全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (11): 1205~1211 1205
收稿 2013-08-05　　修定 2013-09-22
资助 农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室开放基金
项目(KFKT-2011-06)和国家自然科学基金(31372106)。
* 通讯作者(E-mail: kuaifanzhongxin@126.com; Tel: 0898-
23300284)。
粉菠萝组蛋白去乙酰化酶基因AfHD1的克隆及在乙烯处理下的表达分析
李丽1, 罗轩2, 徐立1,*, 李新国2
1中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所, 农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室, 海南儋州571737;
2海南大学园艺园林学院, 热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室, 海口570228
摘要: 组蛋白修饰在植物发育和防御反应中发挥着重要的作用。为研究组蛋白去乙酰化酶基因HD1的基本特征及其在乙
烯调控凤梨科植物开花过程中的生物学功能, 通过筛选粉菠萝茎尖转录组测序数据并结合RACE技术分离得到AfHD1基因
cDNA全长序列。该基因的开放阅读框长为1 548 bp, 编码516个氨基酸, 其理论分子量为58.28 kDa, 等电点为5.23。由该基
因编码的蛋白属于组蛋白去乙酰化酶RPD3/HDA1超家族成员, 具有该家族特有的HDAC保守结构域, 该蛋白与水稻和玉米
中HD1蛋白的同源性均达到87%。实时荧光定量PCR分析表明, AfHD1基因的表达受乙烯诱导, 处理后1 d的表达量与0 h相
比, 提高了4倍, 推测组蛋白去乙酰化酶基因AfHD1可能与粉菠萝的乙烯信号反应有关。
关键词: 粉菠萝; AfHD1; 乙烯处理; 开花
Cloning of Histone Deacetylase AfHD1 from Aechmea fasciata and Its Expression
Analysis under Ethylene Treatment
LI Li1, LUO Xuan2, XU Li1,*, LI Xin-Guo2
1Key Laboratory for Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources, Ministry of Agriculture, Tropical Crops Genetic Resource
Institute, Chinese Academy of Tropical Agriculture, Danzhou, Hainan 571737, China; 2Key Laboratory of Protection and Develop-
ment Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources, Ministry of Education, College of Horticulture and Landscape Architecture,
Hainan University, Haikou 570228, China
Abstract: Histone modification plays an important role in plant development and plant defense responses. In
order to investigate the characters of a histone deacetylase gene (HD1) and its biological functions in flowering
regulation by ethylene in bromeliad, the full-length of cDNAs of AfHD1 was isolated from Aechmea fasciata
by screening its shoot-tip transcriptome sequence data and a method of rapid amplification of cDNA ends
(RACE). The open reading frame of AfHD1 cDNA is 1 548 bp in length, encoding 516 amino acids with mo-
lecular weight of 58.28 kDa and isoelectric point of 5.23. The putative protein of AfHD1 is a member of the
RPD3/HDA1 superfamily and they have a conserved HDAC domain. Amino acid sequence alignment showed
that AfHD1 shared 87% identity with HD1 homologues from rice and maize. The results of quantitative real-
time PCR analysis indicated that the expression of AfHD1 could be induced by ethylene treatment and reached
the peak at 1 d after processing, with the amount 4-folds higher than that at 0 h. We hypothesized that Af-
HD1 may be involved in the ethylene response pathway in A. fasciata.
Key words: Aechmea fasciata; AfHD1; ethylene treatment; flowering
表观遗传调控主要通过改变染色质结构来调
控基因的表达, 组蛋白去乙酰化酶(histone deacety-
lases, HDACs)是维持染色质核小体组蛋白乙酰化
平衡的关键酶之一, 可与其他蛋白形成多亚基辅
助阻遏物复合体, 使组蛋白去乙酰化, 并导致染色
质发生凝集作用, 从而抑制基因的表达(Courey和
Jia 2001)。植物中现已鉴定到20个HDACs成员, 分
属于RPD3、HDA1、SIR2和HD2四个亚家族, 其
中, RPD3/HDA1是HDACs家族中最大的一个超家
族, 目前在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)
中研究比较深入的主要有 2个基因 : A t H D 1
(AtHDA19或AtRPD3A)和AtHDA6 (AtRPD3B), 它们
功能相近, 但作用机制有所不同。AtHD1主要是通
过调节组蛋白乙酰化水平发生作用, 而AtHDA6更
主要是通过RNA介导的DNA甲基化途径进行调
植物生理学报1206
控 , 并涉及外源基因、转座子以及核糖体RNA
(rRNA)的转录沉默(Murfett等2001; Kim等2012)。
AtHD1的反义抑制或T-DNA的插入失活可造成拟
南芥内源AtHD1的表达下调, 导致组蛋白H4乙酰
化累积、植株发育异常和开花延迟(Tian和Chen
2001)。在水稻中, 过量表达HD1同源基因OsH-
DAC1-3后, 组蛋白H4乙酰化程度会降低, 植株生
长加快、形态结构发生异常(Jang等2003)。HD1和
HDA6不仅在植物的生长发育过程中起着重要作
用, 还参与了植物的基本防御反应和信号转导过
程(Zhou等2005; Zhu等2011)。
凤梨科(Bromeliaceae)植物包含重要的热带水
果(如菠萝)和热带花卉, 具有很高的经济价值。在
自然条件下, 其开花时间和开花率受环境影响非
常大, 具有不确定性, 常导致产品收获期不一致,
无法集中上市, 给生产者造成巨大的经济损失, 在
实践中通常用乙烯及其衍生物调控花期以调节其
上市时间(张治礼等2012)。尽管人们采用乙烯催
花这一技术已有近百年时间, 相关研究也陆续展
开, 但迄今为止, 乙烯诱导凤梨开花的分子机理尚
不清楚。粉菠萝[Aechmea fasciata (Lindl.) Baker]
为凤梨科植物, 生长期短, 对乙烯刺激反应敏感,
是研究乙烯在凤梨科植物开花诱导中作用机理的
良好材料。本研究以粉菠萝为材料, 对参与植物
生长发育调控和信号转导的重要基因HD1进行了
同源克隆和生物信息学分析, 同时分析了该基因
在乙烯刺激下的表达规律, 为进一步了解组蛋白
去乙酰化酶基因在乙烯调控凤梨开花过程中的生
物学功能奠定基础。
材料与方法
1 植物材料
以凤梨科粉菠萝[Aechmea fasciata (Lindl.)
Baker]为试验材料, 由中国热带农业科学院热带作
物品种资源研究所快繁中心提供。
2 AfHD1基因cDNA全长克隆
用AxyPrep总RNA小量制备试剂盒提取菠萝
茎尖总RNA。根据先前在粉菠萝茎尖转录组数据
库中得到的一个与玉米(Zea mays L.) HD1高度同
源的cDNA片段序列设计引物, 通过RACE技术分
离粉菠萝中AfHD1 cDNA的全长序列, 具体方法参
照张鲲等(2011)。RACE反转录cDNA模板合成步
骤按照Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA
Amplification Kit说明书进行操作。引物合成与测
序工作均委托上海英潍捷基生物技术有限公司完
成。引物序列信息见表1。
3 生物信息学分析
将最终测序验证得到的AfHD1基因序列通过
BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行
同源比对分析和氨基酸保守性预测; 用ProtParam
软件(http://web.expasy.org/protparam/)进行编码蛋
白的理化性质的分析; 用TMHMM (http://www.
cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和PredictProtein软件
(https://www.predictprotein.org/login)进行编码蛋
白的跨膜预测和二级结构预测; 用DNAMAN对不
同物种HD1基因的氨基酸序列进行多序列比对分
析; 利用Clustal X和MEAG5.0构建HD1的系统进
化树。
表1 基因克隆及实时定量PCR所用引物
Table 1 Primers for gene cloning and real-time PCR used in the experiments
引物功能 引物名称 引物序列(5→3)
5-RACE P1: HD1-RACE5-out CTCTGGGTCGTAGAAGTAGCACA
P2: HD1-RACE5-in CGAGTAGGGCGTGGGTCA
3-RACE P3: HD1-RACE3-out ACAAGATGCCTCAGCACGAAT
P4: HD1-RACE3-in TCAAGAACGCCCTCCTGATAC
HD1全长 HD1-S ACTTCTACGACCCAGAGGTG
HD1-AS TGTAAGATAAATCGTTGTTGCT
qRT-PCR (内参基因) Actin-F GAGCAGCATGAAGATCAAGG
Actin-R CATCTGCTGGAAAGTGCTGA
qRT-PCR (AfHD1) HD1-F AAGCTGCCAGAATCCTCTGTT
HD1-R CATGTCGCGGTATTATCCCTA

李丽等: 粉菠萝组蛋白去乙酰化酶基因AfHD1的克隆及在乙烯处理下的表达分析 1207
4 乙烯诱导不同时间AfHD1基因表达分析
材料处理与PCR模板的制备: 于2012年10月,
选取生长良好、株型一致、叶龄在20叶左右的粉
菠萝, 用400 mg·L-1的乙烯利10 mL进行灌心处理,
分别于处理后的1 h、6 h、1 d和2 d倒净乙烯利溶
液并冲洗, 作为4组不同时间的处理; 以去离子水
灌心处理为对照; 处理组和对照组各设3次重复。
所有处理组和对照组均在灌心处理后的0、1、
6、24和48 h (以灌心处理开始时计时)取靠近茎尖
的4片心叶, 用去离子水洗净后立即用液氮冷冻,
后置于–80 ℃冰箱中保存备用。提取不同处理、
不同取样时间粉菠萝茎尖组织的总RNA, 纯化后
进行电泳检测, 符合质量要求的按PrimeScripe
RTTM Reagent Kit说明书合成cDNA第一链, 取适量
作为模板, 用于后续分析。
荧光定量分析: 每一cDNA模板均同时分别
采用AfHD1基因定量分析引物和粉菠萝β-Actin基
因引物(内参基因)进行扩增分析, 各设3次重复,
引物序列见表1。qRT-PCR反应液按照TaKaRa公
司的SYBR Premix EX TaqTM试剂盒使用说明配
置, 扩增条件为: 95 ℃ 1 min; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s,
40个循环。扩增完毕后, 将反应板收集的数据采
用仪器自带软件PikoReal Software2.0进行分析,
根据公式2-∆∆CT法计算AfHD1在不同处理下的表
达量。
实验结果
1 粉菠萝HD1基因全长的克隆
在粉菠萝茎尖转录组中得到一个与玉米HD1
高度同源的cDNA片段, 该片段长为1 061 bp。根
据该序列分别设计RACE-5和RACE-3的引物进行
PCR扩增, 产物经纯化回收并测序, 获得166 bp和
743 bp 2条序列(图1), 与原有序列拼接后, 得到1
755 bp的HD1完整序列。根据所拼接的全长序列
设计引物进行HD1开放阅读框区域的PCR扩增后,
电泳检测, 在预期范围获得了特异条带(图1)。经
测序后与拼接的序列进行比对, 结果完全一致, 故
最终确定了HD1的cDNA全长序列。
2 粉菠萝HD1基因生物信息学分析
2.1 阅读框和氨基酸序列分析
粉菠萝HD1基因cDNA全长为1 755 bp, 其中
开放阅读框(ORF)长1 548 bp, 共编码516个氨基
酸。通过ProtParam预测其分子量为58.28 kDa, 等
电点(pI)为5.23, 带正电荷的氨基酸56个(Arg+Lys),
带负电荷的氨基酸81个(Asp+Glu), 蛋白不稳定系
数为37.35, 是稳定蛋白。TMHMM跨膜区预测分
析表明该蛋白无跨膜区, 非膜蛋白。利用Predict-
Protein预测HD1蛋白的二级结构: α-螺旋(alpha he-
lix)占26.2%, 延伸链(extended strand)占8.3%, 环状
结构(loops)占65.5%。
2.2 保守结构域分析
通过NCBI的Conserved Domains软件分析粉
菠萝HD1蛋白表明, 其氨基端含有RPD3/HDA1超
家族蛋白中特有的HDAC结构域, 包括催化活性位
点和金属离子结合位点, 该结构域占据整个蛋白
的70%左右, 构成蛋白的主要组分(图2)。
图1 HD1基因PCR扩增电泳图
Fig.1 Results of HD1 RACE and full length PCR amplification
M: DL2000; 1: HD1-RACE-5PCR扩增; 2: HD1-RACE-3PCR扩增; 3: HD1开放阅读框序列PCR扩增。
植物生理学报1208
2.3 氨基酸同源性比较及系统进化树分析
为了了解粉菠萝AfHD1与已知的HD1基因的
同源性关系, 我们比较了它与GenBank中已发表的
HD1基因的氨基酸序列, 它们分别是单子叶植物中
水稻(Oryza sativa) OsHD1、玉米ZmHD1和二穗短
柄草(Brachypodium distachyon) BdHD1。与粉菠萝
AfHD1同源性最高的是水稻和玉米, 有87%的同源
性, 其次是二穗短柄草, 同源性为85%。这4个氨基
酸序列都含有相同的HDAC保守结构域(图3), 属
于HDACs家族中RPD3/HDA1超家族中的一员。
图3 粉菠萝、玉米、水稻和二穗短柄草HD1氨基酸序列比对
Fig.3 Alignment of the amino acid sequences of HD1-LIKE from A. fasciata, Z. mays, O. sativa and B. distachyon
方框内为HDAC保守结构域, 箭头表示区别于人类HDAC1蛋白中具重要的催化活性位点的氨基酸残基, 星号表示N-糖基化位点。
图2 Conserved Domains软件分析得到的HD1保守结构域
Fig.2 Analysis of the conserved domain of HD1 using Conserved Domains program from NCBI database
李丽等: 粉菠萝组蛋白去乙酰化酶基因AfHD1的克隆及在乙烯处理下的表达分析 1209
通过构建基因系统进化树(图4), 进一步分析
了粉菠萝中HD1与其他物种中HD1/HDA6类似基
因的遗传进化关系。结果表明, 相同物种RPD3/
HDA1超家族成员并没有聚在一起, 而是依HD1-
LIKE与HDA6-LIKE基因被明显分为两大类群。粉
菠萝HD1基因属于HD1-LIKE类群, 它与水稻(Os-
H D 1 )、二穗短柄草 ( B d H D 1 )、玉米 ( Z m H -
DA101)、小麦(Triticum aestivum hypothetical pro-
tein, TaHP)和高粱(Sorghum bicolor hypothetical
protein, SbHP)等单子叶植物亲缘关系较近, 被聚为
一类, 拟南芥(AtHD1/AtPRD3A)、芜菁(Brassica
rapa, BrHD1)、黄瓜(Cucumis sativus, CsHD1)、大
豆(Glycine max, GmHD1)和葡萄(Vitis vinifera,
VvHD1)等双子叶植物聚为另一类, 这与传统的物
种系统进化关系基本一致。
3 乙烯诱导后AfHD1基因的表达分析
通过荧光定量PCR检测了乙烯处理不同时间
和乙烯处理后不同时间AfHD1基因表达水平的变
化。结果如图5所示, 在采用乙烯利分别灌心1 h、
6 h、1 d和2 d的各处理组中, 粉菠萝AfHD1表达水
平变化趋势基本一致, 表现为: 与处理前相比(0 h),
处理后1 d内AfHD1基因的表达量持续升高, 以6
h~1 d内上升最为明显; 随后急剧下降, 除乙烯处理
6 h组, 其余3组AfHD1基因的表达量在处理后2 d恢
复到6 h时的水平, 但均显著高于0 h。图中还显示,
外源乙烯对AfHD1的诱导效应并没有随刺激时间
图4 不同植物中HD1、HDA6同源基因进化树分析
Fig.4 Phylogenetic analysis of HD1 and HDA6 homologous gene from different plants
植物生理学报1210
的延长而增强, 也没有随外源刺激的撤离而立即
解除。乙烯处理后6 h和1 d是非常重要的2个时间
点。在6 h后解除刺激, AfHD1的表达量会继续升
高, 在1 d时达到最大, 且与0 h相比提高了4倍, 为所
有处理中的最大值; 而处理1 d后, 不论外源刺激是
否解除, AfHD1的表达量都会下降。
讨　　论
植物中组蛋白去乙酰化酶RPD3/HDA1超家
族蛋白与植物发育和植物对环境的耐受力、基本
防御反应密切相关(Zhou等2005; To等2011; Kim等
2012)。HD1是RPD3/HDA1超家族的重要成员之
一, 我们基于前期实验中转录组序列数据分析, 通
过同源克隆的方法首次从粉菠萝中克隆了HD1-
LIKE基因AfHD1, 并对不同乙烯处理下该基因的
表达特性进行了初步研究。
本试验中克隆获得的组蛋白去乙酰化酶基因
AfHD1与水稻、玉米和二穗短柄草等单子叶植物
中相应基因具有很高的同源性。由AfHD1推导的
氨基酸残基序列N端具有RPD3/HDA1超家族中典
型的HDAC结构域, 该结构域在进化过程中高度保
守, 包括催化活性中心和金属离子结合中心, 可催
化组蛋白残基上乙酰化基团的去除, 抑制基因表
达; C端序列保守性较差, 通过该区域, 组蛋白去乙
酰化酶可以与许多功能蛋白(如LEUNIG蛋白)互作
形成多亚基复合物行使功能, 在此复合物中, 组蛋
白去乙酰化酶蛋白负责催化去乙酰化反应, 而其
他亚基负责将其定位到目的基因片段(Gonzalez等
2007)。拟南芥中, HDA19 (HD1)可以与转录复合
体LEUNING相互作用来对基因表达进行抑制
(Gonzalez等2007) , 而AtHDA6可以通过C端
(333~471个氨基酸残基)与FLD蛋白N端(1~168个
氨基酸残基)互作形成阻遏复合体 , 调控FLC和
MAF4基因的表达, 控制开花(Yu等2011)。
近期研究表明, 组蛋白去乙酰化酶基因HDA6
和HD1受植物激素诱导表达并参与激素的信号转
图5 乙烯处理过程中粉菠萝茎尖AfHD1基因表达变化
Fig.5 Changes of AfHD1 expression in shoot apical meristem of A. fasciata during ethylene treatment
李丽等: 粉菠萝组蛋白去乙酰化酶基因AfHD1的克隆及在乙烯处理下的表达分析 1211
导途径(Fu等2007; Chinnusamy和Zhu 2009; Zhu等
2011)。拟南芥中, HDA6可以受茉莉酸(JA)和乙烯
诱导, 而HD1则受伤害、病原菌和JA等诱导表达
(Zhou等2005)。拟南芥的HDA6-RNAi和axe1-5/
hda6突变体植株中均可观察到, 全基因组水平上
组蛋白H3发生了高度乙酰化, 同时JA响应基因如
PDF1.2、VSP2、JIN1、ERF1等表达下调, 而抑制
成花基因FLC的表达上调(Wu等2008)。由此说明,
组蛋白去乙酰化酶HDA6和HD1基因与植物激素
之间可能存在着一定的应答关系, 并在参与激素
信号转导的同时对植物花发育进程的调控也产生
了重要影响。本研究qRT-PCR检测结果显示, 外源
乙烯处理后粉菠萝AfHD1的表达明显上调, 1 d时
表达水平达到最高, 尽管随后表达量有所下降, 但
仍高于对照组及0 h, 说明该基因对乙烯刺激作出
了积极响应, 其转录水平在乙烯处理一定时间后
可能因受到反馈抑制而降低。由此推测, 在乙烯
诱导凤梨开花的过程中, 组蛋白去乙酰化酶基因
AfHD1可能担负着重要的生物学功能, 但具体的作
用机制还需要进一步研究。本实验结果可为深入
研究单子叶植物中HD1的生物学功能及组蛋白去
乙酰化酶基因在乙烯反应和凤梨开花调控中的作
用机制打下基础。
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