全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (7): 1039~1044　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0192 1039
收稿 2014-04-22　　修定 2014-05-19
资助 四川省育种攻关项目(2011NA0098-10)。
* 通讯作者(E-mail: w-xue@qq.com; Tel: 0835-2882335)。
柳杉种子无菌苗组培快繁体系的建立
蒋时姣1,2, 钟宇1, 张帆3, 刘海鹰1, 张双1,2, 吴富雨1,2, 黄金亮1,2, 许淑芬1,2, 万雪琴1,*
1四川农业大学林学院, 四川雅安625014; 2四川真美林业科技有限公司, 成都610000; 3四川农业大学风景园林学院, 成都
610000
摘要: 以柳杉种子在无菌条件下萌发的幼苗为外植体, 研究3种基本培养基和3种植物生长调节剂对不定芽诱导、增殖及生
根的影响, 建立了完整的组培快繁体系。结果表明, 柳杉种子经预处理后, 用75%酒精消毒20 s, 再用0.1% HgCl2浸泡600 s
的消毒效果较好, 污染率为10.00%, 成活率为82.33%; 丛生芽诱导的最适培养基配方为DCR+6-BA 0.2 mg·L-1, 诱导率较高,
达66.67%; 丛生芽增殖的最适培养基配方为DCR+6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1, 增殖倍数达到11.00; 适宜的生根培养基
为DCR+NAA 0.01 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1, 生根率为90.00%, 平均生根数为4.09。
关键词: 柳杉; 种子; 组织培养; 无性繁殖; 丛生芽
Establishment of Rapid Propagation for Sterile Seedlings of Cryptomeria fortunei
by Tissue Culture
JIANG Shi-Jiao1,2, ZHONG Yu1, ZHANG Fan3, LIU Hai-Ying1, ZHANG Shuang1,2, WU Fu-Yu1,2, HUANG Jin-Liang1,2, XU Shu-
Fen1,2, WAN Xue-Qin1,*
1College of Forest Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China; 2Sichuan Green Great Tree Technology,
Chengdu 610000, China; 3College of Landscape Science, Sichuan Agricultural University, Chengdu 610000, China
Abstract: The seedlings sprouted from Cryptomeria fortunei’s seeds under sterile conditions acted as explants.
The effects of 3 types of basic mediums and plant growth regulators on buds induction, multiplication and root
formation were studied and the rapid propagation technique by tissue culture was established. The results
showed that rapid immersed with 75% alcohol for 20 s plus 0.1% HgCl2 for 600 s was the best disinfection
method for C. fortunei’s seeds after pretreatment with the contamination rate of 10.00% and the survival rate
was 82.33%; the best medium for the buds induction was DCR+6-BA 0.2 mg·L-1 with the induction rate of up
to 66.67%; DCR+6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1 was the most suitable for buds multiplication while value
ratio reaches 11.00. The optimum for rooting which rooting rate achieved 90.00% was DCR+NAA 0.01
mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1 and the average number of roots was 4.09.
Key words: Cryptomeria fortunei; seeds; tissue culture; asexual propagation; buds
柳杉别名孔雀杉, 是杉科柳杉属常绿乔木, 为
我国特有。柳杉生长迅速, 树形优美, 适应性强,
是南方地区主要的用材及园林树种之一, 在木材
生产和生态环境建设中发挥着重要作用(阮兴盛
2004)。柳杉可通过播种(刘正忠2004; 陈瑞杰
2010)、扦插(蔡燕康和陈观岩2004)、嫁接(翁怀峰
2012)和组织培养(张翠萍等2008)进行繁殖, 目前
生产上使用的几乎都是实生苗木。柳杉实生繁殖
存在以下5个主要问题: (1)良种基地少, 良种总量
不足; (2)良种单位面积产量低且不稳定; (3)树体高
大, 种子园采种十分危险; (4)种子园的遗传增益通
常较无性系低; (5)实生后代存在遗传分化, 林相整
齐度不如无性系林分。无性繁殖虽能有效解决上
述问题, 但因一直未受到足够的重视, 致使对柳杉
扦插和组培育苗的研究很少, 且进展缓慢, 无法在
生产上推广应用。组织培养既是一种高效的无性
繁殖技术, 也是一种种质创新和良种培育技术。
一方面, 其繁殖系数高, 受外界环境影响少, 可实
现工厂化育苗, 进行周年生产, 苗木产量高。另一
方面, 其与基因工程、花药培养和原生质融合等
其他生物技术结合, 在种质资源创新和品种选育
中的作用日益突出。因此, 加强柳杉组织培养技
植物生理学报1040
术研究, 对促进我国柳杉无性系育种和人工林产
业的健康快速发展具有重要意义。
材料与方法
1 材料
柳杉(Cryptomeria fortunei Hooibrenk)种子采
自四川省洪雅林场国家杉木柳杉良种基地中的柳
杉第一代无性系种子园的优良无性系单株。
2 方法
2.1 种子灭菌和无菌苗的获得
(1)种子灭菌试验设计: 采用两因素三水平完
全随机试验设计, 设置75%酒精(处理时间10、
20、30 s)、0.1% HgCl2 (处理时间480、600、720
s)各3个水平, 共9个处理。每个处理接10根试管,
每试管接种1粒种子, 重复3次。接种14 d后调查污
染率与成活率。
(2)无菌苗培育: 选取饱满健康的成熟种子, 用
0.3% (W/V) KMnO4溶液浸泡2 h, 再用始温为45 ℃
的水浸泡24 h, 使其吸水膨胀。取出种子置于烧杯
中, 流水下冲洗5 h后放入超净工作台上已灭菌的
小瓶中, 按上述试验设计处理灭菌, 无菌水冲洗7
次 , 用无菌滤纸吸干表面水分后 , 接种于仅含7
g·L-1琼脂和30 mg·L-1蔗糖的培养基上。
2.2 丛生芽的诱导
种子经过消毒处理后萌发出的幼苗为无菌种
子苗, 选取长势良好且一致的无菌苗接入丛生芽
诱导培养基。诱导试验采用两因素三水平完全随
机试验设计, 设置基本培养基(含琼脂7 g·L-1, 蔗糖
30 mg·L-1的MS、WPM、DCR, pH 5.4)、6-BA
(0.2、0.5、0.8 mg·L-1)各3个水平, 共9个处理。每
个处理接10根试管, 每试管接种1个外植体, 重复3
次。在超净工作台上, 剪取长度为1 cm生长状况一
致较好的无菌种子苗, 接入培养基, 培养50 d后调
查诱导率。
2.3 丛生芽的增殖
继代培养基在诱导培养基的基础上进行改进,
采用两因素三水平完全随机试验设计, 以DCR为
基本培养基(琼脂7 g·L-1, 蔗糖30 mg·L-1, pH 5.4),
设置6-BA (0.1、0.2、0.3 mg·L-1)、IBA (0、0.05、
0.10 mg·L-1)各3个水平, 共9个处理。每个处理接
10瓶, 每瓶接种3个外植体, 重复3次。将诱导培养
长出的丛生芽分株、切割 , 将生长状况基本一
致、大小相同(长1 cm)的单个芽接入培养基, 培养
50 d后调查增殖率。
2.4 生根
将经继代增殖后, 长度大于3 cm的带顶芽的
单苗转入生根培养基。采用两因素三水平完全随
机试验设计, 以DCR为基本培养基(琼脂7 g·L-1, 蔗
糖30 mg·L-1, pH 5.4), 设置NAA (0.01、0.02、0.03
mg·L-1)、IBA (0.2、0.5、0.8 mg·L-1)各3个水平, 共9
个处理。每个处理接10根试管, 每试管接种1个外
植体, 重复3次, 50 d后调查生根率和平均生根数。
2.5 移栽
取生根培养45 d根系发达、植株高为5~7 cm
的柳杉试管苗, 将其从培养箱中取出, 移至室外遮
荫棚或温室中进行强光闭瓶炼苗20 d, 遮荫度为
75%左右。然后解开封口膜绳子炼苗3 d, 接着褪
去封口膜炼苗7 d。然后取出试管苗洗干净根部的
培养基, 移栽至纯河砂中进行常规管理。
2.6 培养条件
以上培养条件均为光照时间为16 h·d-1, 光强
为30~40 µmol·m-2·s-1, 培养温度(23±2) ℃。
2.7 数据统计分析
采用SPSS17.0数据分析系统和Microsoft Excel
对试验观察数据资料进行方差分析、LSD多重比
较等。在结果统计中所涉及的测定项目计算公式
如下: 污染率(%)=污染的外植体数/接种的外植体
数×100; 成活率(%)=存活的外植体数/接种的外植
体数×100; 诱导率(%)=长出丛生芽的外植体数/接
种的外植体数×100; 增殖率(%)=进行丛生芽增殖
的外植体数/接种的外植体数×100; 增殖倍数=丛生
芽个数/接种的外植体数; 平均生根数=每处理生根
的总数/诱导出根的试管苗数; 生根率(%)=生根的
试管苗数/接种的试管苗数×100。
实验结果
1 不同灭菌处理对外植体灭菌效果的影响
柳杉种子灭菌试验的结果(表1)表明, 酒精灭
菌时间对成活率影响显著(P<0.05), 10 s下的成活
率显著低于其他水平(P<0.05), 20 s与30 s下的成活
率无显著差异(P>0.05)。0.1% HgCl2灭菌的时间对
污染率和成活率的影响均达到显著水平(P<0.05),
蒋时姣等: 柳杉种子无菌苗组培快繁体系的建立 1041
图1 柳杉种子无菌苗的丛生芽诱导和植株再生
Fig.1 Cluster buds induction and plant regeneration of C. fortunei sterile seedlings
A和B: 种子萌发出无菌苗; C: 丛生芽的诱导; D~F: 丛生芽的增殖; G: 生根的试管苗; H: 移栽成活的组培苗。
表1 不同灭菌处理对外植体灭菌效果的影响
Table 1 Effects of different sterilizations on explants sterilizing
处理号 75%酒精处理时间/s 0.1% HgCl2处理时间/s 污染率/% 成活率/%
1 10 480 37.00±3.00a 43.67±3.21e
2 10 600 19.67±1.15b 73.00±3.00c
3 10 720 11.33±0.56bc 76.67±0.58bc
4 20 480 44.00±4.58a 60.33±2.08d
5 20 600 10.00±2.65c 82.33±2.08ab
6 20 720 7.67±3.06c 72.33±1.53c
7 30 480 46.00±5.29a 50.00±5.29e
8 30 600 9.33±2.52c 86.67±2.52a
9 30 720 11.33±2.89bc 80.33±3.21abc
　　数据为平均值±标准差, 同列数字旁不同小写字母表示有显著差异(P<0.05), 下表同。
480 s下的污染率显著高于其他水平下的污染率;
随着灭菌时间的继续增加, 污染率下降不显著, 但
成活率却显著下降, 当灭菌时间为720 s时, 其成活
率降低到76.44%。综合分析表明, 处理5与处理8
灭菌效果较佳且两者之间差异并不显著, 因此柳
杉种子的灭菌以75%酒精灭菌20 s、0.1% HgCl2灭
菌600 s效果较佳, 外植体污染程度较低, 污染率为
10.00%, 成活率较高为82.33%。
2 不同基本培养基种类和6-BA浓度对丛生芽诱导
的影响
将由种子萌发而成的无菌苗(图1-A、B)接入
丛生芽诱导培养基后, 约14 d基部略有膨大, 随后
逐渐萌发出芽(图1-C)。诱导试验的结果(表2)表
明, 基本培养基和6-BA对柳杉种子无菌苗丛生芽
的诱导率均有显著影响(P<0.05)。在基本培养基
各水平间, MS与WPM、DCR间的差异达到了显著
水平, WPM与DCR间差异不显著, 但都高于MS的
诱导率, 诱导率分别达到了42.2%和43.3%; 而对
6-BA各水平来说, 0.2 mg·L-1水平下的诱导率显著
高于0.5 mg·L-1和0.8 mg·L-1水平下的诱导率, 而0.5
mg·L-1和0.8 mg·L-1下的差异并不显著。说明6-BA
为0.2 mg·L-1时的柳杉种子无菌苗丛生芽的诱导效
植物生理学报1042
果最佳, 随着6-BA浓度的进一步增加, 诱导率有所
下降。
3 不同浓度6-BA和IBA对丛生芽增殖的影响
将单芽苗接入增殖培养基后(图1-D~F), 各处
理增殖率均达到100%。试验结果(表3)表明, 6-BA
和IBA对柳杉种子无菌苗增殖倍数均有显著影响
(P<0.05)。在6-BA各水平间, 增殖倍数随着6-BA
浓度的增加先增大后减小, 0.2 mg·L-1处理下的增
殖倍数显著大于0.1、0.3 mg·L-1, 平均达到8.59; 而
对IBA各水平来说, 增殖倍数随着IBA浓度的增加
而增大, 0.05、0.1 mg·L-1之间差异不显著, 但均高
于0 mg·L-1时的增殖倍数。6-BA浓度为0.2 mg·L-1
时的处理5和处理6, 其增殖倍数显著高于其他处
理, 分别达到11.00和10.33, 而处理4由于缺乏IBA,
仅为4.44, 因此, 丛生芽增殖的最佳培养基为DCR+
6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.05~0.10 mg·L-1。
4 不同NAA和IBA浓度对生根的影响
将经继代增殖后, 长度大于3 cm的带顶芽的
单苗转入生根培养基。20 d左右开始长出白色的
根尖, 之后根迅速伸长, 50 d后形成良好根系(图
1-G)。结果(表4)表明, IBA和NAA对生根均有显著
影响(P<0.05)。随着IBA浓度的升高, 生根率逐渐
降低, 当浓度达到0.8 mg·L-1时, 试管苗基部开始分
化出大量愈伤组织, 生根受到抑制, 生根数量减少,
且试管苗的茎段开始发黄, 而后叶片发黄最终导
致整株死亡。平均生根数随着NAA浓度的升高而
减少, 当NAA浓度为0.02和0.03 mg·L-1时, 基部会
先分化出少量愈伤组织, 然后在愈伤组织中分化
出根, 根条细弱, 根系较小。处理1的生根率和平
均生根数都较高, 与其他处理差异呈显著水平, 根
条直接从试管苗基部长出, 根条粗壮, 根系较大。
因此, DCR+NAA 0.01 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1为生根
的最适培养基。
5 炼苗与移栽
试管苗经材料与方法2.5节中所述方法炼苗后
表2 不同植物生长调节剂对丛生芽诱导的影响
Table 2 Effects of plant growth regulators on the induction of
cluster buds
处理号 基本培养基种类 6-BA浓度/mg·L-1 芽诱导率/%
1 MS 0.2 26.67±5.77b
2 MS 0.5 23.33±11.54b
3 MS 0.8 33.33±5.77b
4 WPM 0.2 73.33±15.28a
5 WPM 0.5 20.00±10.00b
6 WPM 0.8 33.33±15.28b
7 DCR 0.2 66.67±11.55a
8 DCR 0.5 46.67±5.77ab
9 DCR 0.8 16.67±11.55b
表3 不同植物生长调节剂对丛生芽增殖的影响
Table 3 Effects of plant growth regulators on the proliferation
of cluster buds
处理号 6-BA浓度/mg·L-1 IBA浓度/mg·L-1 增殖倍数
1 0.1 0 4.56±0.84b
2 0.1 0.05 4.67±0.67b
3 0.1 0.10 6.67±0.88b
4 0.2 0 4.44±1.02b
5 0.2 0.05 11.00±1.86a
6 0.2 0.10 10.33±0.88a
7 0.3 0 4.89±1.50b
8 0.3 0.05 5.33±1.20b
9 0.3 0.10 4.22±0.84b
表4 不同植物生长调节剂对生根的影响
Table 4 Effects of plant growth regulators on the percentage of rooting
处理号 NAA浓度/mg·L-1 IBA浓度/mg·L-1 生根率/% 平均生根数/条
1 0.01 0.2 90.00±5.77a 4.09±0.26a
2 0.01 0.5 56.67±10.18abc 2.56±0.38de
3 0.01 0.8 73.33±5.09ab 2.23±0.08e
4 0.02 0.2 60.00±5.77abc 3.73±0.07ab
5 0.02 0.5 40.00±5.77bc 1.37±0.15f
6 0.02 0.8 40.00±5.77bc 3.37±0.26bc
7 0.03 0.2 76.67±6.94ab 2.90±0.23cd
8 0.03 0.5 46.67±6.94bc 1.94±0.25ef
9 0.03 0.8 30.00±15.28c 2.23±0.25de
蒋时姣等: 柳杉种子无菌苗组培快繁体系的建立 1043
移栽, 约30 d后发出新芽, 检查根部有新根长出即
移栽成活, 移栽成活率可达85%, 成活植株长势较
好且一致(图1-H)。
讨　　论
在植物组织培养工作中, 无菌外植体的获得
是非常重要的。由于柳杉种子较小, 除了操作较
为困难以外, 也常常因为灭菌不彻底从而造成污
染, 最终影响试管苗的培养。对于种子的灭菌, 前
人采取不同的方法来达到有效灭菌的目的(张志元
和官春云2005; 胡重怡等2007), 由于材料的不同得
出的灭菌方法各不相同。因此, 本实验对材料进
行了预处理后, 通过不同灭菌时间处理来控制污
染, 处理时间过短灭菌不彻底, 处理时间过长灭菌
剂会浸入种皮导致种子褐化, 成活率下降且影响
种子萌发。而75%酒精灭菌20 s和30 s对灭菌结果
的影响不大, 选择灭菌20 s更为简便, 并且在后期
的种子萌发中发现, 灭菌30 s后种子萌发较慢, 生
长状况较差, 可能是酒精处理时间过长导致种子
内部受到伤害。结果显示, 用75%酒精灭菌20 s,
0.1% HgCl2浸泡600 s灭菌效果较好, 其污染率降到
10%, 成活率为82.33%。这与张翠萍等(2008)采用
真空泵抽滤灭菌相比, 方法更为简洁, 成本更低,
更适合快速繁殖。
在进行丛生芽诱导时, 本实验对基本培养基
进行了筛选。MS培养基的主要特点是无机盐, 特
别是硝酸盐、钾离子和铵离子的浓度高, DCR与
WPM培养基是低盐浓度培养基。结果表明, DCR
与WPM培养基的诱导效果均优于常用基本培养基
MS, 且在培养后期MS诱导出的芽颜色逐渐变黄,
长势较弱, 这与大多数木本植物芽诱导的结果不
一致 (陈正华1986; 李海燕等2009; 孙晓敏等
2012)。也有研究表明(彭绿春等2013), MS对木本
植物有一定的毒害作用, 并且是一个长期积累的
过程 , 随着时间的增加会影响植物生长甚至死
亡。本实验诱导培养的时间较长, 且可能该柳杉
品种对盐浓度较为敏感, 在诱导的后期便表现出
不适应, 及时筛选出适宜的基本培养基, 有利于后
期增殖培养。DCR和WPM培养基的诱导效果在本
试验中并没有表现出显著差异, 在今后的试验中
可以对此做进一步的研究。由于DCR培养基为针
叶树诱导芽的专用培养基(Gupta和Durzan 1985),
故本试验选择DCR培养基进行培养。另外, 进行
丛生芽诱导培养时, 同时实现了芽的诱导与增殖,
因此可以将培养程序简化, 缩短培养时间, 降低生
产成本。
丛生芽的增殖培养中, 6-BA和IBA的组合使
用比较常见(Rehana等2013; Al Malki和Elmeer
2010)。在诱导培养实验中, 6-BA最佳浓度为0.2
mg·L-1, 高于该浓度的处理其诱导能力下降。因此,
增殖培养实验时, 延续了诱导培养的最适基本培
养基, 进一步寻找最佳6-BA浓度, 并在附加不同浓
度的IBA来扩大丛生芽的增殖。结果表明, 在诱导
培养的最适培养基中添加少量的IBA, 增殖率可达
100%, 且增殖系数达到10以上。虽然一般来说, 繁
殖系数过高会引起组培苗的弱化, 生长势变差(吴
秀华等2013)。但在本实验中, 继代培养组培苗生
长仍较旺盛。有研究表明(叶晓青等2012), 可以通
过降低细胞分裂素浓度来维持较高平均繁殖系数,
同时又保持较好的生长势, 因此在后期可以对此
进行进一步的研究。
在大部分的生根实验中, 生根的基本培养基
均采用1/2MS培养基(程云清等2011; 邓建军等
2011), 即降低了无机盐的浓度。因此, 本实验仍然
采用低盐培养基DCR进行生根实验, 并附加不同
浓度的NAA和IBA诱导根的形成。结果表明, 低浓
度的NAA和IBA对生根均有一定的促进作用, 生根
率达90%, 且根条较为健壮, 直接从试管苗的基部
萌生出根条, 没有产生愈伤组织, 这种直接生根的
方式产生的根直接与植株的木质部相连, 是有效
根, 有利于移栽的存活。这与张翠萍等(2008)采用
两阶段生根相比效果更好, 简化了培养过程, 缩短
了培养时间。本文建立了以种子无菌苗为起始外
植体的柳杉组培快繁体系, 为工厂化生产柳杉种
苗提供了技术参考。
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