全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (6): 955~961　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0155 955
收稿 2015-03-19　　修定 2015-05-25
资助 国家自然科学基金(41403086、41325013和41120134004)。
* 通讯作者(E-mail: wang0628@ouc.edu.cn; Tel: 0532-66782092)。
CuO纳米颗粒对拟南芥叶片生长及生理特性的影响
徐立娜, 王震宇*, 赵建
中国海洋大学环境科学与工程学院, 山东青岛266100
摘要: 本文通过营养液培养实验, 研究CuO纳米颗粒(nanoparticles, NPs)悬浮液对拟南芥叶片生长、叶绿体活性氧产生和保
护酶活性的影响。结果表明, CuO NPs悬浮液处理96 h后, 拟南芥叶片生长受到显著抑制, 叶绿体中过氧化氢(H2O2)、羟基
自由基(OH·)和超氧阴离子(O2
–·)含量均随着NPs处理浓度的增加和时间的延长而逐渐上升; 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧
化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)及抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性和丙二醛(MDA)含量增加。这表明CuO NPs能激发
植物细胞的防御反应, 这种防御反应与CuO NPs存在时间-剂量关系。
关键词: CuO纳米颗粒; 叶片生长; 叶绿体; 氧化胁迫
Effects of CuO Nanoparticles on Growth and Physiological Characteristics in
Leaf of Arabidopsis thaliana
XU Li-Na, WANG Zhen-Yu*, ZHAO Jian
College of Environmental Science and Engineering, OceanUniversity of China, Qingdao, Shandong 266100, China
Abstract: The purpose of the present study was to estimate the influence of CuO nanoparticles (NPs) suspen-
sion on the leaf growth of Arabidopsis thaliana, reactive oxygen generation in chloroplast,and antioxidant en-
zyme activity under hydroponic conditions. The results showed that the leaf growth was significantly inhibited
exposure to CuO NPs suspension for 96 h. The contents of H2O2, OH· and O2
–· increased gradually with the in-
creasing of the time and the concentration of CuO NPs suspension, and the activities of superoxide dismutase
(SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and malonaldehyde (MDA) content in-
creased treated with CuO NPs. It was concluded that CuO NPs could excite the defensive reactions of plant
cell, which had the time- and concentration-dependent of CuO NPs exposure.
Key words: CuO nanoparticles; leaf growth; chloroplast; oxidative stress
随着纳米科技的飞速发展, 纳米材料已被广
泛应用到电子、生物医药、催化和材料等各个领
域。这些纳米产品在生产、运输和使用过程中,
其产生的人工纳米颗粒(nanoparticles, NPs)难免会
通过各种途径进入到大气、水体和土壤中, 而NPs
本身所具有的独特的电学性能、化学性能、光学
性能和力学性能等会给生态环境带来潜在的风险
(Sánchez等2011; 杨玉芬和陈清如2002)。目前, 在
生态环境保护领域, 人工合成NPs已经被认为是一
种潜在的新型污染物, 越来越多的研究开始关注
NPs的生态毒性效应。至今已有大量文献研究表
明, NPs对无脊椎动物(Bouwmeester等2011)、细菌
(Liu等2011)、藻类(Yang等2010)、鱼类(Zhao等
2011)和高等植物(Zhou等2011; Asli和Neumann
2009)均能产生毒性效应。
同其他NPs一样, 由于材料、化学和生物科学
等领域对CuO NPs的应用, 环境中已存在浓度较低
的CuO NPs。然而, 一旦被生物体吸收后, CuO
NPs就会积累在生物体中, 最终产生显著的毒性效
应(Wang等2012b)。植物作为生态系统中的初级
生产者, 对食物链的传递及整个生态系统的稳定
起着非常重要的作用。已有报道研究NPs在植物
体的吸收和转运(Wang等2013), 对植物种子萌发
(Lin等2007)、幼苗生长(Song等2013)的影响。叶
绿体作为绿色植物的“养料制造工厂”和“能量转换
站”, 对植物生长起到至关重要的作用, 同时叶绿体
的光合电子传递链也是植物体产生氧化胁迫的主
要位点。而目前对NPs影响植物叶绿体的特点及
其作用机制了解不多。本文探究CuO NPs处理对
拟南芥叶片生长及叶绿体抗氧化系统的影响, 拟
植物生理学报956
揭示拟南芥对CuO NPs胁迫的生理响应机制, 为纳
米材料安全、科学、有效的利用以及生态安全评
价提供重要的理论依据。
材料与方法
1 实验材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)种子(Col-0)由
河北农业大学惠赠。
CuO (nanoparticles, NPs, 10 nm)购于北京纳辰
科技发展有限责任公司, 纯度为99.9%。为比较纳
米级颗粒物与大颗粒物的生态效应的差别, 实验
设置微米级CuO颗粒(bulk particles, BPs, 1.5 µm)进
行粒径效应比较。由于CuO NPs悬浮液会释放
Cu2+, 而高浓度的Cu2+也会对生物体存在一定的毒
性效应, 因此, 选用CuSO4优级纯试剂配置成溶液,
作为离子效应对比, 以明确CuO NPs对植物的生态
效应来源于NPs本身还是NPs所释放的离子。
2 材料表征和离子释放
秤取0.05 g的NPs及BPs颗粒于三角瓶中, 加入
100 mL去离子水, 超声(100 W, 40 kHz) 30 min, 制
成悬浮液, 用镍网蘸取少量分散好的CuO NPs和
CuO BPs悬浮液自然风干, 用投射电镜(TEM, JEM-
2100, JEOL, Japan)观察CuO颗粒的形态及粒径。
将50 mg·L-1的CuO NPs悬浮液静置0、24、
48、96、120、144和168 h后, 将CuO NPs悬浮液
高速离心30 min (10 000 r·min-1)后, 用0.22 μm混合
纤维膜过滤, 滤液用石墨炉原子吸收测定滤液中
释放的铜离子含量。
3 实验处理
选取籽粒饱满、大小均匀的拟南芥种子于8%
NaClO (95%乙醇配制)中浸泡5 min后, 用无水乙醇
反复清洗至无白色沉淀。将消毒后的种子置于超
净台上吹干后, 直接播种于1/2MS培养基中, 用封口
膜密封, 竖直立于光照培养箱中培养(光照14 h/黑暗
10 h, 光照强度约为75 μmol·m-2·s-1, 温度24 ℃/ 22 ℃)。
待长至4片真叶且完全展开时, 将发芽幼苗移至1/4
双子叶营养液中缓苗 , 完全营养液的组成为 :
K2SO4 0.75mmol·L
-1、Ca (NO3)2 2.0 mmol·L
-1、
KCl 0.1 mmol·L-1、KH2PO4 0.25 mmol·L
-1、
MgSO4·7H2O 0.65 mmol·L
-1、H3BO3 1.0×10
-3
mmol·L-1、MnSO4·H2O 1.0×10
-3 mmol·L-1、
ZnSO4·7H2O 1.0×10
-3 mmol·L-1、CuSO4·5H2O 1×10
-4
mmol·L-1、(NH4)6Mo7O24 5×10
-6 mmol·L-1和Fe-EDTA
0.1 mmol·L-1。缓苗3 d后, 选取生长一致的幼苗移
至去离子水中, 加入不同处理[20和50 mg·L-1 CuO
NPs (20 NPs、50 NPs)、0.15 mg·L-1 Cu2+ (0.15 Cu2+)、
50 mg·L-1 CuO BPs (50 BPs)], 正常生长的植物为
对照。随机排列, 重复3次。培养温度为23~25 ℃/
18~20 ℃ (白天/夜晚), 相对湿度为60%~70%, 每天
光照12 h, 光照强度200 μmol·m-2·s-1, 用曝气泵持续
曝气。处理0、12、24、48和96 h时分别取样, 测
定各指标。
4 测定指标及方法
叶片鲜重、干重采用称重法, 每个处理96 h选
取20株植物叶片, 用十万分之一电子天平(Mettler
Toledo, 上海)称其鲜重和干重, 计算叶片含水量。
叶面积用根系扫描仪(EPSON 1000X, USA)进行分
析。根据Lambert-Beer定律, 利用对应波长下的吸
光系数计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量。叶
绿体的提取采用差速离心法, 选取1 g的植物鲜叶,
匀浆后过滤, 滤液在1 000 r·min-1下离心4 min, 弃
去沉淀, 上清液在3 000 r·min-1下离心3 min, 最终
弃去上清液 , 所得沉淀即为叶绿体。过氧化氢
(H2O2)与钼酸相互作用生成一种黄色的络合物, 在
405 nm波长下测定其生成量即可计算H2O2的量。
羟自由基(OH·)的测定利用芬顿(Fenton)反应, 用
Griess试剂显色生成的红色物质, 其颜色深浅与
OH·量成正比。超氧阴离子自由基(O2¯· )的测定模
拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统, 产生
O2¯·, 加入电子传递物质及Gress氏显色剂进行测
定。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)
的测定采用氮蓝四唑(nitrobluetetrazolium, NBT)光
化还原法。过氧化物酶(peroxidase, POD)的测定采
用愈创木酚比色法。过氧化氢酶(catalase, CAT)的
测定采用高锰酸钾滴定法。抗坏血酸过氧化物酶
(ascorbate peroxidase, APX)的测定以抗坏血酸的氧
化量来表示。丙二醛(malondialdehyde, MDA)的测
定采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法。
5 统计分析
实验数据统计分析采用SPSS 12.0软件, 用
ANOVA (analysis of variance, LSD检验法)进行方
差分析。
徐立娜等: CuO纳米颗粒对拟南芥叶片生长及生理特性的影响 957
实验结果
1 CuO NPs和CuO BPs表征
对50 mg·L-1 CuO NPs和CuO BPs悬浮液进行
透射电镜观察发现, CuO NPs呈椭圆形或圆形, 在
去离子水中会发生团聚, 粒径主要分散在20~40
nm之间(图1-A), 大于商家提供的数据(10 nm)。
CuO BPs呈现片状, 粒径大小与商家提供的1.5 µm
基本相符(图1-B)。
图1 CuO NPs和CuO BPs透射电镜观察图
Fig.1 TEM micrographs of CuO NPs and CuO BPs
A: CuO NPs; B: CuO BPs。
CuO NPs暴露144 h后, 铜离子浓度约为0.1
mg·L-1, 释放已基本达到平衡(图2)。为了更好的
明确Cu 2+的效应 , 本文设置的Cu 2+浓度为0.15
mg·L-1, 高于NPs释放的Cu2+的平衡浓度, 符合现实
要求。
2 CuONPs对拟南芥叶片生长的影响
随着CuO NPs浓度的增加, 拟南芥叶片鲜重、
干重、含水量、叶面积和叶绿素a/b值降低, 胡萝卜
素/叶绿素值虽没有明显变化, 但与对照相比显著性
增高(表1)。然而, Cu2+处理下, 拟南芥叶片鲜重、干
重、叶片含水量和胡萝卜素/叶绿素值与对照相比
无显著性变化, 叶面积和叶绿素a/b值显著低于对照,
但与20 mg·L-1 CuO NPs相比无显著变化。CuO BPs处
理对拟南芥叶片生长各指标没有显著性影响。
3 CuO NPs对拟南芥叶绿体活性氧的影响
从图3来看, 拟南芥叶绿体内H2O2含量随着
CuO NPs处理时间的延长而逐渐增高。50 mg·L-1
CuO NPs处理96 h时, H2O2的含量是未处理的1.76
倍, 差异显著(P<0.05)。OH·含量变化趋势与H2O2
的大致相同, CuO NPs处理的OH·含量升高, 并明
显高于CuSO4和CuO BPs处理。50 mg·L
-1 CuO NPs
处理96 h的OH·含量最高, 是未处理的5.82倍, 是
Cu2+处理96 h的2.0倍。O2¯·含量随CuO NPs处理时
间和浓度的增加而逐渐增加, 50 mg·L-1 CuO NPs
处理96 h的O2¯·含量要显著高于其他处理96 h。
CuSO4处理和CuO BPs处理对拟南芥叶绿体中氧自
由基影响不明显(图3)。
图2 CuO NPs释放铜离子浓度
Fig.2 Concentration of Cu2+ released from CuO NPs
植物生理学报958
表1 CuO NPs对拟南芥叶片生长的影响
Table 1 Influences of CuO NPs on the leaf growth of Arabidopsis
处理 鲜重/mg 干重/mg 叶片含水量/g·g-1 (FW) 叶面积/cm2 叶绿素a/b 胡萝卜素/叶绿素
对照 28.68±0.73a 2.17±0.06a 0.92±0.01a 4.36±0.06a 3.46±0.26a 0.15±0.02a
20 mg·L-1 CuO NPs 22.13±1.13b 1.93±0.01a 0.91±0.02a 3.14±0.09b 3.07±0.19b 0.18±0.01b
50 mg·L-1 CuO NPs 15.75±1.14b 1.64±0.02b 0.89±0.01b 2.19±0.11c 2.68±0.52c 0.18±0.02b
0.15 mg·L-1 Cu2+ 25.57±1.01a 2.15±0.02a 0.92±0.03a 3.39±0.14b 3.10±0.31b 0.17±0.01ab
50 mg·L-1 CuO BPs 26.41±0.55a 2.07±0.03a 0.92±0.02a 4.39±0.14a 3.46±0.44a 0.16±0.03a
　　表中数据为平均值±标准差, 同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
图3 CuO NPs处理对拟南芥叶片叶绿体中H2O2、OH·和O2¯·含量的影响
Fig.3 Influences of CuO NPs on H2O2, OH· and O2¯· contents in leaf chloroplast of Arabidopsis
4 CuO NPs对拟南芥叶绿体抗氧化酶的影响
图4显示, 随着50 mg·L-1 CuO NPs处理时间的
延长, 叶绿体中的SOD活性出现先增强后减弱的趋
势。处理48 h时, SOD活性达到最大值, 分别是处理
0、12、24和96 h的1.75、1.62、1.34和1.12倍; 处理
96 h的SOD活性则有显著性降低。CuSO4处理的
SOD活性增加量要低于NPs处理下SOD的活性。
POD活性随着CuO NPs处理时间的延长而逐
渐增高, 且CuO NPs浓度越高, POD活性越强。处
理96 h, 50 mg·L-1 CuO NPs处理的POD活性分别是
20 mg·L-1 CuO NPs、Cu2+和CuO BPs处理的1.34、
1.82和2.22倍。
CuO NPs处理下拟南芥叶绿体中CAT活性在
24 h内逐渐升高。处理24 h时, CAT活性与未处理相
徐立娜等: CuO纳米颗粒对拟南芥叶片生长及生理特性的影响 959
比, 增加了12%; 随后 CAT活性开始降低; 处理96 h,
CAT活性达到最低值。
CuO NPs和Cu2+处理下, APX活性均表现出随
着处理时间的延长而逐渐增加。其中, 以50 mg·L-1
CuO NPs处理的APX活性增加最明显。50 mg·L-1
CuO NPs持续处理96 h时, APX活性达到最高, 是未
处理的2.9倍, 差异显著。CuO BPs处理对拟南芥抗
氧化系统没有明显的影响。
5 CuO NPs对丙二醛含量的影响
CuO NPs和CuSO4处理的MDA含量均随处理
时间的延长而逐渐升高 (图5)。NPs浓度越高 ,
MDA含量越高。50 mg·L-1 CuO NPs处理96 h的
MDA含量最高, 是未处理的1.37倍。
6 CuO NPs处理下拟南芥各指标的相关性分析
选取CuO NPs胁迫处理最长时间(96 h), 拟南
芥叶面积与各生理生化指标进行相关性分析。结
果(表2)发现, CuO NPs处理下, 叶面积与叶片含水
量和叶绿素a/b呈显著性正相关(P<0.05); 与H2O2含
量、SOD活性、POD活性和MDA含量呈显著性负
相关; 与APX活性呈极显著负相关(P<0.01); 与其
他指标(OH·含量、O2¯·含量、CAT活性和类胡萝卜
图4 CuO NPs处理对拟南芥叶片叶绿体中SOD、POD、CAT和APX活性的影响
Fig.4 Influences of CuO NPs on SOD, POD, CAT and APX activities in leaf chloroplast of Arabidopsis
图5 CuO NPs处理对拟南芥叶绿体中MDA含量的影响
Fig.5 Influences of CuO NPs on MDA content
in leaf chloroplast of Arabidopsis
植物生理学报960
素/叶绿素)呈负相关, 但相关程度不显著。
讨　　论
随着CuO NPs浓度的增加, 拟南芥叶片生长受
到明显的抑制。这与Lee等 (2010)报道的ZnO
NPs、SiO NPs和Fe3O4 NPs抑制拟南芥叶片生长的
结果一致。CuO NPs处理导致拟南芥叶绿体a/b值
降低, 说明类囊体垛叠的程度降低, 类囊体膜的稳
定性变差, 光能在光系统I和光系统II之间的分配
受到影响, 光合作用降低(Saison等2010)。Shi等
(2011)研究CuO NPs对浮萍的毒性效应中也发现,
1.0 mg·L-1 CuO NPs暴露能够导致浮萍叶绿素含量
显著性降低, 光合作用受影响。类胡萝卜素除了
在光合作用中具有一定的功能外, 它也是一种内
源的抗氧化剂, 在叶绿体细胞中还可以吸收剩余
的能量 , 淬灭活性氧 , 从而防止膜酯的过氧化
(Zhang等2011; 张中伟等2008)。CuO NPs处理48 h,
类胡萝卜素/叶绿素值达到最高, 之后逐渐降低, 说
明拟南芥不能耐受CuO NPs长时间的胁迫。
NPs的表面活性较强, 它们可以在吸收能量或
者干扰电子传递链时产生活性氧(Dimkpa等2012)。
氧化胁迫是纳米颗粒毒性效应的致毒机制之一。
王震宇等(2010a)的研究发现TiO2 NPs能够显著增
强玉米幼苗抗氧化酶系统的活性。对于植物来说,
叶绿体是光合作用的主要场所, 也是产生活性氧
的主要部位, 在光合电子传递过程中, 一旦发生电
子泄漏, 就会产生H2O2、OH·和O2¯·的积累(陈花等
2008; Pisciotta等2011)。CuO NPs处理下, 3种氧自
由基的积累量随着处理时间的延长而逐渐增高,
导致叶绿体中产生氧化胁迫。此时, 叶绿体中的
防御机制启动, SOD作为清除O2¯·自由基的专性抗
氧化酶, 当细胞中O2¯·含量增加时, 会激发SOD的活
性 , 增加SOD合成的基因组的表达 (蒋时姣等
2015)。CuO NPs 处理下, SOD活性迅速增强, 加快
清除体内过量产生的O2¯·, 从而减轻自由基的毒害
效应; 随着反应的进行和毒性效应的加重, SOD活
性逐渐降低, 歧化O2¯·的能力也随之降低, 相应的,
O2¯·含量开始大量的增加。POD和CAT能够清除过
量的H2O2, 防止膜脂质过氧化作用。不同浓度CuO
NPs处理, POD的活性均大量增加, 以保护机体减
少活性氧物质的伤害。CAT具有较高的酶活速率,
CuO NPs暴露24 h时, CAT活性便出现增强, 说明其
清除H2O2的能力增强, 但随着胁迫的加剧, CAT活
性出现降低的趋势。APX对H2O2具有较高的亲和
性 , 是叶绿体中参与抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-
GSH)循环的重要酶类(Arora等2002), CuO NPs处
理诱导APX活性显著增加, 分解H2O2, 减轻H2O2的
毒害效应。
细胞膜系统是氧化损伤发生后最先受到袭击
的对象, 会发生脂质的过氧化或者脱脂化, 导致膜
通透性增强, 细胞内离子渗漏, 引起细胞损伤或凋
亡(辛慧慧等2014)。MDA是植物体内氧化应激的
标志物, 是膜脂过氧化作用的最终产物。拟南芥
叶绿体MDA含量随着NPs处理时间的延长而逐渐
增加, 说明叶绿体膜脂发生过氧化, 膜系统受到损
伤。这一结果与Wang等(2012a)的研究结果一致,
纳米颗粒能够引起细胞生物膜脂的过氧化。
由于CuO NPs会释放出铜离子, 而过高的铜离
子浓度也可能是造成植物毒性的不可忽略的因素
(Maksymiec 1997)。本研究结果发现, Cu2+和CuO
BPs对拟南芥的毒性效应不明显。由此说明, CuO
NPs对植物的毒性效应要远大于CuO BPs, 且CuO
NPs释放的Cu2+对植物没有显著的抑制效应, CuO
NPs对植物的抑制效应来自于纳米颗粒自身的特
性。目前, 大量关于纳米颗粒生态效应的研究结
果将其毒性效应归结于纳米毒性, 而非离子毒性
表2 叶面积与各生理生化指标之间的相关性分析
Table 2 Correlation analysis between leaf area and physiological indexes
叶面积 叶片含水量 叶绿素a/b 类胡萝卜素/叶绿素 H2O2含量 OH·含量
叶面积 1.0 0.798* 0.794* –0.481 –0.772* –0.359
O2
–·含量 SOD活性 POD活性 CAT活性 APX活性 MDA含量
叶面积 –0.605 –0.758* –0.739* –0.422 –0.882** –0.722*
　　*: P<0.05; **: P<0.01。
徐立娜等: CuO纳米颗粒对拟南芥叶片生长及生理特性的影响 961
(Dietz和Herth 2011; El-Temsah和Joner 2012)。本
研究对纳米颗粒的植物毒性效应进行了初步的研
究, 发现CuO NPs能够抑制拟南芥叶片的生长, 并
对叶绿体抗氧化系统具有一定的毒性效应。但影
响纳米颗粒的毒性效应是多方面的, 例如纳米颗
粒的种类、粒径、化学组成、表面电荷、晶格结构
等(王震宇等2010b), 受试植物种类、纳米颗粒暴
露浓度、暴露时间和暴露方式也是影响其毒性研
究的原因(Remédios等2012), 因此, 不同环境下, 不
同纳米材料的生态毒性效应还有待进一步研究。
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