上部分和根用去离子水冲洗3
次, 然后在70 ℃烘箱中烘烤2 d至重量不再改变,
然后粉碎或研磨成粉。称取500 mg左右粉末, 加5
mL的HNO3 (11 mol·L
-1), 在150 ℃下消化5 h, 用去
离子水定容至50 mL (Takahashi等2003)。用ICP-
MS (Agilent7500ce, Santa Clara, CA, US)分析样品
中的Fe2+、Cu2+、Zn2+和Mn2+金属离子含量。试验
重复3次。
结果与讨论
1 OsNRAMP基因的生物信息学分析
以已知的OsNRAMP1、OsNRAMP2、OsN-
RAMP3蛋白序列在NCBI进行tblastn比对, 结合
PFAM蛋白数据库对结果蛋白功能的预测, 最终选
择与其同源性较高的6个基因, 以这9个基因作为
研究对象。在RGAP网站(http://rice.plantbiology.
msu.edu/)上 , 这9个基因的座位号分别为OsN-
RAMP1 (LOC_Os07g15460)、OsNRAMP2 (LOC_
Os03g-11010)、OsNRAMP3 (LOC_Os06g-
46310)、OsNRAMP4 (LOC_Os02g03900)、
OsNRAMP5 (LOC_Os07g15370)、OsNRAMP6
(LOC_Os01g31870)、OsNRAMP7 (LOC_Os012g-
表1 OsNRAMP基因家族定量RT-PCR引物
Table 1 Primers for qRT-PCR of OsNRAMPs
基因名称 上游引物(5→3) 下游引物(5→3)
OsACTIN TCAGCAACTGGGATGATATGGAG GCCGTTGTGGTGAATGAGTAAC
OsNRAMP1 ATCGGCTAATCTTGGAGTGGT TTTGCTGATGCGGGTGTATTC
OsNRAMP2 ATGGAGTGAGAAAATTGGAAGC CAGCCCAATAGCCCAGATATAC
OsNRAMP3 TGGTGTGGTGTTCTGATAACTG CAATTCATCTGGTCTTCAGGAC
OsNRAMP4 TCTGATGACATTCCTGAAGTGT CGATGAATGCAAGACTACACTC
OsNRAMP5 AGTGGTTACAGGGAGGCATC GTCTTCCTCGATAGCACCAAG
OsNRAMP6 GTTACAAGGATATGGGGCTCGG CGGCAAATGAGAGATTGTTGGC
OsNRAMP7 CACACAATGTGTTTCTCCATTC GGATCTGAATTGATTGAAGCAC
OsNRAMP8 GGTTTTATGGAACCAAAGAAG CTCGGACCTATCTTAAACACTC
OsNRAMP9 TACGCTGTTCCTGGCTGTCACT GAGTGCCATGACCAGACTCCAC
孙丽娟等: 缺乏Zn2+、Cu2+对水稻OsNRAMP家族基因表达与主要金属离子吸收的影响 881
39180)、OsNRAMP8 (LOC_Os03g41064)和OsN-
RAMP9 (LOC_Os03g-49400)。这9个OsNRAMP蛋
白的序列比对结果(图1)发现, OsNRAMP1与OsN-
RAMP3、OsNRAMP4、OsNRAMP5和OsN-
R A M P 6的序列同源性比较高 , 分别达到了
56.67%、55.38%、52.94%和49.21%。而OsN-
RAMP2与OsNRAMP7、OsNARMP8同源性较高,
分别为76.13%和71.69%。PFAM蛋白数据库的预
测结果表明, OsNRAMP9具有NRAMP蛋白结构特
征, 但它同样具有乙烯响应不敏感蛋白结构的特
征 , 而其他OsNRAMP则没有这个特点。Os-
NARAMP9与OsNRAMP2、OsNRAMP3的同源性
比较低, 分别为34.88%和36.62%, 而与OsNAR-
MAP1的同源性只有24.09%。但此蛋白仍被认为
可能是NRAMP家族的一个新成员(Belouchi等
1997)。
用MEGA 4构建的系统进化树(图2)显示, 这9
个基因分为3个亚类, 其中OsNRAMP9与其他成员
的关系最远, 独立作为一个亚类; 而OsNRAMP1、
OsNRAMP3、OsNRAMP4、OsNRAMP5和OsN-
RAMP6在进化上关系比较近, 同属于一个亚类; 而
OsNRAMP2、OsNRAMP7和OsNARMP8同属于一
个亚类。这与蛋白序列对比的结果是相同的。
2 缺Cu2+和缺Zn2+条件下不同OsNRAMP基因的定
量RT-PCR表达分析
图3表明, 缺Cu2+条件下, 在根中除了OsNRAMP5
表现出上调外, OsNRAMP1、OsNRAMP2、OsN-
RAMP8和OsNRAMP9都有下调现象; 在茎叶中, 除
图1 水稻NRAPM基因家族编码的蛋白序列比对
Fig.1 Sequence alignment of proteins encoded by OsNRAMP family
图中黑色区域代表100%的同源性, 灰色区域代表至少60%的同源性。
植物生理学报882
图2 水稻NRAMP基因家族的系统进化分析
Fig.2 Phylogenetic analysis of OsNRAMP family
图3 缺Cu2+和缺Zn2+条件下不同OsNRAMP基因在水稻根和茎叶中的定量RT-PCR分析
Fig.3 RT-PCR analysis of OsNRAMP genes in roots and shoots with deficiency of Cu2+ and Zn2+
孙丽娟等: 缺乏Zn2+、Cu2+对水稻OsNRAMP家族基因表达与主要金属离子吸收的影响 883
OsNRAMP2和OsNRAMP3基因略有下降, 其他基因
都明显下调, 其中OsNRAMP1和OsNRAMP5分别下
调5.69倍和4.96倍。因此推测, OsNRAMP5很可能
参与了根部Cu2+的吸收和转运, 而缺Cu2+条件下该
基因在茎叶中的下调则可能与缺Cu2+时引起的其
他金属离子的吸收与平衡有关, 即OsNRAMP5在水
稻地上部分还可能参与了除Cu2+之外的其他金属
离子的运输和分配。
在缺Zn2+条件下, OsNRAMP2、OsNRAMP3、
OsNRAMP7和OsNRAMP9在根中都被上调, 其中以
OsNRAMP2上调幅度最大; 而OsNRAMP1、OsN-
RAMP4和OsNRAMP5在根中则有所下调。而在茎
叶中, 除了OsNRAMP2和OsNRAMP3有略微上调;
其他基因都表现出下调的趋势, 其中OsNRAMP1、
OsNRAMP6和OsNRAMP8分别下调了2.57、3.57和
3.05倍。因此, 在水稻OsNRAMP基因家族中, OsN-
RAPM2和OsNRAMP3参与Zn2+吸收转运的可能性
比较大。
3 缺Cu2+和缺Zn2+条件下水稻根、茎叶中Fe2+、
Cu2+、Zn2+和Mn2+含量的测定
从图4可见, 在缺Zn2+和缺Cu2+条件下, 水稻根
中Fe2+的含量分别提高了26.9%和11.1%; 而茎叶中
的则分别提高了24.6%和34.6%。缺Zn2+条件下, 水
稻茎叶中Zn2+的含量没有显著变化, 而根中Zn2+的
含量减少, 这说明Zn2+在水稻不同组织中的移动性
比较强。在缺Zn2+条件下, 根中Mn2+含量明显降
低, 幅度达43.3%, 而茎叶中Mn2+含量没有明显变
化。缺Cu2+同样会影响植物对Zn2+的吸收, 在根和
茎叶中Zn2+的含量分别下降57.1%和29.7%。缺
Zn2+对Cu2+的吸收没有太大影响。这些结果说明,
Fe2+、Cu2+、Zn2+和Mn2+这些植物中重要的金属元
素在吸收转运中具有明显的互相影响。
缺铁条件能刺激Cu2+、Zn2+和Mn2+的增加
(Cheng等2007; Ishimara等2007), 本文结果表明, 缺
Cu2+和缺Zn2+处理也能刺激Fe2+的积累, 但却导致
Mn2+吸收的下降。OsNRAMP1基因已经被证明参
与Fe2+和Mn2+的吸收, 它在缺Zn2+和缺Cu2+条件下
的下调可能与Fe2+积累的反馈调控有关, 同时, 它
的下调作用导致了Mn2+在根中吸收的减少(戚金亮
等2003)。但在茎叶中, Mn2+的含量并没有显著降
低, 暗示茎叶中Mn2+的吸收和平衡可能由另外的
基因控制, 而其他在茎叶中下调的基因是否参与
了这个过程需要进一步的研究。另外一些OsN-
RAMP基因下调可能与茎叶中Fe2+积累的反馈作用
有关。缺Cu2+条件下, Zn2+的吸收也被严重抑制,
这可能与缺Cu2+条件下根和茎叶中大量OsNRAMP
基因的下调有一定的关系。正如拟南芥中At-
NRAMP3和AtNRAMP4能调节Mn2+的平衡(Lanqua
等2010), AtNRAMP1基因超表达转基因植株能提
高其对Fe 2+毒害的抗性 (Cur ie等2000) , 而At-
NRAMP6则可能参与了Cd2+在植物细胞内的分配
和平衡(Cailliatte等2009)。在水稻中, 不同OsN-
RAMP基因参与多个金属元素的吸收和转运; 并且,
在离子吸收和转运平衡方面发挥了更为重要的作
用。
参考文献
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图4 缺Cu2+和缺Zn2+条件下水稻根和茎叶中
Fe2+、Cu2+、Zn2+和Mn2+的含量
Fig.4 Contents of Fe2+、Cu2+、Zn2+ and Mn2+ in roots and
shoots with deficiency of Cu2+ and Zn2+
植物生理学报884
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