全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 10期, 2010年 10月1040
收稿 2010-07-01 修定 　2010-09-14
资助 广东省博士启动基金(05300955)和广东省自然科学基金
项目(815106420 1000060)。
* 通讯作者(E-mail: eeliu70@163.com; Tel: 020-85280194)。
草酸氧化酶在水稻胚芽鞘衰老中的作用
张建军, 赖宇雄, 刘娥娥 *, 彭新湘
华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室, 广州 510642
提要: 草酸氧化酶(OxO)催化草酸氧化产生CO2和H2O2, 其在植物发育及防御过程中可能具有重要作用。本文以水稻品种
‘湘糯 1号 ’ (‘Xiangnuo 1’)为材料, 对胚芽鞘中的OxO及其生理功能进行了研究。结果表明, 胚芽鞘中的H2O2含量在其衰
老时增加; OxO活性在浸种后96 h时较低, 之后也迅速增加, 在240 h达到最高; 而可溶性蛋白、O2－· 和草酸含量以及过氧化
氢酶(CAT)活性则随着胚芽鞘的衰老迅速降低。由于H2O2能够诱导细胞死亡, 推测OxO可能通过降解草酸产生H2O2参与
胚芽鞘的衰老。
关键词: 草酸氧化酶; 胚芽鞘; 衰老; 水稻
Function of Oxalate Oxidase (OxO) during Coleoptile Senescence in Rice (Oryza
sativa L.)
ZHANG Jian-Jun, LAI Yu-Xiong, LIU E-E*, PENG Xin-Xiang
Laboratory of Molecular Plant Physiology, College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642,
China
Abstract: Oxalate oxidase (OxO; EC1.2.3.4) catalyzes oxidation of oxalate and yields CO2 and H2O2. It may
play important roles in plant growth and defense. In this study, OxO activity, oxalate content and H2O2 produc-
tion were detected during senescence of coleoptiles in the rice (Oryza sativa) ‘Xiangnuo 1’ to analysis the
possible functions of OxO in senescence of coleoptiles. The results showed that H2O2 content was enhanced
with the senescence of coleoptiles. OxO activity was very low at 96 h after imbibition, and then increased
significantly and with a maximum at 240 h. Conversely, the levels of soluble protein, oxalate, O2·¯ and catalase
(CAT) activity in coleoptiles were the highest at 96 h, and then decreased. It suggested that OxO might be
involved in the senescence of coleoptiles in rice by catalyzing the oxidation of oxalate.
Key words: oxalate oxidase; coleoptile; senescence; rice
草酸氧化酶(oxalate oxidase, OxO; EC1.2.3.4)
催化草酸氧化产生 CO2和H2O2, 是萌发素(germin)
家族的成员。而萌发素是小麦萌发早期合成的蛋
白, 1993年, Lane等(1993)发现萌发素具有OxO活
性, 推测其降解草酸产生的H2O2可能参与细胞壁组
分的交联。1998年, Caliskan和 Cuming (1998)发
现在小麦(Triticum aestivum)种子萌发过程中, OxO
总是位于胚根鞘、胚芽鞘、盾片和维管束这些生
长受限制的组织, 认为OxO降解草酸产生的H2O2
可能通过参与细胞壁组分的交联来终止细胞生长。
后来, Lane (2000)观察到小麦胚中萌发素的表达总
是与包被组织和分化末期的维管组织有联系, 于是
推测OxO在程序性细胞死亡(programmed cell death,
PCD)中具有一定的作用。此外, 研究还发现黑麦草
(Lolium perenne)的叶片受到伤害和叶鞘衰老都可诱
导OxO的表达(Le Deunff等 2004); 铝可诱导大麦
(Hordeum vulgare)根中OxO活性增加(Tamas等
2004), OxO产生的H2O2可能参与铝诱导的大麦根
边缘细胞的死亡(Tamas等 2005); 白粉病诱导的
OxO可能是过敏反应中H2O2的一个来源, 其可能在
调节过敏反应中具有重要作用(Zhou等 1998)。现
已有不少直接的证据表明OxO在抵抗病原菌入侵
中具有一定的作用(Donaldson等 2001; Hu等 2003;
Dong等2008), 而且Hu等(2003)发现过量表达OxO
的植株中H2O2和水杨酸(salicylic acid, SA)的含量
植物生理学通讯 第 46卷 第 10期, 2010年 10月 1041
及防御基因的转录皆提高。但目前对OxO确切的
功能仍不清楚(Lou和 Baldwin 2006)。
在禾本科植物中, 胚芽鞘不但能够保护真叶抵
抗土壤压力和其他物理胁迫, 还能够为正在发育的
组织提供营养物质, 它是水稻萌发后第一个衰老的
器官。我们在实验过程中发现, 水稻萌发时, OxO
活性随着胚芽鞘的衰老而提高。由于OxO降解草
酸产生H2O2, 同时引起 Ca2+的释放(Lane等 1993);
而H2O2能够诱发PCD (Dat等2003; Yoda等2006),
Ca2+则是 PCD过程信号途径中的成员(Pennel和
Lamb 1997)。于是我们推测水稻萌发过程中胚芽
鞘中的OxO可能通过降解草酸参与了胚芽鞘衰老,
本文对此进行了探讨。
材料与方法
1 材料培养
先用 5%次氯酸钠对水稻(Oryza sativa L.)品
种 ‘湘糯 1号 ’ (‘Xiangnuo 1’)的种子消毒 10 min,
接着用自来水冲洗 3~5次, 然后浸种, 10 h后取出,
转入垫有湿润滤纸的培养皿中, 置于 28 ℃恒温培
养箱暗培养至浸种后的 96、14 4、19 2、2 40、
288 h分别取样测定。其中H2O2和O2－· 的原位检测
每次所取胚芽鞘至少为5个, 其他指标的测定每次
取样重复为3个; 用于草酸测定的样品每份为0.2 g,
其他约为 0.1 g。
2 方法
2.1 H2O2和O2－· 的原位检测 H2O2的分析参考Thordal-
Christensen等(1997)的方法。将不同发育时期的
水稻胚芽鞘浸泡在 0.5 mg·mL-1的 3,3-二氨基联苯
胺(3,3-diaminobenzidine, DAB)溶液(pH 3.8)中, 室
温下放置, 直到褐红色出现。O2－· 的检测参考May
等(1996)的方法。将不同发育时期的胚芽鞘置于
氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium blue chloride,
NBT)染色液(含 0.5% NBT、10 μmol·L-1还原型烟
酰胺腺嘌呤二核苷磷酸和 10 μmol·L-1乙二胺四乙
酸的 10 mmol·L-1 pH 7.8磷酸缓冲液)中, 室温下放
置至颜色出现。
2.2 可溶性蛋白及酶的提取和测定 OxO的提取以
40 mmol·L-1 pH 3.5的琥珀酸缓冲液作为提取液, 按
1:6 (W/V)的比例加入研磨, 于4 ℃下14 300×g离心
15 min, 分别收集上清液和沉淀, 用于测定OxO活
性。可溶性蛋白和过氧化氢酶(catalase, CAT)用50
mmol·L-1 pH 7.8磷酸缓冲液提取, 按 1:10 (W/V)的
比例加入研磨, 然后于4 ℃下14 300×g离心15 min,
收集上清液用于测定蛋白含量及 CAT活性。
OxO活性测定参考Zhang等(1996)的方法。1
mL反应液中含 0.8 mL显色液, 5 U辣根过氧化物
酶(peroxidase, POD), 1.6 μmol草酸, 用草酸启动反
应, 对照的反应液中不加草酸。以每分钟每克干重
材料降解草酸产生H2O2的微摩尔数表示酶活性大
小。配制显色液时, 先配制含 75% (V/V)乙醇的 50
mmol·L-1琥珀酸缓冲液(pH 3.8), 临反应前取需要量
的上述缓冲液, 加入显色剂 4-氨基氨替吡啉(终浓
度 100 μg·mL-1)和N,N-二甲基苯胺(0.25 μL·mL-1)。
可溶性蛋白含量测定参考 Bradford (1976)的方法。
CAT活性测定参考 Chance和Maehly (1955)的方
法。取适量酶液加入含 0.06% H2O2的 50 mmol·L-1
磷酸缓冲液(pH 7.0)中, 在 240 nm处测定吸光值的
变化。定义在测定条件下每分钟吸光值下降 0.01
所需的酶量为 1 U。
2.3 草酸含量的测定 草酸的提取和测定参考 Liu
等(2009)的方法。取 0.2 g胚芽鞘, 加 0.4 mL 0.5
mol·L-1 HCl和少量石英砂充分研磨, 将匀浆液倒入
10 mL刻度试管中, 然后用 0.4 mL 0.5 mol·L-1 HCl
和 0.5 mL的蒸馏水冲洗研钵, 其溶液并入试管中。
沸水浴加热 20 min, 中间摇动几次, 冷却后加入蒸
馏水定容至 5 mL, 静置过夜。次日, 将匀浆液混
匀后取 0.7 mL于 4 ℃下离心(13 400×g) 10 min, 取
上清液 0.5 mL, 准确加入 2 mol·L-1的NaOH 16 μL,
混匀后即可用于草酸含量测定。
测定草酸(1 mL反应体系)时, 先向试管中加入
0.02 U的OxO (约 30 mg酶制剂干粉), 再加入 0.11
mL蒸馏水, 然后加入 0.8 mL显色液, 40 μL POD
(50 U·mL-1), 最后加上述草酸提取液 50 μL启动反
应, 室温下反应 90 min, 13 400×g离心 5 min后在
555 nm处测定吸光值。对照的反应液中以蒸馏水
代替草酸提取液。配制显色液时, 先配制含 75%
(V/V)乙醇的125 mmol·L-1琥珀酸缓冲液(pH 4.0), 临
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反应之前取需要量的上述缓冲液, 加入显色剂4-氨
基氨替吡啉(终浓度 100 μg·mL-1)和 N,N-二甲基苯
胺(0.25 μL·mL-1)。
实验结果
1 水稻种子萌发过程中胚芽鞘形态和可溶性蛋白
含量的变化
水稻胚芽鞘是水稻种子萌发过程中最先衰老的
器官。浸种后 96 h时, 胚芽鞘呈淡黄色, 此时可溶
性蛋白含量较高, 为80.04 mg·g-1 (DW); 随着萌发进
程的推进, 胚芽鞘逐渐变褐, 可溶性蛋白含量迅速
降低; 192 h时, 胚芽鞘出现衰老症状, 其中的可溶
性蛋白含量已降至 24.21 mg·g-1 (DW) (图 1); 288 h
时, 胚芽鞘不但呈褐色而且干枯, 似乎完全死亡。
2 水稻种子萌发过程中胚芽鞘中H2O2和O2－· 的变化
DAB染色法能够定性和半定量地反映植物组
织中H2O2的水平, 是一种比较直观和简洁的检验方
法。因此, 我们采用DAB染色法分析水稻种子萌
发过程中胚芽鞘中H2O2的变化。浸种后 96 h的胚
芽鞘, 经DAB染色 2 h仍呈淡黄色, 但在 192、240
和 288 h的胚芽鞘上, 可观察到明显的褐红色物质
(图 2-A), 说明此时胚芽鞘中H2O2的含量明显高于
96 h。而 NBT染色结果则是浸种后 96 h胚芽鞘
的颜色最深, 之后则降低(图 2-B), 即胚芽鞘中O2－·
图 2 DAB和NBT染色法检测水稻胚芽鞘
中的H2O2 (A)和O2－· (B)
Fig.2 Detection of H2O2 (A) and O2－· (B) in rice
coleoptiles by staining with DAB and NBT
的含量随着发育进程的推进而降低。
3 水稻种子萌发过程中胚芽鞘中的OxO活性及草
酸含量的变化
分别于水稻浸种后 96、144、192、240 和
288 h时取样。用 40 mmol·L-1 pH 3.5的琥珀酸缓
冲液作为提取液, 在上清液中未检测到OxO活性,
OxO活性只存在于沉淀中。胚芽鞘中的OxO活性
在 96 h时, 相对较低, 之后迅速升高, 在浸种后 240
h达到最高, 然后随着胚芽鞘的衰老又有所降低(图
3)。而胚芽鞘中的草酸含量则随着幼苗的生长迅
速降低, 在浸种后 96 h时, 其草酸含量是 288 h的
5.7倍(图 3)。
4 水稻种子萌发过程中胚芽鞘中的CAT活性
CAT是植物体内清除H2O2的关键酶, 那么胚
芽鞘中H2O2含量的增加是否与其有关？于是分别
在浸种后 96、144、192、240、288 h测定水
稻胚芽鞘中 CAT的活性。结果显示: 随着幼苗的
生长, 胚芽鞘中的CAT活性迅速降低; 在浸种后192
h时, 胚芽鞘中的 CAT活性已经很低; 288 h时, 其
活性几乎为 0 (图 4)。
图 1 浸种后不同时间水稻胚芽鞘中的可溶性蛋白含量
Fig.1 Soluble protein content in rice coleoptiles
at different time after imbibition
植物生理学通讯 第 46卷 第 10期, 2010年 10月 1043
讨　　论
水稻胚芽鞘是水稻萌发后第一个衰老的器官,
它快速从有生命的状态过渡到衰老( K a w a i 和
Uchimiya 2000), 本文的结果也证实了这一点。从
浸种后96 h开始, 胚芽鞘中的可溶性蛋白含量迅速
下降; 192 h时, 胚芽鞘中可溶性蛋白含量是96 h的
0.19倍, 此时胚芽鞘在形态上也呈现出衰老症状, 说
明已有部分组织衰老死亡; 288 h时, 胚芽鞘似乎完
全死亡。
Leshem (1988)认为衰老是一个氧化的过程, 其
中包括活性氧的过量产生, 而H2O2能够与超氧自由
基反应形成羟基自由基, 羟基自由基可启动膜脂过
氧化和破坏蛋白质(Halliwell 1987)。于是我们分别
采用DAB和NBT组织染色法对浸种后不同时期胚
芽鞘中的H2O2和 O2－· 水平进行了分析, 结果表明
H2O2的含量随着胚芽鞘的衰老而升高, 而O2－· 则相
反。同样, Davoine等(2001)在黑麦草叶鞘衰老过
程中也观察到, 越是衰老的叶鞘, H2O2含量越高, 而
O2－· 的变化则相反。由此推测H2O2可能在胚芽鞘
衰老过程中具有重要作用。
在植物中, H2O2主要来源于Mehler反应和光呼
吸中的乙醇酸氧化酶, 此外, POD、NADPH氧化
酶和OxO也可产生相当量的H2O2, 而CAT是植物
体内清除H2O2的关键酶。由于本实验的材料是在
遮光条件下培养的, 因此胚芽鞘衰老过程中产生的
H2O2很可能来源于POD、NADPH氧化酶或OxO。
研究表明, 越是衰老的黑麦草叶鞘, 其OxO活性和
H2O2含量越高, 高水平的H2O2可能主要来源于草
酸(Davoine等 2001)。此外, 有报道显示, G-OxO
(germin-oxalate oxidase)可能参与谷物表面结构的
PCD (Lane 2000); OxO产生的H2O2可能参与铝诱
导的大麦根边缘细胞的死亡(Tamas等 2005); 在表
达高水平OxO的转基因植株叶片中可观察到过敏
反应类症状(Hu等2003); 草酸则能够诱导植物细胞
的 PCD (Errakhi等 2008)。于是本研究进一步分析
了不同发育时期水稻幼苗胚芽鞘中的 CAT、OxO
活性和草酸含量, 结果显示, 胚芽鞘中的OxO活性
和H2O2含量随着胚芽鞘的衰老而升高, 而 CAT活
性和草酸含量则迅速降低, 因此推测胚芽鞘衰老过
程中产生的H2O2可能来源于草酸, OxO很可能通过
降解草酸产生H2O2参与胚芽鞘的衰老, 而 CAT活
性的迅速降低对H2O2的积累也起了重要作用。
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图 3 浸种后不同时间水稻胚芽鞘中的OxO活性和草酸含量
Fig.3 OxO activity and oxalate content in rice coleoptiles
at different time after imbibition
图 4 浸种后不同时间水稻胚芽鞘中的CAT活性
Fig.4 CAT activity in rice coleoptiles at
different time after imbibition
植物生理学通讯 第 46卷 第 10期, 2010年 10月1044
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