全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (3): 243~252 243
收稿 2013-09-29　　修定 2014-01-20
资助 国家基础研究项目(2011CB100702)和中国科学院知识创
新项目(KSCX2-EW-N-06)。
* 共同通讯作者(E-mail: lxu@bio.ecnu.edu.cn, Tel: 021-
54341012; E-mail: dzhang01@sibs.ac.cn, Tel: 021-54924075)。
禾谷镰孢菌果胶裂解酶PelA的生物学功能分析
姚昇华1,2, 贾雷杰2, 张晓伟2, 张栋2,*, 许玲1,*
1华东师范大学生命科学学院, 上海200241; 2中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 上海200032
摘要: 果胶裂解酶是果胶酶的重要成员之一, 能够通过β-消除作用, 催化降解(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸。本研究首次鉴定
出禾谷镰孢菌中的一个果胶裂解酶PelA, 并在体外检测了其生化特性。PelA基因(FGSG_02386)的cDNA被克隆并进行了原
核表达, 同时构建了单基因敲除突变体。将重组质粒pET-28a(+)-PelA转化蛋白表达菌株大肠杆菌BL21表达目的蛋白, 纯化
后的蛋白具有果胶裂解酶活性。酶活性测定结果显示, 该酶的活性受到外界环境因素如温度、钙离子浓度和pH条件的影
响, 其最适反应条件为50 ℃, CaCl2浓度0.5 mmol·L
-1, pH 8.5。在侵染小麦胚芽鞘时PelA单基因突变体的毒力较野生型菌株
并没有出现明显变化。
关键词: 果胶裂解酶; 禾谷镰孢菌; 小麦胚芽鞘
Biological Function Analysis of A Pectate Lyase PelA in Fusarium graminearum
YAO Sheng-Hua1,2, JIA Lei-Jie2, ZHANG Xiao-Wei2, ZHANG Dong2,*, XU Ling1,*
1School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China; 2Institute of Plant Physiology and Ecology,
Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China
Abstract: Pectate lyase can eliminate cleavage of (1→4)-α-D-galacturonan by β-elimination as a member of
pectinases. This study identified a pectate lyase, PelA, in Fusarium graminearum for the first time, and its
biochemical characteristics was verified in vitro. In this study, PelA was expressed in Escherichia coli and
knock-out mutants were constructed. Biochemical analysis showed that PelA has pectate lyase activity in vitro.
External environment such as temperature, calcium ion concentration and pH affected the enzyme activity, and
enzyme activity reached the highest at 50 ℃, 0.5 mmol·L-1 CaCl2 and pH 8.5. PelA knock-out strains didn’t
show significant difference in virulence from wild-type strains during infection of wheat coleoptiles.
Key words: pectate lyase; Fusarium graminearum; wheat coleoptile
分泌型细胞壁降解酶作为真菌侵染寄主时产
生的典型分泌型蛋白, 受到了许多科研工作者的
关注。研究发现, 腐生型真菌在侵染和定殖植物
寄主的过程中, 首先分泌一系列细胞壁降解酶, 使
寄主组织瓦解、细胞破裂, 这不仅为其大量繁殖
提供了所需的营养, 同时也有利于真菌向周围细
胞扩散(Annis和Goodwin 1997)。相反, 活体营养
型真菌则往往进行隐秘的侵染, 把对寄主的伤害
降到最低。近年来有关细胞壁降解酶基因的研究
扩充了人们对其功能的认识。Brito等(2006)发现灰
霉菌(Botrytis cinerea)中编码内切木聚糖酶的基因
XynllA在致病过程中起到重要的作用。在禾谷镰
孢菌中, 编码内切葡聚糖酶的基因FGSG_03624是
能引起植物组织坏死的因子 , 而不是毒力因子
(Sella等2013)。Zhang等(2012)挑选了禾谷镰孢菌
多个在寄主体内特异性上调表达的细胞壁降解酶
基因, 并对其进行单基因敲除突变, 结果显示编码
β-1,4-纤维素水解酶(1,4-β-cellobiosidase)的基因
FGSG_00571和编码β-1,3(4)-葡聚糖内切酶[endo-
1,3(4)-β-glucanase]的基因FGSG_00184的突变体在
侵染小麦胚芽鞘时致病力下降, 但是这些突变体
在小麦穗部的致病力与野生型无明显差别, 这就
说明禾谷镰孢菌的侵染具有组织特异性。在众多
植物细胞壁降解酶中, 果胶降解酶受到了极大的
关注, 这是由于它是真菌侵染宿主时大量产生的
典型的细胞壁降解酶, 它能够软化植物细胞壁并
且独立杀死植物细胞(Collmer和Keen 1986)。禾谷
研究报告 Original Papers
植物生理学报244
镰孢菌基因组注释(Ma等2010)显示其编码40个可
能以果胶为底物的酶类, 但这些果胶酶的生物活性
尚未见报道。
植物细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素
和果胶(Cosgrove 2005)。果胶广泛存在于高等植
物中, 是植物细胞间质和初生细胞壁的重要组分,
与纤维素及半纤维素一起构成一个阻挡外界的坚
韧屏障, 并在植物细胞组织中起着粘连作用(Carpita
和Gibeaut 1993; 李祖明等2007)。果胶分子是由不
同酯化程度的半乳糖醛酸以α-1,4-糖苷键聚合而
成, 它的主要成分包括同型半乳糖醛酸聚糖、木
聚糖半乳糖醛酸聚糖、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I和
鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II (Martens-Uzunova和Schaap
2009; Perez等2003)。果胶成分的复杂性预示着其
降解需要多种不同类型的酶, 而这些酶就统称为
果胶酶。果胶裂解酶(pectate lyase, Pel)是果胶酶
的重要组成部分, 能够催化降解(1→4)-α-D-聚半乳
糖醛酸, 通过β-消除作用, 在其非还原端产生带有
4-脱氧-α-D-半乳糖-4-烯醛酸基团的不饱和低聚糖
(Barras等1994; 邓伟科等2009; 王卫东和孙月娥
2006; Kashyap等2001)。它是一种能够降解植物细
胞壁、导致植物组织软化甚至死亡的解聚酶。
禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum, 有性态为
Gibberella zeae)是一种极具破坏性的植物病原真菌,
能够引起小麦、大麦、玉米和水稻等禾谷类作物
的穗腐、根腐、苗枯、茎腐和颈腐等病害(Proctor
等1997; Goswami和Kistler 2004; Stephens等2008;
Walter等2010; Henkes等2011), 作为一种腐生型真
菌, 其在侵染寄主时会分泌大量的细胞壁降解酶以
破坏植物细胞(Zhang等2012)。为探究果胶裂解酶
对其侵染寄主的作用, 本研究以侵染小麦胚芽鞘时
诱导表达的基因PelA (FGSG_02386)为实验对象,
检测了PelA的多项酶促反应条件, 以及该基因突变
体在小麦胚芽鞘上的致病力变化, 对了解禾谷镰孢
菌果胶裂解酶的生物学功能具有重要参考价值。
材料与方法
1 实验材料
禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)株NRRL
31084 (PH-1)由普渡大学(Purdue University)许金荣
教授惠赠。用于重组质粒构建的菌株为大肠杆菌
DH5α, 蛋白表达菌株为BL21。选用广泛种植于我
国河南省境内的冬小麦(Triticum aestivum) ‘中原
98-68’作为侵染材料。蛋白表达载体为pET-28a(+)。
V8培养基(1 L)含163 mL V8蔬菜汁、1.0 g
CaCO3、15 g琼脂粉。配制绿豆培养基时, 用大火
将1 L水加热至沸腾, 加入40 g绿豆, 继续大火煮沸
10 min; 待静止20 min后, 用单层纱布过滤, 定容至
1 L, 分装在锥形瓶中进行高压灭菌。LB培养基(1 L)
含10 g蛋白胨、5 g酵母提取液、5 g NaCl, 定容至
1 L, 并调节pH至7.0。LB固体培养基中加入1.5%
的琼脂粉, 高压灭菌20 min。
2 实验方法
2.1 PCR扩增PelA cDNA序列
PelA cDNA序列来源于FGDB (http://mips.
helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/)。利用
表1 实验引物汇总表
Table 1 List of primers used
基因名称 引物名称 引物序列(5→3)
FGSG_02386 上游-F GCGCCACCAGGTATCGGCTC
上游-R TAGCCACGATTCGAAGCCGCTGGACGCTCAGGGTAGTGGC
下游-F CGCATTGAATTGAAAAAGGAAGAGTATGTTGATGGTGTTGGTTGTTGTAGAAA
下游-R GGATGTAAAGTCGGGATGAACC
引物-U GCCACTACCCTGAGCGTCCA
引物-D TTTCTACAACAACCAACACCATCAA
潮霉素基因(HYG) HY GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT
YG GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA
FGSG_02386 (半定量引物) 上游引物 TCATCCAGCACAACGGTCTC
下游引物 TACGGGTGCCCATCTTCTTG
FGSG_02386 [用于pET-28a(+)] 上游引物 GGAATTCACTCCCCAGGGCAATGTCA
下游引物 ATTTGCGGCCGCTTAGCAAGAGCTGACGGAAGAG
姚昇华等: 禾谷镰孢菌果胶裂解酶PelA的生物学功能分析 245
SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)
在线预测基因的信号肽序列。以禾谷镰孢菌
cDNA为模板, 设计上游和下游引物(表1), 扩增出
不包含信号肽序列的目的基因。预计扩增长度约
为750 bp。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 割
胶回收后体外连接到pET-28a(+)载体中 , 转化
DH5α感受态, 挑选阳性克隆, 由上海博尚生物有
限公司对插入片段进行双向测序。
2.2 PelA的表达、纯化及活性检测
将重组质粒pET-28a(+)-PelA转化大肠杆菌
BL21 (Novagen), 挑选单克隆接种到含有50 mg·L-1
卡那霉素的5 mL LB培养基中进行过夜培养, 然后
将工程菌接种到200 mL含有卡那霉素的LB培养基
中, 培养至OD600值为0.6时, 加入诱导剂IPTG至终
浓度为5 μmol·L-1, 18 ℃培养8 h, 每2 h收集菌液2
mL, 用以检测总蛋白表达情况。离心收集到的菌
液, 弃上清, 将沉淀重悬于溶解缓冲液(50 mmol·L-1
NaH2PO4、300 mmol·L
-1 NaCl、10 mmol·L-1咪唑,
pH 8.0), 冰浴中超声破碎, 离心后上清液用于后续
Ni柱纯化蛋白。纯化蛋白所用的洗涤缓冲液含50
mmol·L-1 NaH2PO4、300 mmol·L
-1 NaCl、30
mmol·L-1咪唑, 调节pH至8.0; 洗脱缓冲液含50
mmol·L-1 NaH2PO4、300 mmol·L
-1 NaCl、250
mmol·L-1咪唑, 调节pH至8.0。参照Macmillan和
Vaughn (1964)及Collmer等(1988)的方法检测PelA
活性, 所用底物为多聚半乳糖醛酸(polygalactur-
onan, PGA, Sigma); 反应体系为500 μL, 含50 μL
0.378 mg·mL-1的纯化蛋白及450 μL反应基质; 反应
基质中包含0.05 mmol·L-1 Tris-HCl、0.2% PGA和
不同浓度的CaCl2。
2.3 禾谷镰孢菌孢子的培养
(1)在使用前, 把保存在–80 ℃、浓度为106
个·mL-1的孢子悬浮液放在室温至融化, 用移液器
吸取5 μL, 滴到V8固体培养基上培养约3~5 d; (2)
把含有菌丝的培养基转接到100~200 mL绿豆培养
基中, 25 ℃黑暗培养3~5 d (摇床转速150 r·min-1);
(3)锥形瓶中的菌液使用单层纱布过滤到250 mL离
心瓶中, 8 000×g离心10 min; (4)弃上清液, 使用无
菌水洗涤孢子, 吸至1.5 mL的Eppendorf管中, 12 750×g
离心30 s; (5)弃上清液, 加无菌水, 混匀; (6)血球计
数板计数, 孢子的浓度稀释到106 mL-1。
2.4 基因敲除
选用Split-marker重组技术(Catlett等2002)对
禾谷镰孢菌的特定基因进行敲除, 将目的基因的
上下游近1 000 bp的片段与潮霉素片段相融合, 两
段潮霉素片段之间具有近300 bp的重叠序列。原
生质体转化采用 P E G介导的方法 (袁婷露等
2008)。用PCR和RT-PCR的方法对转化子进行验
证, 所需的引物序列见表1。
2.5 小麦胚芽鞘侵染及病斑统计方法
按照Zhang等(2012)方法, 在小麦真叶尚未长
出时将胚芽鞘剪去2~3 mm, 直接滴加5 μL新鲜配
制的浓度为106 mL-1的孢子悬浮液。将小麦置于光
照培养箱内, 培养条件为24 ℃、相对湿度99%。
侵染7 d后, 拍照记录病斑生成情况, 并用Image J软
件测量和统计病斑长度。
2.6 RT-PCR检测目的基因
检测材料为侵染3 d的小麦胚芽鞘, RNA的提
取所采用的是TaKaRa公司的Trizol法。逆转录选
用M-MLV逆转录酶(TaKaRa)。RT-PCR反应体系
为20 μL, 含KOD-Fx (Toyobo) 0.2 μL、缓冲液10
μL、引物各1 μL、dNTPs 2 μL、适量模板及水。
以Tublin为内参基因, PCR反应的退火温度为55 ℃,
延伸温度及时间分别为68 ℃和30 s, 循环数为30。
PelA的PCR循环数为32。
实验结果
1 禾谷镰孢菌在侵染小麦胚芽鞘时上调表达了果
胶裂解酶
已发表的芯片数据(Zhang等2012)显示, 禾谷镰
孢菌在侵染小麦胚芽鞘16和64 h时, 明显上调表达
了各类植物果胶降解酶如主链降解酶、支链降解
酶及修饰残基降解酶的编码基因(图1-A)。在这56
个上调表达的果胶降解酶基因中, 有一个属于果胶
裂解酶第三家族的PelA在侵染16及64 h时都显示了
明显高于同功能基因的表达值(图1-B和表2)。根据
Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy, www.cazy.org)
预测, 它编码果胶主链内切酶。利用ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)在线将其
与其他物种的果胶裂解酶进行序列比对, 结果显示,
该果胶裂解酶与尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)和枯草杆菌(Bacillus
植物生理学报246
表2 禾谷镰孢菌果胶裂解酶基因表达情况
Table 2 The expression patterns of genes encoding pectate lyase in F. graminearum

基因名称 家族
不同时期基因的相对表达水平
菌丝 孢子 侵染16 h 侵染40 h 侵染64 h 侵染10 d
FGSG_02386 PL3 16 16 481 73 323 66
FGSG_02977 PL3 9 9 90 10 25 20
FGSG_10004 PL3 11 10 10 10 10 12
FGSG_03713 PL3 11 9 10 10 11 17
FGSG_03909 PL3 7 8 9 8 7 13
FGSG_11094 PL3 8 7 8 12 8 12
FGSG_09291 PL1 9 7 39 17 139 38
FGSG_11163 PL1 5 6 6 6 16 6
FGSG_03908 PL1 5 6 16 7 6 6
FGSG_04430 PL1 5 5 6 12 6 11
FGSG_07794 PL1 33 8 32 8 8 13
FGSG_03131 PL9 7 7 8 10 9 12
　　表达值来自于Zhang等(2012)芯片数据。
subtilis)的果胶裂解酶具有高度的序列同源性, 而与
棒曲霉(Aspergillus clavatus)的果胶裂解酶存在较大
差异(图2)。利用邻接法(neighbor-joining), 将PelA
与来自于其他物种的第三家族果胶裂解酶和禾谷
镰孢菌中两个分别属于第一及第九家族的果胶裂
解酶PelB (FGSG_04430)和PelC (FGSG_03131)进行
蛋白进化树构建, 结果显示, 真菌中的果胶裂解酶
第三家族能够聚类在一起, 禾谷镰孢菌中的PelB及
PelC则在亲缘关系上与第三家族的PelA较远, 而来
自线虫的果胶裂解酶能够聚类在一起(图3)。
2 原核表达PelA
含重组表达质粒pET-28a(+)-PelA的大肠杆菌
BL21经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析表明, 较诱导
之前有明显增加的蛋白条带, 且分子量大小与预
期一致; 纯化过后的样品也显示单一的条带(图
4-A), 大小亦与预测相一致。用His标签的抗体对
纯化后的蛋白进行Western blot检测, 结果显示目
标蛋白有表达(图4-B)。
3 环境因素对PelA活性的影响
采用温度、CaCl2浓度及pH三个不同的环境
因素, 探究环境因素对PelA活性的影响。以反应
最初的状态作为对照, 30 min之后测定A235的值。
结果显示, 在50 ℃时, 酶活性达到最大值, 在70 ℃
时, 该酶几乎丧失活性(图5-A), 而在自然发病时常
见的30 ℃左右也有较高的活性。另外, 实验结果
还显示, PelA的作用必须依赖钙离子, 当钙离子浓
度为0.5 mmol·L-1时, 酶活性达到最大值; 而浓度为
1.5或3.0 mmol·L-1时, 酶活性几乎下降一半(图
5-B)。由图5-C可见, 当pH为8.5时, 酶活性达到最
大值, 低于或高于这个值时, 酶活性都受到抑制。
图1 果胶降解酶基因在不同时期的表达变化
Fig.1 The expression patterns of genes involved in pectin degrading
表达值来自于Zhang等(2012)芯片数据。hpi: hours post inoculation。
姚昇华等: 禾谷镰孢菌果胶裂解酶PelA的生物学功能分析 247
4 PelA单基因突变体的构建及致病性检测
本研究采用的基因敲除策略如图6-A所示。
采用PCR (图6-B)及RT-PCR (图6-C)分别检测转化
子的基因组DNA和侵染寄主时PelA的表达情况,
最终得到3株突变体。体外观察突变体的平板生
长情况及孢子形态, 均未发现异常(图7)。对3株突
变体进行致病力的检测, 结果显示其致病力较野
生型菌株并未出现明显变化(图8)。
讨　　论
为了破坏寄主细胞, 禾谷镰孢菌在侵染时需
要分泌大量的果胶酶, 软化寄主组织结构, 从而帮
助其在寄主细胞内及细胞间隙更好地生长(Zhang
等2012)。本研究主要针对一个在寄主体内特异性
高表达的果胶裂解酶PelA, 通过蛋白质序列分析,
发现该蛋白属于果胶裂解酶第三家族, 且序列在
真菌中较为保守。通过构建蛋白进化树, 发现真
菌中第三家族的果胶裂解酶能够聚类, 来自线虫
的也能够聚类, 且来自真菌与线虫的第三家族果
胶裂解酶位于不同分支上; 而禾谷镰孢菌中属于
不同家族的PelB、PelC与PelA有明显区分。另外,
体外原核表达PelA及酶促反应条件的检测结果显
图2 FGPelA与其他物种果胶裂解酶的蛋白序列同源性分析
Fig.2 Alignment of the deduced amino acid sequences of FGPelA and other pectate lyases
FGPelA: 禾谷镰孢菌, XP_382562.1; FOPelE: 尖孢镰孢菌, ENH74438.1; MGPelA: 稻瘟病菌, XP_003711703.1; BSPelA: 枯草杆菌,
YP_007428439.1; ACPelA: 棒曲霉, XP_001276684.1。
植物生理学报248
图3 基于邻接法构建的果胶裂解酶蛋白进化树
Fig.3 Unrooted phylogenetic tree of selected pectate lyase proteins constructed by neighbor-joining analysis
FG: 禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum); FO: 尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum); AC: 棒曲霉(Aspergillus clavatus); MG: 稻瘟病菌
(Magnaporthe oryzae); NH: 里氏木霉(Nectria haematococca); AM: 奇异丝束放线菌(Actinosynnema mirum); SA: 除虫链霉菌(Streptomyces
avermitilis); SC: 天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor); BM: 拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus); HA: 禾谷孢囊线虫(Heterodera
avenae); HS: 甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii); GT: 烟草球孢囊线虫(Globodera tabacum tabacum); GR: 马铃薯金线虫(Globodera
rostochiensis); BS: 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis); PF: 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。括号内为GenBank登录号。
图4 重组PelA蛋白的SDS-PAGE及Western blot检测
Fig.4 SDS-PAGE and Western blot of PelA
A: SDS-PAGE。1~5: 未诱导及诱导2、4、6、8 h的总蛋白; 6: 蛋白质分子量标准; 7: 纯化后的蛋白。B: Western blot。1: PelA蛋白; 2:
蛋白质分子量标准。
姚昇华等: 禾谷镰孢菌果胶裂解酶PelA的生物学功能分析 249
示, 该酶的最适反应温度为50 ℃, 最适钙离子浓度
为0.5 mmol·L-1, 且当pH为8.5时酶呈现最大活性。
这些理化性质皆与Kikuchi等(2006)及Zhang等
(2013)所报道的果胶裂解酶相似, 证明该酶是一个
偏好高温及碱性环境的蛋白。同时, 病原真菌广
泛的寄主侵染性迫使它们必须适应多样的外界环
境, pH也是一个极为重要的影响因素, 因为其可以
直接影响到分泌出去的致病因子的活性, 从而决
定侵染的成败(Eshel等2002; Prusky等2001, 2004;
Rollins 2003; Yakoby等2000)。PelA随着禾谷镰孢
图5 不同温度、CaCl2浓度及pH对纯化后的重组PelA蛋白相对活性的影响
Fig.5 Effects of different temperatures, CaCl2 concentrations and pH on the relative enzyme activity of
purified recombination PelA protein
将最大酶活性值设置为100%。
图6 PelA敲除突变体的构建和鉴定
Fig.6 Construction and validation of PelA knock-out mutants
A: 实验所用的同源重组策略及所需引物的名称和位置, 同一种图案代表相同的序列片段。B: PCR验证突变体, 选用引物为引物-U和
引物-D。M: 100 bp Plus marker; WT: 禾谷镰孢菌野生型菌株; 1~3: 3株突变体。C: RT-PCR检测野生型菌株及突变体菌株在侵染小麦胚芽
鞘时PelA的表达情况。WT: 禾谷镰孢菌野生型菌株; 1~3: 3株突变体。
植物生理学报250
菌侵染寄主而被分泌到周围的环境中, 此时植物
细胞中的温度、钙离子浓度及pH都影响着该酶的
活性。同时, 随着禾谷镰孢菌侵染进程的推进, 植
物与真菌间的相互作用更为剧烈, 植物细胞内的
环境也会发生不可知的变化, 而这也影响着PelA
的活性, 从而影响该酶在禾谷镰孢菌侵染寄主过
程中所扮演的角色。值得思考的是, 禾谷镰孢菌
在侵染寄主时上调表达的那些果胶降解酶又是否
具有相似的最适酶促反应条件, 若是, 那是否预示
着受到真菌侵染后植物细胞中的环境会发生剧烈
变化, 且这些剧烈变化又是如何产生的, 这些问题
都有待更深入的研究。
本研究运用单基因突变的方法, 敲除了一个
在寄主体内特异性上调表达的果胶裂解酶基因
PelA。对突变体进行致病力检测, 发现其在小麦胚
芽鞘上致病力与野生型菌株无差别。据研究发现,
腐生型真菌禾谷镰孢菌的基因组中具有134个可
能的编码植物细胞壁降解酶的基因(Ma等2010),
图7 ΔpelA突变体的菌丝生长及孢子形态
Fig.7 The images of the mycelia growth and spores of ΔpelA
WT: 禾谷镰孢菌野生型菌株; 1~3: 3株ΔpelA突变体。真菌在完全培养基上培养4 d。标尺=100 μm。
图8 ΔpelA突变体在小麦胚芽鞘上的致病力(A)及对其产生病斑的统计(B)
Fig.8 Infection assay of ΔpelA on wheat coleoptiles (A) and statistic analysis of lesion size (B)
WT: 禾谷镰孢菌野生型菌株; 1~3: 3株ΔpelA突变体。
姚昇华等: 禾谷镰孢菌果胶裂解酶PelA的生物学功能分析 251
在半活体营养型的稻瘟病菌中有138个(Dean等
2005), 而活体营养型真菌玉米黑粉病菌(Ustilago
maydis)的基因组中只有33个(Kamper等2006)。本
研究对禾谷镰孢菌基因组中预测的果胶酶编码基
因进行了进一步的分析, 发现禾谷镰孢菌基因组
中共有12个可能的果胶裂解酶编码基因, 其中属
于第三家族的有6个, 在这6个基因中, 有一个基因
FGSG_02977的表达量较高, 而这就很可能弥补了
突变体中PelA的作用。面对在腐生型菌中大量冗
余的细胞壁降解酶, 找寻新型有效的多基因突变
手段或调节细胞壁降解酶编码基因的调控因子,
为研究细胞壁降解酶基因在禾谷镰孢菌侵染寄主
时的功能提供了方向。
目前报道分泌果胶裂解酶的菌有: 假单胞菌
(Pseudomonas syringae) (Bauer和Collmer 1997)、
菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi) (Keen和Tamaki
1986; Tardy等1997)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia
carotovora) (Lei等1987; Zucker和Hankin 1970)、辣
椒疫霉(Phytophthora capsici) (Jia等2009)和终极腐
霉(Pythium) (Campion等1997)等。而在禾谷镰孢菌
中, Wanjiru等(2002)通过免疫金标和电镜观察的结
果表明, 小麦穗部侵染点附近的细胞壁成分(纤维
素和果胶等)在禾谷镰孢菌入侵后含量降低, 提示
包含果胶降解酶在内的多种细胞壁降解酶在侵染
中起作用, 但是禾谷镰孢菌具体编码哪些细胞壁
降解酶在侵染中发挥作用仍不清楚。根据Zhang
等(2012)的芯片数据, PelA在侵染小麦胚芽鞘16及
64 h的时候出现表达高峰。本研究中通过芯片数
据分析、进化分析以及基因突变体表型分析, 探
究了PelA的功能, 并且原核表达了该蛋白, 检测了
其多项生化特性, 为真菌侵染作物的抗病机理研
究提供了依据及潜在的生物防治靶位点。
参考文献
邓伟科, 刘恩平, 郭安平, 高秋芳, 郭运玲, 贺立卡(2009). 一株菠萝
叶纤维脱胶菌产果胶酶的相关性质研究. 广东农业科学, (9):
190~193
李祖明, 何立千, 李鸿玉, 白志辉, 叶磊, 荣瑞芬(2007). 碱性果胶酶
的应用进展. 食品科技, (8): 1~4
王卫东, 孙月娥(2006). 果胶酶及其在果蔬汁加工中的应用. 食品研
究与开发, 27 (11): 222~226
袁婷璐, 张彦, 於新建, 曹秀云, 张栋(2008). 禾谷镰孢转化体系的优
化. 植物生理学报, 44 (2): 251~256
Annis SL, Goodwin PH (1997). Recent advances in the molecular
genetics of plant cell wall-degrading enzymes produced by plant
pathogenic fungi. Eur J Plant Pathol, 103 (1): 1~14
Barras F, van Gijsegem F, Chatterjee AK (1994). Extracellular
enzymes and pathogenesis of soft-rot Erwinia. Ann Rev
Phytopathol, 32 (1): 201~234
Bauer DW, Collmer A (1997). Molecular cloning, characterization,
and mutagenesis of a pel gene from Pseudomonas syringae pv.
lachrymans encoding a member of the Erwinia chrysanthemi
PelADE family of pectate lyases. Mol Plant Microbe Interact, 10
(3): 369~379
Brito N, Espino JJ, González C (2006). The endo-β-1,4-xylanase
Xyn11A is required for virulence in Botrytis cinerea. Mol Plant
Microbe Interact, 19 (1): 25~32
Carpita NC, Gibeaut DM (1993). Structural models of primary cell
walls in flowering plants: consistency of molecular structure
with the physical properties of the walls during growth. Plant J,
3 (1): 1~30
Campion C, Massiot P, Rouxel F (1997). Aggressiveness and
production of cell-wall degrading enzymes by Pythium violae,
Pythium sulcatum and Pythium ultimum, responsible for cavity
spot on carrots. Eur J Plant Pathol, 103 (8): 725~735
Catlett NL, Lee BN, Yoder OC, Turgeon BG (2002). Split-marker
recombination for efficient targeted deletion of fungal genes.
Fungal Genet Newsl, 50 (49): 9~11
Collmer A, Keen NT (1986). The role of pectic enzymes in plant
pathogenesis. Annu Rev Phytopathol, 24 (1): 383~409
Collmer A, Ried JL, Mount MS (1988). Assay methods for pectic
enzymes. Method Enzymol, 161: 329~335
Cosgrove DJ (2005). Growth of the plant cell wall. Nat Rev Mol Cell
Biol, 6 (11): 850~861
Dean RA, Talbot NJ, Ebbole DJ, Farman ML, Mitchell TK, Orbach
MJ, Michael T, Resham K, Xu JR, Pan H et al (2005). The
genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.
Nature, 434 (7036): 980~986
Eshel D, Miyara I, Ailinng T, Dinoor A, Prusky D (2002). pH
regulates endoglucanase expression and virulence of Alternaria
alternate in persimmon fruits. Mol Plant Microbe Interact, 15 (8):
774~779
Goswami RS, Kistler HC (2004). Heading for disaster: Fusarium
graminearum on cereal crops. Mol Plant Pathol, 5 (6): 515~525
Henkes GJ, Jousset A, Bonkowski M, Thorpe MR, Scheu S, Lanoue
A, Schurr U, Rose US (2011). Pseudomonas fluorescens CHA0
maintains carbon delivery to Fusarium graminearum-infected
roots and prevents reduction in biomass of barley shoots through
systemic interactions. J Exp Bot, 62 (12): 4337~4344
Jia YJ, Feng BZ, Sun WX, Zhang XG (2009). Polygalacturonase,
pectate lyase and pectin methylesterase activity in pathogenic
strains of Phytophthora capsici incubated under different
conditions. J Phytopathol, 157 (10): 585~591
Kamper J, Kahmann R, Bolker M, Ma LJ, Brefort T, Saville BJ, Flora
B, James WK, Scott EG, Olaf M et al (2006). Insights from the
genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.
Nature, 444 (7115): 97~101
Kashyap DR, Vohra PK, Chopra S, Tewari R (2001). Applications
of pectinases in the commercial sector: a review. Bioresource
植物生理学报252
Technol, 77 (3): 215~227
Keen NT, Tamaki S (1986). Structure of two pectate lyase genes from
Erwinia chrysanthemi EC16 and their high-level expression in
Escherichia coli. J Bacteriol, 168 (2): 595~606
Kikuchi T, Shibuya H, Aikawa T, Jones JT (2006). Cloning and
characterization of pectate lyases expressed in the esophageal
gland of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus.
Mol Plant Microbe Interact, 19 (3): 280~287
Lei SP, Lin HC, Wang SS, Callaway J, Wilcox G (1987).
Characterization of the Erwinia carotovora pelB gene and its
product pectate lyase. J Bacteriol, 169 (9): 4379~4383
Ma LJ, Van Der Does HC, Borkovich KA, Coleman JJ, Daboussi
MJ, Di Pietro A, Marie D, Michael F, Manfred G, Bernard H et
al (2010). Comparative genomics reveals mobile pathogenicity
chromosomes in Fusarium. Nature, 464 (7287): 367~373
Macmillan JD, Vaughn RH (1964). Purification and properties of a
polygalacturonic acid-trans-eliminase produced by Clostridium
multifermentans. Biochemistry, 3: 564~572
Martens-Uzunova ES, Schaap PJ (2009). Assessment of the pectin
degrading enzyme network of Aspergillus niger by functional
genomics. Fungal Genet Biol, 46 (1): 170~179
Perez S, Rodriguez-Carvajal MA, Doco T (2003). A complex plant
cell wall polysaccharide: rhamnogalacturonan II. A structure in
quest of a function. Biochimie, 85 (1): 109~121
Proctor RH, Hohn TM, McCormick SP (1997). Restoration of wild-
type virulence to Tri5 disruption mutants of Gibberella zeae via
gene reversion and mutant complementation. Microbiology, 143
(8): 2583~2591
Prusky D, McEvoy JL, Leverentz B, Conway WS (2001). Local
modulation of host pH by Colletotrichum species as a
mechanism to increase virulence. Mol Plant Microbe Interact, 14
(9): 1105~1113
Prusky D, McEvoy JL, Saftner R, Conway WS, Jones R (2004).
The relationship between host acidification and virulence of
Penicillium spp. on apple and citrus fruit. Phytopathology, 94 (1):
44~51
Rollins JA (2003). The Sclerotinia sclerotirum pac1 gene is required
for sclerotial development and virulence. Mol Plant Microbe
Interact, 16 (9): 785~795
Sella L, Gazzetti K, Faoro F, Odorizzi S, DOvidio R, Schäfer W,
Favaron F (2013). A Fusarium graminearum xylanase expressed
during wheat infection is a necrotizing factor but is not essential
for virulence. Plant Physiol Bioch, 64: 1~10
Stephens AE, Gardiner DM, White RG, Munn AL, Manners JM
(2008). Phases of infection and gene expression of Fusarium
graminearum during crown rot disease of wheat. Mol Plant
Microbe Interact, 21 (12): 1571~1581
Tardy F, Nasser W, Robert-Baudouy J, Hugouvieux-Cotte-Pattat
N (1997). Comparative analysis of the five major Erwinia
chrysanthemi pectate lyases: enzyme characteristics and potential
inhibitors. J Bacteriol, 179 (8): 2503~2511
Walter S, Nicholson P, Doohan FM (2010). Action and reaction of
host and pathogen during Fusarium head blight disease. New
Phytol, 185 (1): 54~66
Wanjiru WK, Kang ZS, Buchenauer H (2002). Importance of cell wall
degrading enzymes produced by Fusarium graminearum during
infection of wheat heads. Eur J Plant Pathol, 108 (8): 803~810
Yakoby N, Kobiler I, Dinoor A, Prusky D (2000). pH regulation of
pectate lyase secretion modulates the attack of Colletotrichum
gloeosporioides on avocado fruits. App Environ Microb, 66 (3):
1026~1030
Zhang C, Yao J, Zhou C, Mao L, Zhang G, Ma Y (2013). The alkaline
pectate lyase PEL168 of Bacillus subtilis heterologously
expressed in Pichia pastoris is more stable and efficient for
degumming ramie fiber. BMC Biotechnol, 13 (1): 26
Zhang XW, Jia LJ, Zhang Y, Jiang G, Li X, Zhang D, Tang WH (2012).
In planta stage-specific fungal gene profiling elucidates the
molecular strategies of Fusarium graminearum growing inside
wheat coleoptiles. Plant Cell, 24 (12): 5159~5176
Zucker M, Hankin L (1970). Regulation of pectate lyase synthesis in
Pseudomonas fluorescens and Erwinia carotovora. J Bacteriol,
104 (1): 13~18