全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月 359
收稿 2010-01-19 修定 　2010-03-28
资助 国家自然科学基金(30 8 70 1 8 5)。
* 通讯作者(E-mail: wangyong@nankai.edu.cn; Tel: 022-
2 3 5 0 4 3 8 2 )。
不同培养条件下莱茵衣藻细胞中 SGAT酶活性的变化
李洪涛 1, 朱珂 1, 刘清岱 2, 左照江 1, 朱晔荣 1, 白艳玲 1, 王勇 1,*
1南开大学生命科学学院, 天津 300071; 2天津科技大学食品工程与生物技术学院, 天津 300457
提要: 利用模式单细胞植物莱茵衣藻, 研究不同培养条件下细胞中丝氨酸: 乙醛酸氨基转移酶活性的变化情况。结果表明:
莱茵衣藻 SGAT酶活性的最适 pH介于 5~7之间, 当 pH高于 7以后, 酶活性逐渐下降; 随着细胞密度增加, SGAT酶活性降
低; 光强可显著影响SGAT酶活性, 在一定光强范围内, 随着光照强度的增加, 酶活性增强; 乙酸作为莱茵衣藻的唯一异养碳
源也会影响SGAT酶活性, 两者间呈正相关; 提高氧浓度, 显著地提高了细胞内SGAT的酶活性; 当二氧化碳浓度增加时, 细
胞内 SGAT的酶活性也略有升高; 40 ℃高温和 15 ℃低温处理后, SGAT酶活性均降低。此外, 提高氧浓度时细胞内Gly含
量增加, Ser含量减少, Gly/Ser的比值从 0.79提高到 1.49。
关键词: SGAT; 细胞密度; 光照强度; 乙酸; 氧浓度; 光呼吸; 莱茵衣藻
Variations in SGAT Enzyme Activity of Chlamydomonas reinhardtii L. Cells
under Different Cultural Conditions
LI Hong-Tao1, ZHU Ke1, LIU Qing-Dai2, ZUO Zhao-Jiang1, ZHU Ye-Rong1, BAI Yan-Ling1, WANG Yong1,*
1College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China; 2Department of Biotechnology, Tianjin University of Science
and Technology, Tianjin 300457, China
Abstract: In this study, the model single cell plant Chlamydomonas reinhardtii was used to investigate varia-
tions in serine: glyoxylate aminotransferase activity in cells under different cultural conditions. The results
showed the optimum pH of SGAT was in the range of 5–7, and SGAT decreased gradually when the pH was
higher than 7. SGAT activity in the cell also declined with the increase of cell density. SGAT activity was
influenced significantly by the light intensity, and the effect strengthened with the increase of light intensity.
Moreover, acetate, which was the sole carbon source of C. reinhardtii in heterotrophic growth, also affected
the SGAT activity. In addition, SGAT activity in the cell increased remarkably when the oxygen concentration
was higher than that in the normal air, and the increased carbon dioxide concentration treatment also led to an
increase. The SGAT activity both reduced under 40 or 15 ℃. Furthermore, the content of Gly was increased
and the content of Ser was decreased when the oxygen pressure increased in the air, resulting in a raise in Gly/
Ser ratio from 0.79 to 1.49.
Key words: SGAT; cell density; light intensity; acetate; oxygen pressure; photorespiration; Chlamydomonas
reinhardtii
丝氨酸:乙醛酸氨基转移酶(serine: glyoxylate
aminotransferase, SGAT, EC 26.1.45)是植物中普遍
存在的一种氨基转移酶, 催化底物丝氨酸和乙醛酸
之间的转氨作用 , 生成羟基丙酮酸和甘氨酸
(Liepman 和Olsen 2001; Honderd等 1985)。高等
植物的SGAT定位在过氧化体, 参与光呼吸途径的
正常运转。SGAT一旦失去功能, 突变的植物体就
不能在正常空气中生存(Ogren 1984; Wingler等
2000; Igamberdiev和 Lea 2002)。
近些年来, 光呼吸途径的研究越来越受到人们
的重视(Foyer等 2009)。研究表明, 光呼吸途径不
仅可以补救利用光呼吸产物磷酸乙醇酸, 大量减少
C3植物中碳的损失, 而且还与植物的抗病性(Taler
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等 2004)、抗逆性(Wingler等 2000; Rivero等 2009)
以及衰老(Zhu等 2004, 2005)等重要生理过程有
关。最近, Zelitch等(2009)还证明光呼吸途径在C4
植物玉米中的高水平运转对于玉米的正常生长也是
必不可少的。
衣藻为真核单细胞藻类, 是研究光合作用的模
式植物之一。衣藻中同样存在光呼吸作用, 但是又
有其独特之处。例如, 衣藻可以将乙醇酸分泌到细
胞外(Nelson等 1969; Moroney等 1986); 乙醇酸的
氧化是在乙醇酸脱氢酶而不是乙醇酸氧化酶的催化
下进行的(Nakamura等 2005; Atteia等 2009); 衣藻
中可能不存在过氧化体, 所以光呼吸途径的氨基转
移酶如SGAT在衣藻中则定位在线粒体中(Atteia等
2009)。因此, 衣藻的光呼吸作用、参与此途径的
酶或酶系以及受环境因子的影响等值得深入研究。
本文以莱茵衣藻为实验材料, 研究不同生长环境对
细胞内SGAT酶活性的影响, 并通过液相色谱测定
在不同氧分压下, 细胞内丝氨酸和甘氨酸的含量, 以
此进一步了解细胞中SGAT酶活性变化与光呼吸的
关系。
材料与方法
本研究选用的实验材料是一种单细胞绿藻, 属
于绿藻门(Chlorophyta)团藻目(Volvocales)衣藻属
(Chlamydomonas)莱茵衣藻(Chlamydomonas
reinhardtii L.)的 325CW15品系, 由德国弗赖堡大
学 Beck教授惠赠。325CW15品系属细胞壁和精
氨酸缺陷型, TAP培养液中加入外源精氨酸后才能
正常生长(Tian等 2006)。
从同一培养瓶中取相同数量的衣藻细胞, 分别
放入添加精氨酸的TAP培养液, 然后在不同光照强
度下进行培养。光照强度分别为 3 0、6 0 和 9 0
μmol·m-2·s-1, 光周期为 16 h·d-1, 以完全黑暗条件作
为对照。每个处理 5个重复。培养 6 d后, 收集
细胞培养物, 并分别测定细胞密度和单位细胞中的
SGAT酶活性。
为了确定衣藻培养过程中细胞密度对细胞中
SGAT的活性是否有影响, 在光照强度为 60 μmol·
m-2·s-1的条件下, 分别在培养衣藻 24、30、36、
42、52、60和 66 h后进行取样, 然后提取 SGAT
并测定酶活性。每个处理 3 个重复。
将莱茵衣藻细胞在光照强度为 60 μmol·m-2·s-1,
分别在含 0、6、12和 18 mmol·L-1乙酸的 TAP培
养液中进行培养, 当细胞达到相近的密度时收集细
胞(排除了光照和细胞密度的影响), 提取SGAT酶,
并测定酶活性。
莱茵衣藻细胞密度采用细胞计数法进行测定,
所用血球计数板为(25×16型), 根据以下公式计算细
胞密度: 细胞密度(个 ·mL-1)＝实测数 ×5×104×稀释
倍数。
分别采用不同氧分压与CO2浓度的空气(50%
O2或5% CO2)或温度(40或15 ℃)处理莱茵衣藻, 光
照 2 h后取样, 测定 SGAT酶活性。
SGAT酶液提取参照Havir和McHale (1988)的
方法, 将衣藻液体培养物在 4 ℃下 3 000×g离心 5
min, 将沉淀移入预冷的研钵中, 加液氮充分研磨成
粉末后, 加 200 μL 0.05 mol·L-1的磷酸钾缓冲液(含
1.5 μg·L-1 DTT, pH 7.4)并研磨。将溶液移至 1.5
mL离心管中, 再用磷酸钾缓冲液冲洗研钵 3次, 合
并缓冲液。18 000×g 4 ℃ 离心 5 min, 其上清液在
18 000×g 4 ℃再离心 20 min, 上清液即为 SGAT酶
提取液, 也是氨基酸初提液。
SGAT酶活性测定参照 Rehfield和 Tolbert
(1972)的NADH氧化间接测定法进行。取20 μL待
测酶液加入到 1 mL反应体系中(含有 15.4 mmol·L-1
丝氨酸、5 mmol·L-1乙醛酸、20 μmol·L-1磷酸吡
哆醛、77 mmol·L-1的磷酸钾缓冲液), 30 ℃温浴反
应 30 min, 加入 100 μL 10%三氯乙酸终止反应, 反
应液加入 40 μL NADH (3.5 mg·mL-1)和 10 μL稀释
后的乳酸脱氢酶(LDH, 13 U·mL-1, Amresco), 在室
温下进行 LDH催化的NADH氧化反应, 根据反应
体系的OD340减少值(即NADH的氧化量)间接计算
SGAT酶活性。以OD340变化值为纵坐标细胞体积
(代表酶量的多少)为横坐标作图。
丝氨酸与甘氨酸含量采用液相色谱进行测定,
其衍生化反应体系主要参照商振华等(1993)方法进
行, 并稍做修改。将氨基酸初提液分别用 2,4-二硝
基氟苯进行衍生化反应, 衍生化反应体系为: 62.5
μL NaHCO3、62.5 μL氨基酸初提液、100 μL
FDNB, 用KH2PO4补齐 1.25 mL。60 ℃水浴中反
应 1 h后, 将衍生化产物用孔径 0.45 μm的滤膜过
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滤, 吸取 20 μL滤液进样。色谱柱为Kromasil C18
柱(250 mm×4.6 mm i.d., 10 μm), 流动相是乙腈与醋
酸盐缓冲系统, 二元高压线性梯度洗脱, 流速 1
mL·min-1, 柱温 25 ℃, 检测波长 360 nm。
实验结果
1 SGAT酶活性测定曲线及pH值对SGAT酶活性
的影响
图1表明, OD340的变化值和SGAT酶活性之间
存在较好的线性关系, 可以用来检测酶活性在8倍
以内的差异。在不同 pH值条件下, 测定 SGAT酶
活性结果(图2)表明, SGAT酶在酸性条件下活性较
高, 并且在 pH 5~7之间变化不大, 当 pH超过 7时
活性开始逐渐下降。
的生长, 同时也提高单位细胞中SGAT的酶活性, 而
且光照越强, 效果越明显。进行了同样的细胞培养
和酶活性测定, 但取样时间不同, 使取样时每个处
理的细胞密度接近, 以排除细胞密度差异导致
SGAT酶活性的不同。其结果(图 3-b)表明, 在相
同细胞密度下, 光照及其强度对细胞中SGAT的活
性同样产生了显著的影响。
图 1 SGAT酶活性与OD340减少值之间的线性关系
Fig.1 Linear correlation between the decrease in OD340
value and the SGAT activity
图 2 不同 pH值对 SGAT酶活性的影响
Fig.2 Effect of different pH on the SGAT activity
图 3 不同光强对细胞 SGAT酶活性的影响
Fig.3 Effects of different light intensities on SGAT
activity in cells cultivated
a: 细胞生长的密度不同; b: 细胞生长达到相同的密度。
3 细胞密度对莱茵衣藻SGAT酶活性的影响
图4表明, 细胞密度对衣藻细胞中SGAT的活
性确实有影响, 随着细胞生长密度的增加, 细胞中
SGAT的活性明显呈下降趋势。
4 乙酸浓度对莱茵衣藻SGAT酶活性的影响
衣藻细胞可以以乙酸作为唯一碳源在黑暗条
件下进行生长。因此目前研究中最常采用的 TAP
培养基中含有较高浓度(18 mmol·L-1)的乙酸。图
5表明, 当培养液中乙酸浓度越高, 衣藻细胞中
SGAT的活性越高, 乙酸浓度对酶活性的影响非常
显著。
2 光强对莱茵衣藻SGAT酶活性的影响
从图 3-a中可以看出, 光照明显地促进了细胞
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图 4 细胞密度对 SGAT酶活性的影响
Fig.4 Effect of cell density on the SGAT activity
图 5 不同乙酸浓度对 SGAT酶活性的影响
Fig.5 Effects of different concentrations of
acetic acid on SGAT activity
图 6 不同O2及CO2浓度对 SGAT酶活性的影响
Fig.6 Effects of different oxygen and carbon dioxide
concentrations on SGAT activity
图 7 温度对 SGAT酶活性的影响
Fig.7 Effect of temperature on SGAT activity
7 50%氧浓度的空气对莱茵衣藻细胞内丝氨酸和
甘氨酸水平的影响
经 50%氧浓度的空气处理的结果(图 8)表明,
细胞中Gly的含量与正常空气相比显著增加, Ser含
量则显著降低。同时, 其Gly/Ser比值为 1.49, 而
正常空气处理莱茵衣藻的Gly/Ser比值为 0.79, 比
值升高了 0 .7。
讨　　论
本文确定了模式单细胞植物莱茵衣藻 SGAT
酶活性的最适 pH范围, 结果表明为偏酸性, 在 5~7
之间差异不大(图 2 ) , 这与 T r u s z k i e w i c z 和
5 不同氧浓度或CO2浓度对莱茵衣藻 SGAT酶活
性的影响
增加空气中氧气含量可以增加光呼吸作用, 而
增加空气中 CO2含量则可以抑制光呼吸作用的进
行。分别用氧浓度为 50%和 CO2浓度为 5%的空
气处理莱茵衣藻2 h的结果(图6)中可以看出, 与正
常空气培养的莱茵衣藻相比, 氧浓度为50%处理的
莱茵衣藻细胞内 SGAT酶活性增加。而 CO2浓度
为 5%的空气处理后, 细胞内SGAT酶活性也升高,
只是增加幅度略低于氧浓度为 50%的空气处理。
6 温度对莱茵衣藻SGAT酶活的影响
在高温和低温胁迫条件下, 光呼吸速率会增
加。用 40 ℃高温或 15 ℃低温处理衣藻培养物 2
h的结果(图 7)表明, 40或 15 ℃的处理都能引起细
胞内 SGAT酶活性的降低。
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图 8 50%氧浓度对细胞中Gly及 Ser含量的影响
Fig.8 Effects of 50% oxygen on the contents of
Ser and Gly in the cell
Paszkowski (2004)报道的玉米和小麦叶片中提取的
SGAT, 以及Kendziorek和Paszkowski (2008)报道的
拟南芥叶片中提取的SGAT酶反应最适pH值有所
不同, 这些高等植物的 SGAT酶活性的最适 pH值
都大于 7, 这可能是由于水生低等植物和陆地高等
植物间实际生长环境的 pH值差异所致。
近年来的研究表明, 在具有CO2浓缩泵的C4植
物和CO2浓缩机制的单细胞藻类中, 光呼吸途径是
一条不可或缺的途径。光呼吸途径可能在植物的
抗性方面也发挥着非常重要的作用。作为光呼吸
途径中的关键酶, SGAT参与细胞中氨基酸的代谢,
因此细胞中SGAT酶活性的变化可能与其在细胞中
发挥的生理作用以及植物细胞的生理状态密切相
关。本文表明, 光照能够促进细胞中SGAT的酶活
性(图3), 这可能因为光照能促进光合作用和光呼吸
途径的快速运转, 因此需要较高水平的参与光呼吸
途径的酶的总活性。这一现象在其他植物中也有
发现(Honderd等 1987; Foyer等 2009)。但是目前
还没有报道阐述光对细胞中SGAT酶活性正调控的
机制, 值得深入研究。在紫萍的研究(Zhu等 2004)
中发现, 当植物从生长进入衰老阶段后, 细胞中
SGAT编码基因的表达和酶活性都会开始下降。
本文发现, 随着细胞的生长, 培养液里细胞密度增
加, 细胞内 SGAT的酶活性逐步降低(图 4)。这一
点可能与细胞的生理状态有关。
乙酸是目前已知化合物中衣藻唯一可利用的
异养碳源, 但是其在衣藻中的代谢途径还不清楚。
目前研究表明, 乙酸在衣藻细胞中首先转化成乙酰
辅酶A, 然后再进入碳代谢途径(Boyle和Morgan
2009)。乙酸转化成乙酰辅酶A需要能量, 衣藻的
SGAT酶位于细胞中能量产生的线粒体中。乙酸
浓度与莱茵衣藻细胞中SGAT酶活性之间存在正相
关关系(图5), 这就意味着SGAT可能参与了乙酸的
代谢过程。
本文发现, 氧浓度的升高促进了衣藻细胞中
SGAT活性的增加(图 6-a)。但空气中二氧化碳浓
度的升高则抑制光呼吸作用, 衣藻细胞中SGAT的
活性并没有降低(图6-b), 这说明衣藻细胞中SGAT
的活性不一定总是伴随光呼吸的增强而增强。温
度胁迫也会增强呼吸作用(邓向前等 1984; 刘厚诚
等 2006), 而衣藻细胞中 SGAT的活性也不随温度
的胁迫而增加, 相反略有下降(图 7)。
细胞中甘氨酸/丝氨酸的比值经常被用于判断
光呼吸作用的强弱(Novitskaya等 2002; Niessen等
2007), 当光呼吸作用增加后, 该比值会升高。在
氧浓度升高后, 光呼吸作用增强, 细胞中 SGAT活
性的降低导致了甘氨酸的积累和丝氨酸的减少, 从
而使其的比例发生了显著变化。
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