全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月 115
重金属镉对拟南芥DNA甲基化的影响
王子成 *, 马洪霞, 何艳霞
河南大学农业生物技术研究所, 河南开封 475001
提要: 将拟南芥种子点种于添加有不同浓度CdCl2的培养基中处理 2周, 移苗时CdCl2的胁迫即解除。低浓度CdCl2促进拟
南芥种子的萌发。CdCl2为 0.5 mg·L-1时萌发率最高(为 97.21%)。随着CdCl2浓度的继续增加, 种子萌发率即逐渐下降。幼
苗期和抽薹期分别提取叶 DNA, 采用甲基敏感扩增多态性(MSAP)技术分析其基因组DNA甲基化的结果显示, 总的来说,
随着CdCl2浓度的增加, 甲基化程度增高。
关键词: 拟南芥; 萌发率; MSAP; 甲基化
Effects of Cadmium on Arabidopsis thaliana DNA Methylation
WANG Zi-Cheng*, MA Hong-Xia, HE Yan-Xia
Institute of Agricultural Biotechnology, Henan University, Kaifeng, Henan 475001, China
Abstract: The seeds of Arabidopsis thaliana were cultured on the mediums with different concentrations of
CdCl2 for two weeks, then the seedlings were transplanted on the mediums without CdCl2. The results showed
that low concentrations of CdCl2 could enhance the germination rate of Arabidopsis, the highest germination
rate of Arabidopsis treated with 0.5 mg·L-1 CdCl2 was 97.21%. There was a negative correlation between the
concentration of CdCl2 and the germination rate. The total genomic DNAs in leaves at seedling stage and bolting
stage were isolated and analyzed by the method of methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP), the
results showed that the methylation degrees were increased with the increase of CdCl2 concentration.
Key words: Arabidopsis thaliana; germination rate; MSAP; methylation
收稿 2008-09-16 修定 2008-11-17
资助 河南大学校内基金(0 6ZDZR0 11 )。
* E-mail: wzc@henu.edu.cn; Tel: 0378-2868833-3767
镉是环境中主要的重金属污染物之一, 其毒性
大, 蓄积性强, 它不是植物生长发育所必需的元素,
但易被植物吸收。进入植物体后, 通过各种方式影
响植物的生长发育。
此外, 植物在生活周期中, 其发育状况常常随
着自己的遗传性和环境变化而异(Richards 1997), 这
种情况常取决于基因的转录表达而不是原初核苷酸
序列的改变。有研究表明, DNA 甲基化水平的变
化在这种调节中起作用。基因的甲基化可抑制基
因的表达: 当基因处于表达状态时, 甲基化水平往
往很低, 随着生长发育的进行需要将此种基因关闭,
这样就会在该基因的启动子或编码区发生重新甲基
化, 以致基因转录受抑, 基因失活, 从而终止其表达
(杨岐生 1994)。一些处于关闭状态的基因由于生
长发育的需要活化时又开启表达。在基因活化过
程中, 有些因素识别甲基化的序列, 会导致此种基
因的启动子区域去甲基化。这样, 植物就可以在不
同的环境条件和不同的生育期调控基因的时空表达
(侯雷平和李梅兰 2001)。
近年来, 重金属影响植物生长发育的研究表明,
重金属通过生理生化代谢影响植物的生长发育, 但有
关重金属对植物的表观遗传信息影响的研究相对不多。
为此, 本文采用甲基敏感扩增多态性(methylation-
sensitive amplified polymorphism, MSAP)技术研究
重金属镉对拟南芥种子萌发率和基因组DNA甲基
化的影响。
材料与方法
以Col-0生态型的拟南芥(Arabidopsis thaliana)
为实验材料。种子经 0.1% 升汞消毒 5 min, 无菌
水清洗 6 min, 点种于预先加有不同浓度 CdCl2 的
MS 培养基中。重金属CdCl2 浓度分别为 0.5、1.0、
1.5、2.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、
20.0、25.0 mg·L-1。以野生型(WT)作为对照。处
理 2周后移植到营养土(蛭石:营养土= 1:1)中, 解除
CdCl2 的胁迫。
种子点种后, 将培养皿放在 4 ℃低温下春化
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月116
3 d后再放入培养室, 每天统计萌发率, 直到萌发率
不变, 即为萌发率。每个处理重复 3 次。
采用改良的CTAB法提取叶中DNA, 移苗时取
各个处理材料的叶片, 抽薹期只选取 0~5.0 mg·L-1
相对应的处理材料的叶片。提取后的DNA用0.8%
的琼脂糖凝胶检测, 调整浓度统一含量为 25 ng·µL-1。
AFLP分析与甲基敏感性限制性内切酶结合进
行, 以对甲基化敏感的酶 HapII 和 MspI 代替 MseI
作高频内切酶, 以 EcoRI 为低频内切酶进行 AFLP
反应, 用于检测DNA分子甲基化状态的分子标记。
参照Cervera等(2002)和Xiong等(1999)的方法
并略作改动。接头和引物序列见表 1。
结果(毛学文和张海林2003; 王树会和王红珍2006;
李国良 2006)相似。
2 MSAP结果分析
MSAP 的技术基础是用同裂酶 HapII 和 MspI
的识别序列对甲基化的敏感性不同。这两种酶都
能识别四核苷酸序列 5 CCGG 3 但它们的活性受
该序列外或内胞嘧啶甲基化状态的影响。当 1 个
或 2个C完全甲基化(双链都甲基化)时HapII即无
活性, 半甲基化(只有一条链甲基化)时就有活性; 而
MspI可以切割C5mCGG, 但不能切割 5mCCGG和
5mC5mCGG。在 DNA 序列没发生变化的情况下
MSAP技术能够检测基因组DNA的甲基化修饰水
平(表 2 )。
结果显示, 实验将MSAP方法的带型归结为4
类: I 型带, HapII 和 MspI 扩增产物中都有(图 2-a);
II型带, MspI扩增产物中有而HapII扩增产物中没
有(图 2-b); III型带, HapII扩增产物中有而MspI扩
增产物中没有(图 2-c); IV 型带, HapII 和 MspI 扩
增产物中都没有。各个处理的带型变化分为 3 种
类型(对照带型 - 处理带型): 不变类型, I-I、II-II、
III-III; 甲基化增加类型, I- II、I-III、I-IV、II-
IV、III-II、III-IV; 甲基化减少类型, II- I、II-
III、III- I、IV- I、IV-II、IV-III。
3 不同浓度CdCl2处理后的甲基化
12 个浓度用 8 对引物扩增出 1 432 条带。不
变的条带为 1 030 条, 甲基化增加的条带为 295 条,
表 1 接头和引物序列
Table 1 Sequences of adapters and primers
引物 / 接头 序列
接头(adapter)
EcoRI-adapter I 5 CTCGTAGACTGCGTACC 3
EcoRI-adapter II 5 AATTGGTACGCAGTC 3
HapII-MspI-adapter I 5 GATCATGAGTCCTGCT 3
HapII-MspI-adapter II 5 TCATGATCCTGCTCG 3
预扩引物(preselective primers)
E-A 5 GACTGCGTACCAATTCA 3
HapII-MspI 5 ATCATGAGTCCTGCTCGG 3
选扩引物(selective primers)
EcoR-AAC 5 GACTGCGTACCAATTCAAC 3
EcoR-AAG 5 GACTGCGTACCAATTCAAG 3
EcoR-ACA 5 GACTGCGTACCAATTCACA 3
EcoR-ACT 5 GACTGCGTACCAATTCACT 3
EcoR-AGG 5 GACTGCGTACCAATTCAGG 3
EcoR-ACC 5 GACTGCGTACCAATTCACC 3
EcoR-ACG 5 GACTGCGTACCAATTCACG 3
EcoR-AGC 5 GACTGCGTACCAATTCAGC 3
HapII-MspI-TCCA 5 ATCATGAGTCCTGCTCGGTCCA 3
HapII-MspI-TCAA 5 ATCATGAGTCCTGCTCGGTCAA 3
结果与讨论
1 不同浓度CdCl2处理后的种子萌发率
不同浓度CdCl2处理的拟南芥种子进行萌发率
测定的结果表明, 0.5~1.5 mg·L-1处理的种子萌发不
但不受抑制, 反而促进; CdCl2 浓度超过 1.5 mg·L-1
时种子萌发即受抑。总的趋势是 CdCl2 的浓度越
高, 萌发率越低, 在镉浓度达25.0 mg·L-1时, 萌发率
最低, 为 89.5% (图 1)。这与前人在不同植物中的
图 1 不同浓度 CdCl2 处理的拟南芥种子萌发率
Fig.1 The gemination rate of Arabidopsis seeds in different
treatment concentrations of CdCl2
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甲基化减少的条带为 261 条。其中前 6 个浓度甲
基化增加和减少的条带分别为 88 和 87; 后 6 个浓
度分别为 207 和 184。由此可知, 高浓度处理的甲
基化增加和减少的条带数比低浓度变化幅度大。
这说明, 随着CdCl2浓度的增加镉的毒害作用增大,
表现为DNA甲基化增加和减少的条带数增多, 总的
表现为甲基化增加。由于增加了 IV 型带, 3 种类
型条带加起来的总条带大于实际条带数。CdCl2浓
度为7.5和20.0 mg·L-1时的甲基化增加的条带数最
多, 分别为 36和 37; CdCl2 浓度为 10.0和 15.0 mg·L-1
时的甲基化减少的条带数最多, 分别为 33 和 32
(图 3)。
表 2 同裂酶 HapII和 MspI的甲基化敏感性及
限制性谱带和带型归类
Table 2 The methylation-sensitive, restriction bands of HapII
and MspI and the classify of the band patterns
甲基化状态
内切酶活性 限制性带型
带型归类
HapII MspI H M
CCGG 有活性 有活性 + + I
C5mCGG 无活性 有活性 + + II
5hmCCGG 有活性 无活性 - - III
C5hmCGG
5mC5mCGG 无活性 无活性 - - IV
5mCCGG
　　表中 5hmC 表示 CCGG 位点 DNA 半甲基化, 即 DNA 单链发
生甲基化; H、M 分别表示 EcoRI/HapII 和 EcoRI/MspI 酶切扩
增产物。+: 有扩增产物; - : 无扩增产物。
图 2 幼苗期前 6 种浓度处理的 MSAP 带型
(EcoR-ACC/HapII-MspI-TCAA)
Fig.2 MSAP pattens of young seedlings treated
with six concentrations of CdCl2
WT : 野生型; 1 ~ 6 : CdCl 2 的处理浓度分别为 0 .5、1 .0、
1 .5、2 .0、2 .5、5 .0 mg· L -1。H : Ec o RI /H a p I I 酶切扩增产
物; M: EcoRI /MspI 酶切扩增产物。a: I 型带; b: II 型带; c: III
型带。
图 3 不同浓度 CdCl2 处理的 DNA甲基化
Fig.3 The DNA methylation in different treatment
concentrations of CdCl2
4 不同生长时期的甲基化
6 个处理在两个时期共扩增出 1 469 条带, 其
中不变的条带为1 105条, 甲基化增加的条带为203
条, 甲基化减少的条带为 227 条; 幼苗期甲基化增
加和减少的条带分别为 88 和 77, 在抽薹期分别为
115和 150。抽薹期甲基化减少的条带远大于甲基
化增加的条带, 而且每个处理几乎都是如此(图3)。
这说明抽薹期去除 CdCl2 的毒害作用后, 甲基化增
加的一些基因逐渐去甲基化而恢复正常。
重金属胁迫能引起水稻和小麦DNA甲基化水
平改变, 进而造成基因调控紊乱和蛋白质合成受抑
制。葛才林等(2002)研究发现, 重金属能明显导致
水稻和小麦叶片DNA的甲基化水平提高, 随离子浓
度的升高 5mC 水平也明显升高。Zhao 等(1997)研
究发现, 砷的甲基化作用能诱导整个基因组的低甲
基化状态且存在剂量和时间效应, 并且细胞中的S-
腺苷甲硫氨酸维持低水平。Sciandrello等(2004)认
为短期的砷暴露将对DNA有长期的影响, 造成整个
基因组的低甲基化, 这可能是造成基因不稳定的
因素之一。
DNA甲基化是一种共价化学修饰, 在DNA甲
基转移酶的作用下, 将甲基从供体S-腺苷甲硫氨酸
转加到胞嘧啶上的一种化学修饰过程。DNA 的甲
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基化并不改变基因的碱基序列, 而是通过影响基因
的表达影响其功能。基因组印记、X 染色体的失
活和许多肿瘤相关基因的失活都与基因启动子区
CpG 岛的甲基化有关。由于酶切位点的限制, 所
以只有在酶切位点的胞嘧啶碱基发生甲基化变化的
才能检测到, 而实际发生甲基化变化的位点可能高
于本实验的结果。
参考文献
葛才林, 杨小勇, 刘向农, 孙锦荷, 罗时石, 王泽港(2002). 重金属
图 4 不同生长时期 DNA的甲基化
Fig.4 The DNA methylation in different growth stages
对水稻和小麦 DNA 甲基化水平的影响. 植物生理与分子生
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