全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (2): 195~199 195
收稿 2013-01-04　　修定 2013-01-30
资助 国家自然科学基金(31170563)和教育部高等学校博士学科
点专项科研基金(20110014110014)。
* 通讯作者(E-mail: zhengcx@bjfu.edu.cn; Tel: 010-
62337717)。
不同的固定方法对激光显微切割分离油松胚珠雌配子体的影响
王英旗, 姚阳, 陈彬丽, 张淑静, 李芳, 郑彩霞*
北京林业大学生物科学与技术学院, 北京100083
摘要: 为了精确分离油松胚珠雌配子体, 获得单一种类的细胞, 进一步研究油松胚珠发育分子调控的时空特异性, 本文利用
激光显微切割技术(LCM)对2年生油松胚珠雌配子体进行了微切割; 比较了冷丙酮(4 ℃)、卡诺固定液、FAA固定液固定及
冻藏处理4种不同方法对冰冻切片的影响。结果表明, 冻藏处理结合冰冻切片可以保证雌配子体的完整性, 采用该方法获
得了不同时期油松胚珠雌配子体, 为后续油松胚珠雌配子体发育相关分子机制的研究提供了实验材料。
关键词: 油松胚珠; 雌配子体分离; 冰冻切片; 激光显微切割
Effects of Different Fixing Methods on Isolation of Ovules in Female Gameto-
phyte of Pinus Tabulaeformis Carr. by Laser Capture Microdissection
WANG Ying-Qi, YAO Yang, CHEN Bin-Li, ZHANG Shu-Jing, LI Fang, ZHENG Cai-Xia*
College of Biological Science and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
Abstract: In order to separate the ovules in female gametophyte accurately, acquire single cell type and further
study the molecular mechanisms of the ovules in female gametophyte during development, laser capture micro-
dissection (LCM) was used to isolate the ovules in female gametophyte of 2-year old Pinus tabulaeformis. And
the effects of four methods, including cold acetone fixation (4 ℃), Carnoy’s fixation, FAA fixation and frozen
storage, on frozen sections were compared. The results showed that frozen storage combined with frozen sec-
tions could ensure the intact morphology of female gametophyte, and obtain the female gametophytes from dif-
ferent developing stages. The method could provide experimental materials for investigating the molecular
mechanisms of the development of ovules in female gametophyte of Pinus tabulaeformis.
Key words: ovule of Pinus tabulaeformis; female gametophyte separation; frozen section; laser capture micro-
dissection
油松是我国北方主要的绿化造林树种, 生产
中需要大量优质的种子。研究油松胚珠发育的分
子调控机制对于提高种子质量及实现人工制种有
重要意义。我们课题组在前期研究中发现, 油松
28号无性系胚珠是败育的, 原因是其雌配子体游
离核有丝分裂中途停止(贺窑青和郑彩霞2007)。
我们之前的工作还证明 , 此无性系存在特异的
DNA片段和蛋白质(李敏俐和郑彩霞2002; 丁坤善
等2004), 其败育可能与遗传因素及环境因素有关
(李凤兰和郑彩霞1990; 杨远媛等2008)。为进一步
研究游离核有丝分裂中途停止的分子调控机制,
需要将雌配子体从胚珠中分离。但是雌配子体体
积小且水分含量高、易破碎, 一般很难将其与周
围2倍体组织精确分离, 无法获得单一的雌配子体,
最终限制了人们对胚珠发育分子调控机制时空特
异性的研究。因而, 建立精确分离完整油松雌配
子体的技术是十分必要的。
激光显微切割(laser capture microdissection,
LCM)是利用二极管固体脉冲激光分离目标区域,
通过重力作用收集样品, 以达到快速、准确地从
组织切片中分离并获得单一类型细胞群或单个细
胞的技术。该技术具有无接触、无污染、操作性
强等优点, 成功地解决了目标细胞异质性的问题
(陆叶等2007), 尤其在所研究的目标细胞与样品细
胞难以分离, 以及目标细胞分布分散、无规则时,
技术与方法 Techniques and Methods
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激光显微切割具有更显著的优势。LCM技术已较
广泛地应用在动物学及医学领域, 但在植物学研究
领域的应用历史不长, Asano等(2002)首次在水稻的
研究中应用了该技术, 目前运用LCM技术已经成功
分离了拟南芥胚(Casson等2005), 水稻韧皮部、花
粉和绒毡层细胞(Suwabe等2008; Asano等2002), 玉
米胚芽鞘表皮和维管组织(Ohtsu等2007; Nakazono
等2003), 番茄根部巨细胞(Ramsay等2004), 烟草花
药细胞(Sanders等2005), 棉花胚珠纤维原始细胞和
表皮细胞(Wu等2006), 草莓果实皮质细胞(Raab等
2006), 葡萄风信子花被、花药和心皮(Nakada等
2006), 挪威云杉石细胞(Li等2007)等, 显示了该技
术在植物细胞及组织分离中广阔的应用前景。
本文采用冷丙酮(4 ℃)、卡诺固定液、FAA固
定液固定和冻藏组织4种方法处理样品进行冰冻
切片, 并与激光显微切割技术结合, 通过分析比较,
筛选并建立了从油松胚珠中分离获得单一且完整
性好的雌配子体的技术方法, 为进一步研究油松
胚珠发育的分子调控时空特异性奠定实验基础。
材料与方法
1 材料
自北京林业大学校园采集雌配子体游离核分
裂前期和后期的油松(Pinus tabulaeformis Carr.)球
果, 迅速剥离胚珠并固定。游离核分裂前期, 雌配
子体中央大液泡形态明显, 数十个游离核围绕在
其周围, 之后游离核持续分裂为数千个, 胚珠增大,
进入游离核分裂后期。
2 不同的固定方法
(1)冷丙酮(4 ℃)固定: 将剥离的油松胚珠迅速
投入冷丙酮固定液中, 于4 ℃抽真空30 min, 避光
固定12 h。(2)卡诺固定液(100%酒精:冰醋酸=3:1)
固定: 将剥离的油松胚珠迅速投入卡诺固定液中,
室温抽真空30 min后固定1 h, 95%酒精冲洗3次, 转
入70%酒精中保存。(3) FAA固定液(50%酒精:冰
醋酸:福尔马林=89:6:5)固定: 将剥离的油松胚珠迅
速投入FAA固定液中, 室温抽真空30 min后固定24
h。(4)冻藏处理: 将油松胚珠用锡箔纸包裹, 液氮
处理30 min后放入–80 ℃冰箱保存。
3 石蜡切片
材料于FAA固定液中固定48 h; 依次于50%、
70%、85%、95%和100%酒精中梯度脱水, 各2 h;
然后于1/2二甲苯+1/2 100%酒精、纯二甲苯中透
明, 各2 h; 之后放于1/2二甲苯+1/2石蜡中, 38 ℃温
箱过夜。浸蜡3遍, 每次4 h, 石蜡包埋。调节切片
厚度为10 μm, 切片。二甲苯脱蜡, 梯度酒精复水,
番红-固绿染色, 树胶封片。
4 冰冻切片
采用Leica CM 1950冰冻切片机。切片前喷洒
75%酒精和外源RNA酶清除剂对空气和机箱进行
消毒。钢刀、镊子和毛刷等切片用具用0.1%焦碳
酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)水浸泡处
理24 h以上, 然后高温高压灭菌待用。设置机箱温
度(CT)为–22 ℃, 样品头温度(OT)为–20 ℃, 刀座角
度为8°。在–20 ℃环境下将油松胚珠用JUNG包埋
剂包埋并固定于样品托上, 放置冷冻台上冷冻30
min。选择切片厚度为30 μm修平样品后进行切片,
切片厚度为10 μm, 将切片转移至附着聚乙烯萘膜
(PEN)的RNase-free载玻片上粘片。
5 雌配子体的激光显微切割
采用Leica LMD 6000激光显微切割系统。切
割前喷洒75%酒精和外源RNA酶清除剂对空气和
仪器进行消毒, 保证所在环境无RNase污染。环境
温度为4 ℃ , 脉冲激光参数分别为Power, 125;
Speed, 6; Specimen Balance, 0; Line Spacing for
Draw+Scan, 10。将粘贴样品的载玻片和收集管分
别安装在载物台和收集器上, 10倍物镜下找到雌
配子体组织并调焦至清晰。标注目标切割区域,
在“Draw+cut”模式下切割并收集样品。
实验结果
1 不同切片和固定方法的比较
参照油松胚珠石蜡切片的观察结果确定胚珠
冰冻切片中雌配子体的位置, 游离核开始分裂前
期的胚珠(图1-A), 雌配子体中几十个游离核围绕
在中央大液泡周围, 之后胚珠增大, 液泡逐渐皱缩
至消失, 游离核分裂为数千个, 呈线性排列于细胞
质中, 此时, 胚珠进入雌配子体游离核分裂的后期
(图1-B)。
冰冻切片虽然在组织显微观察上不如石蜡切
片清晰, 但雌配子体的轮廓清晰可见(图2和图3)。
4种固定方法对油松雌配子体结构的固定效果不
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同, 清晰度和皱缩程度存在差异(图2)。冷丙酮固
定后雌配子体皱缩明显, 结构不清晰, 产生了较严
重的组织破裂, 难以应用于雌配子体的分离(图
2-A)。卡诺固定液中含有酒精成分, 酒精可以使细
胞脱水, 导致细胞轻微皱缩, 雌配子体组织受损变
形(图2-B)。FAA固定液固定后雌配子体与周围组
织有变形, 细胞产生轻微皱缩和破裂(图2-C), 且
FAA中含有福尔马林(38%甲醛), 甲醛可以导致不
同程度的DNA、RNA断裂 , DNA-DNA交联及
DNA-蛋白质交联, 并且醛类固定剂对核酸和蛋白
质的复性作用不如沉淀类固定剂, 如乙醇和丙酮
等(Ahram等2003)。因此, FAA固定的材料不适用
于高质量RNA、DNA和蛋白质的提取。考虑到减
少实验时间 , 保证雌配子体完整性 , 避免DNA,
RNA和蛋白质的断裂、降解等因素, 本实验直接
使用冻藏材料进行冰冻切片, 雌配子体结构较完
图1 游离核分裂期油松胚珠石蜡切片(×200)
Fig.1 Paraffin sections of P. tabulaeformis ovules at free nuclear stage
A: 游离核分裂前期油松胚珠; B: 游离核分裂后期油松胚珠; N表示珠心组织; I表示珠被组织; G表示雌配子体; 箭头所指为游离核。
图2 游离核分裂前期油松胚珠冰冻切片(×200)
Fig.2 Frozen sections of P. tabulaeformis ovules at early free nuclear stage
A: 冷丙酮固定, 胚珠细胞与雌配子体受损严重; B: 卡诺固定液固定, 胚珠与雌配子体受损变形; C: FAA固定液固定, 雌配子体与胚珠
细胞有变形; D: 冻藏处理, 胚珠细胞与雌配子体较为完整。
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整, 中央液泡形态正常, 无明显的细胞皱缩及胀大
(图2-D), 可以很好地应用于激光显微切割。
2 雌配子体的收集
胚珠中雌配子体的分离过程如图3所示。移
动目标区域至视野中, 在显微镜下调节雌配子体
区域清晰(图3-A和B), 沿雌配子体外缘绘制切割轨
迹(图3-C和D), 激光切割, 雌配子体借助重力落入
PCR管盖中, 分别收集雌配子体(图3-G和H)与胚珠
残余部分(图3-E和F), 冻藏备用。
讨　　论
1 切片方法的选择
油松胚珠石蜡切片中雌配子体结构清晰、完
整, 游离核着色明显, 在组织细胞观察性研究中具
有较大的实用价值(图1), 但是实验周期长, 步骤较
多, 需要烤片和脱蜡, 破坏了组织细胞中的生物分
子。油松胚珠含水量较高, 冰冻切片过程中易形
成冰晶, 破坏组织结构, 组织观察效果不如石蜡切
图3 激光显微切割分离雌配子体的过程(×200)
Fig.3 Separation of P. tabulaeformis ovules in female gametophyte by laser capture microdissection
A、C、E为游离核分裂前期油松胚珠; B、D、F为分裂后期油松胚珠; A和B为切割前胚珠横切面; C和D标注部分为雌配子体; E和F
为切割后胚珠剩余部分; G和H为收集到的雌配子体。
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片, 但其实验周期短, 步骤简单, 不需要烤片、脱
蜡、染色, 保护了组织细胞中的生物分子, 有效保
证了DNA、RNA和蛋白质的完整性和生物活性,
最大程度降低了它们的断裂及降解。考虑到探究
油松雌配子体发育的分子机制需要提取相应的生
物大分子, 特别是高质量RNA的提取对实验条件
要求较高, 本研究采用了冰冻切片技术作为激光
显微切割的前步骤, 进行了不同发育时期油松胚
珠雌配子体的切割和收集(图3)。
2 切片厚度对冰冻切片及激光显微切割的影响
切片厚度大于12 μm的冰冻切片卷片、碎片
少, 材料不易发生自我皱缩、破损, 成功率高, 但
是需要的激光脉冲能量大, 难以被激光完整切割,
材料暴露在空气中时间长, 生物分子易破坏、降
解, 且长时间的高脉冲能量导致仪器过热, 对激光
显微切割仪器损害大。8~10 μm厚的冰冻切片卷
片、碎片较少, 容易被激光切割。需要的激光脉
冲能量较低, 可以长时间使用仪器进行切割; 而小
于8 μm的切片很薄, 发生自我皱缩, 破损的情况严
重, 切片的成功率低。因此, 本文采用了10 μm的
厚度来进行冰冻切片, 获得了高质量的雌配子体
细胞。
3 问题与展望
激光显微切割技术具有操作性强, 特异性高
等特点, 在分离植物单一组织或细胞方面具有广
阔的应用前景。本文与后续的分子生物学分析相
结合, 研究游离核分裂时期油松胚珠的基因表达
与调控, 希望揭示游离核有丝分裂停止的原因, 为
裸子植物胚珠发育机制提供参考。在冰冻切片时
保证组织的清晰和完整性, 在有限的资源基础上
切割获得足够的目标组织, 避免核酸、蛋白质分
子的损伤及降解都是需要进一步探讨的问题。总
之, 激光显微切割技术可以快速、精确地获得油
松胚珠雌配子体细胞, 为油松胚珠雌配子体的分
离及相关大分子的提取提供了良好的技术支持。
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