全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月 699
收稿 2009-03-18 修定 　2009-06-19
资助 国家自然科学基金( 3 0 8 0 0 0 5 4 )、辽宁省教育厅基金
(2008656)、植物生理与生物化学国家重点实验室开放
课题(PPB080 02 )和沈阳农业大学青年基金(2 00 7)。
* 通讯作者(E-mail: wangwangche@163.com; Tel: 024-
8 8 4 8 7 1 6 3 )。
一种改进的观察植物细胞微管的免疫荧光染色方法
汪澈 *, 张立军, 李楠
沈阳农业大学生物科学技术学院, 沈阳 110161
An Improved Immunofluorescence Microscopy for Observing Microtubule Cy-
toskeleton in Plant Cells
WANG Che*, ZHANG Li-Jun, LI Nan
College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China
提要: 植物微管体积小, 而且始终处于动态变化之中, 因此观察到清晰的微管形态有一定的难度。本文以拟南芥为实验材
料, 介绍了一种改进的植物细胞微管免疫荧光染色方法, 用此方法可以观察到清晰、完整的植物微管形态, 此法对其他植
物细胞微管观察可能也有借鉴和参考价值。
关键词: 微管; 免疫荧光染色; 拟南芥
植物微管是通过调节自身的聚合和解聚的动
态变化来行使其功能的, 所以准确观察到植物细胞
内微管的形态已成为研究微管及其生物学功能的一
个关键和必备的技术。但由于微管体积小, 并且始
终处于动态变化之中, 因而观察到清晰而又完整的
微管形态已成为这一领域中的一个难题。本文以
拟南芥为实验材料, 介绍一种改进的观察植物细胞
微管免疫荧光染色方法, 此法通过改进固定和酶解
过程以及增加去除非特异性荧光的步骤, 可以观察
背景清晰和状态完整的微管, 且对其他植物细胞微
管的观察可能也有一定的借鉴意义和参考价值。
材料与方法
1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)种子清洗消毒
后播种于 MS 培养基上。在 4 ℃下, 春化 3 d 后,
放置于光照培养箱进行培养。生长的光暗周期为
16 h (光照)/8 h (黑暗), 培养温度为(23±0.5) ℃, 光
照强度为 80~100 μmol·m-2·s-1, 相对湿度为 70%。
待幼苗长出 5 d 后, 取根作为观察的实验材料。
2 化学试剂
纤维素酶、果胶酶和 β- 微管蛋白一抗(马抗
小鼠)均购自 Sigma 公司(Missouri, USA); FITC (异
硫氰酸荧光素)标记的二抗购自Molecular Probes公
司(California, USA)。
3 实验仪器
Carl Zeiss LSM META 510激光扫描共聚焦显
微镜 。
4 方法
(1 )材料放入 PE MT 缓冲液(5 0 mmol ·L- 1
PIPES、1 mmol·L-1 EGTA、1 mmol·L-1 MgCl2 和
0.05% TritonX-100)配制的固定液(1.5% 多聚甲醛
和 0.5%戊二醛)中, 固定 1 h; (2)用PEMT缓冲液洗
固定液, 冲洗 3 次, 每次 10 min; (3)用 PEM 缓冲液
(50 mmol·L-1 PIPES、1 mmol·L-1 EGTA 和 1
mmol·L-1 MgCl2)配制酶液(1% 纤维素酶、0.5%果胶
酶和0.4 mol·L-1甘露醇), 室温下植物材料放入酶液
中, 酶解 1 h; (4)用 PEM 缓冲液洗酶液, 冲洗 3 次,
每次 10 min; (5)植物材料放入-20 ℃的甲醇溶液
中, 室温下放置 5 min; (6)用 PBS缓冲液(137 mmol·L-1
NaCl、2.7 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 Na2HPO4·
12H2O 和 2 mmol·L-1 KHPO4)洗甲醇, 冲洗 1 次, 10
min; (7)用 PBS 溶解的NaBH4 (1 mg·mL-1)处理植物
材料 20 min; (8)加 β- 微管蛋白(β-tubulin)一抗, 浓
度为 1:150, 4 ℃过夜; (9)用 PBS 缓冲液洗一抗, 冲
洗 3次, 每次10 min; (10)加入FITC标记的二抗, 工
作浓度1:400, 37 ℃, 黑暗下放置2 h; (11)用PBS缓
冲液洗二抗, 冲洗 3 次, 每次 10 min; (12)加抗荧光
淬灭剂后封片; (13)用激光扫描共聚焦显微镜观
察、采集图像。激发波长为 488 nm, 发射波长为
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505~530 nm, 以40倍油镜(Plan-APOCHROMAT, NA
1.3)观察。图像存储为 1 024×1 024 像素类型,
ZOOM 设为 1.0, 扫描所用的激发光强度为 26%。
结果与讨论
拟南芥是广泛应用于植物生物学及其相关领
域研究的模式植物。在微管骨架的形态观察研究
中, 拟南芥根的结构简单, 叶绿素含量少, 因此已成
为观察微管形态的理想材料(Dolan等1993; Furutani
等 2000; Wang等 2007), 并被广泛使用(Furutani 等
2000; Hussey等 2003; NaKajima 等 2004; Wang 等
2007)。免疫荧光染色方法是目前观察微管形态的
最好方法之一(Yuan 等 1994; Furutani 等 2000;
Mineyuki 2007; 张少斌等 2009)。我们通过长时间
的摸索和试验, 总结出一套适合于观察拟南芥根细
胞微管形态的免疫荧光染色方法。此法可以看到
清晰而完整的微管形态(图 1)。图 1-a 为不加一抗
的对照, 没有微管被染色, 无法观察到微管形态。
图 1-b 为拟南芥根伸长区部位的细胞, 这部位的细
胞生长速度快, 清晰地显示出微管呈横向排列。图
1-c 为拟南芥邻近根成熟区部位的细胞, 这些根细
胞生长缓慢或者停止生长, 微管为斜向或纵向排
列。为获得清楚、完整的微管图像, 我们作出的
改进步骤和内容概述如下。
图 1 拟南芥根细胞的微管形态
a: 不加一抗的对照; b: 伸长区根细胞; c: 邻近成熟区根细胞。
1 固定过程的改进
多聚甲醛的渗透性强, 对组织的作用均匀, 所
以能够快速地固定完整的组织形态。在免疫荧光
染色中通常采用多聚甲醛为固定液的成分。但由
于微管结构细微, 所以在固定过程中保持良好的微
管超微结构是非常关键的。戊二醛穿透性强, 对微
细结构的保存效果好, 有利于观察微管的微小结
构。所以我们在原有的固定液基础上加入合适比
例的戊二醛, 改良的固定液可以充分地进入细胞中,
保持细胞中微管结构的完整性, 减少由于部分微管
未被得到固定而对观察结果的全面性和真实性产生
影响。此外, 我们在配固定液和洗固定液的步骤
中, 用PEMT缓冲液代替PEM缓冲液, 两者之间的
区别是 P E M T 缓冲液中加入了非离子去垢剂
TritonX-100, 这样可以有效地去除非细胞骨架蛋白
和可溶性脂质成分。如图 2所示, 原有的方法染色
后, 细胞内的微管数量较少, 有些微管形态不连续,
出现断裂现象, 微管的完整性受到影响(图 2-b); 而
改进的方法则能够得到完整而清晰的微管图像(图
2- a )。
2 酶解过程的改进
酶解是免疫荧光染色方法中最关键的步骤之
一。如果酶解不够充分, 则微管的抗体就无法进入
细胞内, 最终无法观察到微管的形态。如果酶解过
分, 则会破坏细胞形态, 从而破坏微管形态(图2-c),
导致观察到错误结果。我们经过反复的摸索和不
断尝试, 发现以1%纤维素酶加0.5%果胶酶的比例
最适用于拟南芥 5~10 d 的根细胞观察。既能够充
分酶解细胞壁, 又没有破坏细胞形态, 如同时加入
0.4 mol·L-1 甘露醇, 则酶解溶液的渗透势与细胞内
的渗透势相近, 有利于酶解后的细胞形态完整性的
保持(图 2-a)。
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3 非特异性荧光的去除
如果要得到清楚的微管图像, 就必须尽可能地
去除非特异性荧光的干扰。尤其是对微管这种微
小结构, 即使是较弱的非特异性荧光信号也会导致
图像模糊, 影响观察结果。因此, 非特异性荧光的
去除是得到清晰和优质的微管形态图像的关键步
骤。非特异性荧光主要有植物本身的自发荧光和
醛类物质的诱导荧光。植物细胞中自发荧光主要
是来自于细胞中叶绿体的自发荧光, 由于叶绿体自
发荧光的波长与微管抗体的波长相似, 因此在采集
图像的时候, 会收集到叶绿体发出的荧光, 从而可
以干扰图像的清晰程度, 致使图像模糊。我们采用
增加甲醇处理的步骤可以有效地去除植物细胞叶绿
体的自发荧光。此外, 我们增加NaBH4处理的步骤
可有效地去除醛类物质引发出的荧光。如图 2 所
示, 未经过去除非特异性荧光步骤染色后, 微管图
像模糊(图 2-d)。
参考文献
张少斌, 刘曦, 张立军, 汪澈, 洪丽华(2009). 植物微管结合蛋白.
植物生理学通讯, 45 (3): 291~298
Dolan L, Janmaat K, Willemsen V, Linstead P, Poethig S, Roberts
K, Scheres B (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis
thaliana root. Development, 119: 71~84
Furutani I, Watanabe Y, Prieto R, Masukawa M, Suzuki K, Naoi
K, Thitamadee S, Shikanai T, Hashimoto T (2000). The
SPIRAL genes are required for directional control of cell
elongation in Arabidopsis thaliana. Development, 127:
4443~4453
Sugimoto K, Himmelspach R, Williamason RE, Wasteneys GO
(2003). Mutation or drug-dependent microtubule disruption
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crofibril deposition in Arabidopsis root cells. Plant Cell, 15:
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Mineyuki Y (2007). Plant microtubule studies: past and present.
J Plant Res, 120: 45~51
NaKajima K, Furutani I, Tachimoto H, Matsubara H, Hashimoto
T (2004). SPIRAL1 encodes a plant-specific microtubule-
localized protein required for direction control of rapidly
expanding Arabidopsis cells. Plant Cell, 16: 1178~1190
Wang C, Li JJ, Yuan M (2007). Salt tolerance requires cortical
microtubule reorganization in Arabidopsis. Plant Cell Physiol,
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Yuan M, Shaw PJ, Warn RM, Lloyd CW (1994). Dynamic reori-
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longitudinal, in living plant cells. Proc Natl Acad Sci USA,
91: 6050~6053
图 2 改进方法与原有方法染色后微管图像的比较
a: 改进固定和酶解过程以及增加去除非特异性荧光的步骤, 微管清晰和完整; b: 未改进固定过程, 微管数量少, 有些微管形态不连
续; c: 未改进酶解过程, 酶解过分, 微管形态受到破坏; d: 未增加去除非特异性荧光的步骤, 图像模糊。