全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (2): 185~191 185
收稿 2013-10-16　　修定 2013-12-31
资助 国家基金委地区科学基金(31060041)和甘肃省自然科学基
金B类(1212RJYA008)。
* 通讯作者(E-mail: majz@lut.cn; Tel: 0931-2976707)。
拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和纯化
马燕林, 马建忠*, 王永刚
兰州理工大学生命科学与工程学院, 兰州730050
摘要: 拟南芥abi5基因编码了一个碱性亮氨酸拉链类转录因子, 它在ABA信号转导过程中发挥着关键调控作用。本文以拟
南芥为材料, 通过RT-PCR扩增、克隆了包含abi5基因编码区的片段。核苷酸序列分析表明, 所克隆的基因与NCBI数据库
收录的abi5基因(GenBank登录号NM_129185.3)有99.0%的一致性; 氨基酸序列存在4个残基差异。所克隆的abi5基因被进
一步亚克隆至pET-32a表达载体。序列测定核实构建正确的重组质粒(pET32a-ABI5)转化入大肠杆菌BL21 Star (DE3)中诱
导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化、SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果表明, 重组abi5基因在大肠杆菌表达
的较适宜条件为: 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.3 mmol∙L-1、30 ℃下诱导4 h, 可达到细菌裂解液上清蛋白的
29.1%。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后的ABI5融合蛋白在SDS-PAGE电泳分析时呈现一条蛋白带。该条带经串联质谱分析
证明为重组ABI5融合蛋白。
关键词: 拟南芥; abi5; 分子克隆; 原核表达; 纯化; 质谱
Molecular Cloning, Prokaryotic Expression and Purification of abi5 Gene
from Arabidopsis thaliana L.
MA Yan-Lin, MA Jian-Zhong*, WANG Yong-Gang
School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China
Abstract: The abi5 gene from Arabidopsis encodes a basic leucine zipper transcription factor, which plays a
key regulatory role in ABA signal transduction. In this paper, the coding region of the abi5 gene of Arabidopsis
thaliana Columbia was amplified by RT-PCR and then cloned into a T-vector, pMD®19-T. The nucleotide
sequencing showed that the cloned gene had a 99.0% identity with the abi5 gene sequence (GenBank No.
NM_129185.3). The amino acid sequence of the cloned fragment exists four different residues. The abi5 gene
was further subcloned into an expression vector, pET-32a. The recombinant plasmid construct (pET32a-ABI5)
was verified by nucleotide sequencing, and transformed into Escherichia coli BL21 Star (DE3). The expression
of the ABI5-fused protein was induced with 0.3 mmol∙L-1 IPTG, at 30 ℃ for 4 h. Under this condition, the con-
tent of the fusion protein could reach 29.1% of the total supernatant proteins of bacteria lysate. After Ni-NTA
affinity chromatography purification, a single band was observed in the SDS-PAGE gel, with an 86.1% purity.
The band was excised for MS/MS assay. The results of tandem mass spectrometry proved that the band con-
tained the ABI5-fused recombinant protein.
Key words: Arabidopsis thaliana; abi5; molecular cloning; prokaryotic expression; purification; mass
脱落酸(abscisic acid, ABA)作为一种重要的
植物激素调节着植物生长发育过程中的诸多环节,
比如种子和芽的休眠、气孔关闭、生物与非生物
性胁迫的响应、以及拮抗其它植物生长调节物质
的作用等(Finkelstein 2010)。拟南芥的ABI5
(abscisic acid-insensitive 5)蛋白是一个响应ABA信
号的碱性亮氨酸拉链类(basic leucine zipper, bZIP)
转录因子, 其突变体对ABA的响应具有多效缺陷
性, 包括对ABA抑制种子发芽的敏感性降低、一
些ABA调控基因的表达发生改变等(Finkelstein和
Lynch 2000)。进一步的研究表明, 不仅ABI5蛋白
的表达受ABA的诱导, ABI5也结合于许多下游基
因启动子对ABA响应的区域(Finkelstein和Lynch
2000; Kim等2002)。除了bZIP区域外, ABI5家族的
蛋白质至少有6个保守的区域。其中, 保守区II含
有22个氨基酸残基, 并可在酵母细胞中表现出转
植物生理学报186
录激活活性。保守区II周边的磷酸化位点对其转
录激活活性有抑制作用(Kim和Thomas 1998)。响
应ABA并与ABI5相互作用的蛋白AFPs突变会导
致拟南芥幼苗对干旱和盐胁迫更为敏感(Garcia等
2008)。近来的研究表明, 植物光敏素结合磷酸酶
的突变可致ABA诱导的种子萌发和幼苗生长表现
出超敏性。这一过程已被证明由ABI5介导(Dai等
2013)。ABI5作为ABA信号转导过程中的关键转
录因子之一介导了许多重要的植物生理过程, 比
如胚胎晚期发育和逆境胁迫反应(Garcia等2008;
Kim等2002; Finkelstein 2010)。因此, 克隆该蛋白
的编码基因、体外表达、纯化该蛋白质, 进一步
研究该蛋白质发挥作用的分子机制则十分必要。
本文以拟南芥为实验材料, 通过RT-PCR扩增
并克隆了abi5基因的编码区, 进一步实现了在大肠
杆菌细胞中的表达、表达蛋白的纯化和质谱鉴
定。以此获得重组ABI5蛋白用于后续ABI5抗体的
制备、免疫沉降和免疫印迹等深入分析工作。
材料与方法
1 材料
拟南芥哥伦比亚生态型(Arabidopsis thaliana
L. Columbia)种子(保存于冰箱4 ℃)播种于营养土
(丹麦品氏基质5号, pH 5.5)表面, 至于植物光照培
养箱(光照强度250 µmol∙m-2∙s-1, 22 ℃, 16 h光照,
8 h黑暗, 60%湿度)中培养。2周后取莲座叶片用于
总RNA的提取。
大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株、Es-
cherichia coli BL21 Star (DE3)菌株、pUC19质粒
和pET-32a质粒为兰州理工大学生命科学与工程学
院马建忠研究员实验室保存。
pMD®19-T载体、Pfu DNA聚合酶、所有限制
性内切酶、RNase A、Taq DNA聚合酶、T4 DNA
连接酶、蛋白质分子量标准(低)、DNA凝胶回收
试剂盒、Trizol总RNA抽提试剂盒等购自宝生物
工程(大连)有限公司。SanPrep柱式质粒DNA小量
抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、
SDS、IPTG、苯甲基磺酰氟(PMSF)、X-gal、
DNA分子量标志、氯霉素、氨苄青霉素、琼脂
糖、溴化乙锭、丙烯酰胺、胰蛋白胨和酵母提取
物等购自生工生物工程(上海)有限公司。Ni-NTA-
Agarose购自Qiagen公司。其他常用试剂均为国产
分析纯。
2 方法
下述实验方法和操作中若未注明所参考的文
献, 则均按萨姆布鲁克等(1998)一书中所述方法和
操作执行。
2.1 拟南芥总RNA的制备及abi5基因编码区的扩增
剪取2周龄拟南芥幼苗莲座叶片约1 mg, 按宝
生物工程(大连)有限公司的Trizol总RNA抽提试剂
盒的操作说明书提取总RNA。紫外分光光度计测
定所提取总RNA的浓度。取约2 μg总RNA上样于
经DEPC处理的1%琼脂糖凝胶, 电泳后紫外灯观察
并拍照。cDNA链的合成反应为: 5×PrimeScript缓
冲液2 μL、PrimeScript反转录酶混合液I 0.5 μL、
100 μmol∙L-1六聚随机引物0.5 μL、总RNA 0.5 μg,
加DEPC处理的无菌水至10 μL。42 ℃温育1 h, 70 ℃
终止反应10 min, 于冰浴中冷却后置−20 ℃保存。
根据GenBank中提供的abi5基因序列(Gen-
Bank登录号NM_129185.3)设计了1对特异性引
物。上游引物的核苷酸序列为: 5 CCGGAAT-
TCACTAGAGAAGTTGACGT 3, 下游引物核苷酸
序列为: 5 CGGAATTCTTAGAGTGGACAACTCG-
GGT 3。2个引物的5端均引入了EcoRI酶切位点
和2~3个保护碱基。引物由生工生物工程(上海)有
限公司合成。abi5基因编码区的PCR扩增反应
为: 10×PCR缓冲液5.0 μL、dNTP (2.5 mmol∙mL-1)
1.0 μL、上述cDNA合成反应液1.0 μL、Pfu DNA
聚合酶(2.5 U∙μL-1) 0.5 μL、上游引物(10 pmol∙L-1)
1.0 μL、下游引物(10 pmol∙L-1) 1.0 μL, 加无菌水至
50 μL。PCR扩增反应程序为: 94 ℃预变性2 min,
然后进入3步骤循环(98 ℃变性10 s、60 ℃退火
15 s、72 ℃延伸1 min 50 s, 30个循环); 之后72 ℃
延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳
分离后切胶, 按SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒
的操作说明回收PCR产物。回收的PCR产物由Taq
DNA聚合酶处理在其3末端加A。加A反应为 :
dATP (2.5 mol∙L-1) 3 μL、Taq DNA聚合酶(5 U∙μL-1)
1 μL、10×Taq DNA聚合酶缓冲液2 μL、回收的
PCR产物14 μL, 加无菌水至20 μL。72 ℃反应30
min。反应完成后, 用等体积的Tris饱和酚氯仿(pH
8.0)抽提1次, 乙醇沉淀、干燥后溶于10 μL无菌水
马燕林等: 拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和纯化 187
中。加A后的PCR产物与pMD®19-T载体的连接反
应: 2×DNA连接预混液(mighty mix) 5 μL、PCR产
物1 μL、pMD®19-T DNA (50 ng∙μL-1) 2 μL, 加无菌
水至10 μL。16 ℃连接过夜。10 μL连接反应液全
部用于大肠杆菌DH5α的转化。挑取转化后的单
菌落制备质粒, 限制酶切鉴定并送测序。测序正
确的重组质粒命名为pUC19-ABI5。
2.2 拟南芥abi5基因原核表达载体的构建
按SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒制
备pUC19-ABI5质粒和pET-32a质粒DNA。用EcoRI
酶切2种质粒。酶切反应为: 10×EcoRI缓冲液2
μL、质粒DNA 10 μL、EcoRI内切酶1.5 μL, 加无
菌水至20 μL。37 ℃保温1 h。磷酸酶(CIAP)处理
线性化的pET-32a质粒DNA末端。1%的琼脂糖凝
胶电泳分离后回收abi5目的片段和线性化的pET-
32a载体片段。之后, 建立abi5 DNA回收片段与
pET-32a质粒DNA片段的连接反应: 凝胶回收的
abi5基因片段4.5 μL、去磷酸化处理的pET-32a载
体DNA片段3.5 μL、10×连接酶缓冲液1.0 μL、T4
DNA连接酶(350 U∙μL -1) 1.0 μL, 加无菌水至10
μL。16 ℃连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态
细胞。提取重组质粒以EcoRI和NcoI酶切鉴定。
酶切鉴定正确的重组质粒进一步测序。测序正确
的重组质粒命名为pET32a-ABI5。
2.3 拟南芥abi5基因的原核表达
碱法制备pET32a-ABI5质粒DNA, 转化大肠
杆菌BL21 Star (DE3)感受态细胞。挑取单菌落
接种5 mL LB培养基(含氨苄青霉素50 μg∙mL-1),
37 ℃、200 r∙min-1培养过夜。次日以1%的接种量
接种新鲜100 mL LB培养基, 37 ℃振荡培养至对数
生长期(OD600=0.50~0.60)。吸取1 mL菌液留做
SDS-PAGE分析。随后加入IPTG至终浓度0.3
mmol∙L-1, 30 ℃诱导培养, 并分别于1、2、4、6和
8 h吸取1 mL菌液, 6 000 r∙min-1离心收集菌体。
10% SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达情况。
2.4 ABI5融合蛋白的纯化与质谱分析
收集100 mL IPTG 诱导培养4 h的细菌培养液,
4 ℃、6 000 r∙min-1离心10 min。用4 mL的预冷的
结合缓冲液(20 mmol∙L-1 NaH2PO4、20 mmol∙L
-1
Na2HPO4、500 mmol∙L
-1 NaCl, pH 7.4)重悬菌体,
加入PMSF至1 mmol∙L-1。于冰上混合30 min后超
声裂解细菌(JY92-II超声波细胞粉碎机, 参数: 功
率320 W, 冰浴下超声7 s, 间隔10 s, 20个循环)。4
℃、10 000 r∙min-1离心20 min, 上清液用于Ni-NTA
亲和层析柱上样。上样前, 2 mL Ni-NTA层析柱以
6倍柱体积的平衡缓冲液(20 mmol∙L-1 NaH2PO4、
20 mmol∙L-1 Na2HPO4、500 mmol∙L
-1 NaCl, pH 7.8)
平衡。上样后, 用约40 mL洗涤缓冲液(20 mmol∙L-1
NaH2PO4、20 mmol∙L
-1 Na2HPO4、500 mmol∙L
-1
NaCl, pH 6.0, 流速0.3 mL∙min-1)洗涤层析柱, 直至
流出液体的OD280<0.01。之后依次用10 mL洗脱缓
冲液(含10 mmol∙L-1咪唑)、10 mL洗脱缓冲液(含
50 mmol∙L-1咪唑)、10 mL洗脱缓冲液(含100
mmol∙L-1咪唑)洗脱目的蛋白。分管收集洗脱液,
测定OD280, SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度。从胶上
切下目的条带送至生工生物工程(上海)有限公司
进行串联质谱分析。
实验结果
1 拟南芥总RNA的提取与abi5基因的扩增、克隆
尽管abi5为ABA诱导表达基因, 但拟南芥叶
片中微量存在的abi5转录本已足够通过RT-PCR扩
增(Kim等2002)。通常, RNA分子极易降解。为防
止RNA分子降解使扩增反应失败, RNA的提取与
反转录反应应连续进行。按Trizol法提取总RNA,
50 mg二周龄的拟南芥幼苗叶片共得到10.8 μg总
RNA (浓度为0.36 μg∙μL-1)。取2 μg总RNA制备物
做琼脂糖凝胶电泳 , 结果如图1 - A所示 , 2 8 S
rRNA、18S rRNA和5S rRNA条带清晰可见, 且亮
度依次递减。表明所制备的总RNA降解不严重,
质量较好。
考虑到Taq DNA聚合酶没有校读活性, DNA
扩增时误差率较高, 所以我们选用了Pfu DNA聚合
酶进行体外扩增反应。以0.5 μg上述总RNA制备
物为模板, 用PrimeScript反转录酶催化cDNA链的
合成。随后取1/10体积的cDNA反应液为扩增模
板, 建立50 μL的PCR扩增反应。琼脂糖凝胶电泳
检测PCR结果(图1-B), 得到了一片段长度大于1 kb
的单一扩增产物。这一片段大小基本符合预期扩
增片段的大小(1.3 kb)。
为便于T载体克隆, 上述Pfu DNA聚合酶的扩
增产物用Taq DNA聚合酶进行了后处理, 以使其3
植物生理学报188
末端含有一个突出的腺嘌呤核苷酸(A)残基。电泳
纯化后, 腺嘌呤化的PCR产物与T载体(pMD®19-T
vector)进行了连接。经过转化、挑取阳性克隆进
行培养、提取质粒、EcoRI酶切鉴定(图1-C), 重组
质粒pUC19-ABI5酶切后产生2个条带。其中, 大片
段为载体片段, 小片段大小接近1.3 kb, 确定扩增片
段已插入克隆载体。
2 pUC19-ABI5的序列测定与分析
上述重组质粒pUC19-ABI5送生工生物工程
技术服务(上海)有限公司进行序列测定。测序结
果用CLC DNA Workbench 5.0软件拼接后与NCBI
收录的拟南芥ab i5基因的cDNA序列 (登录号
NM_129185.3)进行了比对。比对结果显示二者的
核苷酸序列一致性高达99.0%。扩增片段中包含
一个1 323 bp的开放阅读框, 编码一个440氨基酸残
基的多肽(图2)。其氨基酸序列与NCBI数据库中
ABI5 (登录号NP_565840.1)的相比, 第1个氨基酸
残基(T)与ABI5的第3个氨基酸残基相对应, 也与
引物的设计序列一致。随后的氨基酸序列中共有
4个位点发生了突变, 分别是第115位的丙氨酸(原
为缬氨酸)、第163位的酪氨酸(原为组氨酸)、第
174位的天冬酰胺(原为丝氨酸)、第385位的脯氨
酸(原为亮氨酸)。本实验中, abi5基因编码区的扩
增采用了高保真的Pfu DNA聚合酶, 因此, 这些突
变位点很可能是由于栽培品种不一致所造成。这
些突变是否对ABI5蛋白功能有影响也有待于以后
的进一步分析工作。
3 pET32a-ABI5表达载体的构建及鉴定
在单一限制切点插入外源DNA片段, 不仅节
省限制酶, 也很容易进行单酶切鉴定重组子。但
是, 当构建外源DNA片段到表达载体的单酶切位
点时, 外源DNA片段会以不确定的方向插入克隆
位点。这就需要在随后的重组子筛选过程中加以
甄别。以限制性内切酶EcoRI分别消化重组质粒
pUC19-ABI5和表达载体pET-32a (随后去磷酸化),
电泳分离后回收进行连接, 转化大肠杆菌DH5α,
挑取转化平板上的单菌落培养后提取重组质粒进
行电泳鉴定。含外源插入片段的重组质粒明显大
图2 abi5基因编码区扩增片段的氨基酸序列
Fig.2 The amino acid sequence of the amplified fragment containing the ABI5 coding region
图1 拟南芥总RNA和abi5基因编码区扩增产物及其克隆的琼脂糖电泳结果
Fig.1 The electrophoresis results of the extracted total RNA, the amplified fragment, and the EcoRI-digested recombinant plasmid
A: 拟南芥总RNA; B: abi5基因编码区的PCR扩增产物; C: EcoRI酶切后的重组质(pUC19-ABI5)。1: 拟南芥总RNA; 2: abi5基因编码区
的PCR扩增产物; 3: EcoRI酶切重组质粒pUC19-ABI5后的产物; M: DNA分子量标记。
马燕林等: 拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和纯化 189
于空载的pET-32a质粒(图3-A)。随后进行EcoRI酶
切检查, 插入片段的大小在1.3 kb左右(图3-B)。由
于该扩增片段为非定向插入pET-32a载体, 因此需
要进一步鉴定目的基因片段是否以正确的方向插
入于载体中。根据插入片段和pET-32a质粒的序
列, 选用了NcoI切割来确定插入片段的方向。若目
的基因片段正向插入于载体中, 经NcoI酶切后会产
生一条约7 160 bp的大片段和一条69 bp的小片段;
若是反向插入则会产生一条约5 929 bp的大片段
和一条1 300 bp的小片段。上述重组质粒经NcoI酶
切后进行电泳检测(图3-C), 泳道5中的重组质粒应
含有正向插入的abi5基因片段。选择正向插入扩
增片段的重组质粒进一步进行核苷酸序列测定,
以核实各片段组成了一完整的阅读框。
4 重组质粒pET32a-ABI5在大肠杆菌中的诱导表达
abi5基因来自高等真核植物, 其遗传表达系统
与大肠杆菌差异较大。因此, 我们选择了较适合
真核基因表达的改良大肠杆菌BL21 Star (DE3)菌
株作为abi5基因表达的宿主细胞。abi5基因插入
pET-32a载体的EcoRI位点后, 形成了一个编码607
个氨基酸残基的阅读框(图4)。在abi5基因编码区
之前有Trx-Tag、His-Tag、Thrombin位点、S-Tag
和Enterokinase位点。含abi5基因片段的完整阅读
框可编码一理论分子量为64.6 kDa的多肽。
先期实验结果表明, 诱导剂IPTG的适宜浓度
为0.3 mmol∙L-1。在上述IPTG浓度下诱导分别含
pET32a和pET32a-ABI5质粒的大肠杆菌菌株0、
1、2、4和6 h。之后收集并裂解菌体 , 12 000
r∙min-1离心后的上清加入等量2×SDS上样缓冲液,
进行SDS-PAGE分析。结果表明, 含pET32a-ABI5
质粒的菌株在IPTG诱导1 h后于67 kDa左右处出现
了一条明显的蛋白条带(图5-B), 该条带随时间延
长而增加, 至诱导4 h时达到最大。BandScan扫描
结果显示, 1 h时该条带的蛋白含量占到细菌裂解
上清液蛋白的5.4%, 2 h时为14.4%, 4 h时为29.1%,
6 h时为21.9%。相同条件下, 含空载pET32a质粒的
菌株中则没有该条带(图5-A)。该诱导蛋白条带的
分子量与我们预期的重组ABI5的理论分子量相差
约3 kDa。由于SDS-PAGE并不是一个准确测量蛋
白质分子量的方法, 所以, 上述诱导表达出的蛋白
条带很可能是含ABI5的重组蛋白。当然, 这需要
进一步的实验结果来确定。
图3 pET32a-ABI5重组质粒的鉴定
Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pET32a-ABI5
A: 1为挑取的重组质粒, 2为空载的pET32a质粒DNA; B: 3为EcoR I 酶切的重组质粒(pET32a-ABI5); C: NcoI酶切的重组质粒结果; 4为
反向插入, 5为正向插入。M为分子量标记。
图4 包含ABI5的重组融合蛋白结构示意图
Fig.4 The open-reading frame of the ABI5-contain recombinant protein
植物生理学报190
图5 ABI5融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
Fig.5 Induced expression of the ABI5-fused protein in E. coli Star BL21 (DE3)
A: 空载的pET-32a质粒; B: pET32a-ABI5质粒; M: 蛋白质分子量标记。
图6 Ni-NTA亲和层析柱纯化后的ABI5融合蛋白
Fig.6 ABI5-fused protein purified by Ni-NTA
affinity chromatography
M: 蛋白质分子量标记; 1: 纯化的ABI5 融合蛋白。
5 重组ABI5蛋白的亲和层析纯化和质谱鉴定
在上述诱导表达条件下培养100 mL菌液, 超
声裂解后的上清液加载至Ni-NTA亲和层析柱, 洗
涤之后以含不同咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱。诱
导表达的蛋白条带在咪唑浓度为100 mmol∙L-1时
可被洗脱。SDS-PAGE结果显示, 经Ni-NTA亲和
层析柱纯化后的蛋白为一条清晰的条带(图6)。
BandScan扫描样品泳道后显示该条带的蛋白含量
可占到上样成分的81.6%。
为进一步确定纯化后单一蛋白条带中蛋白质
的性质, 该蛋白条带自SDS-PAGE凝胶上切下, 进
行了串联质谱分析。质谱结果(图7)表明, 该条带
蛋白中所含的7个肽段的氨基酸残基序列均与
ABI5蛋白一致。由此证明, 在含pET32a-ABI5大肠
杆菌菌株中诱导表达、分离纯化的蛋白条带正是
重组的、包含ABI5的融合蛋白。
讨　　论
虽然abi5基因属于ABA诱导表达基因, 但在
本实验中, abi5基因从ABA未处理的拟南芥叶片中
也扩增了出来, 证明该基因的转录本在ABA未处
理的叶片中也存在。在早先的实验中 , pET32-
图7 ABI5融合蛋白质谱分析结果
Fig.7 Identification of the ABI5-fused protein by MS/MS
A: MS/MS测定的ABI5融合蛋白的各个肽段峰; B: ABI5蛋白全长氨基酸序列, 其中下划线部分为MS/MS分析出的、与NCBI数据库中
收录的ABI5氨基酸序列完全匹配的肽段。
马燕林等: 拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和纯化 191
ABI5难以在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达(结果未
在本文列出)。最后换到了改良后的大肠杆菌菌种
BL21 Star (DE3)中, ABI5融合蛋白被顺利诱导表
达。大肠杆菌BL21 Star (DE3)菌株含有一突变的
rne基因, 可使真核的mRNA更加稳定。因其不含
lon和ompT基因编码的蛋白酶, 增加了外源基因表
达蛋白的稳定性。而其携带的质粒补充了大肠杆
菌缺乏的7种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、
CUA、CCC、GGA及CGG)和对应的tRNA, 可提
高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表
达水平及可溶性(Jain和Belasco 1995)。在本研究中,
超声波破碎后的菌体经SDS-PAGE检测发现, ABI5
融合蛋白的绝大部分都是以可溶性形式存在于裂
解液的上清中(本文未列出)。从本文的结果来看,
大肠杆菌的原遗传表达系统确实存在着不适合高
等真核基因表达的因素。
除了上述遗传因素外, 外源目的基因的表达量
也受细菌生长状态、诱导培养的温度和时间、诱
导剂的浓度等因素的影响(LaVallie和McCoy 1995)。
拟南芥abi5基因在IPTG终浓度为0.3 mmol∙L-1时,
ABI5融合蛋白的表达量在诱导4 h后达到最高, 占
细菌裂解液上清(可溶性蛋白)的29.0%。
Ni-NTA亲和层析柱纯化的ABI5融合蛋白经
SDS-PAGE分析时只有一条明显的蛋白带, 但用
BandScan软件扫描时发现该条带蛋白含量只占到
总量的81.6%。究其原因, 虽然只有一条明显的蛋
白条带, 但该泳道的背景较深, 尤其是在蛋白条带
的下方。尚难确定的是由于ABI5融合蛋白降解所
致抑或是其它少量杂蛋白引起。这些都需要更进
一步的研究来阐释。
参考文献
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