全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 7期，2009年 7月684
收稿 2009-04-17 修定 　2009-06-22
资助 国家烟草专卖局重点项目(1 102 000 010 11A)。
* 通讯作者(E-mail: liuweiqun2004@126.com; Tel: 0371-
6 3 5 5 5 1 5 3 )。
烟草打顶对腐胺N-甲基转移酶基因表达的影响
戚元成 1,2, 马雷 1, 王菲菲 2, 刘卫群 1,2,*
河南农业大学 1烟草学院, 2生命科学学院, 郑州 450002
提要: 水培65 d的烟株进行打顶后, 测定打顶和不打顶烟株上部叶中烟碱含量。分别提取根中总RNA, 以腐胺N-甲基转移
酶基因(PMT)特异引物、肌动蛋白基因(actin)为内参作半定量RT-PCR分析; 同时将提取的总RNA转膜, 用地高辛标记PMT
RT-PCR产物作探针, 进行Northern杂交分析的结果表明, 打顶后的上部烟叶中烟碱含量和PMT基因表达量显著增加。
关键词: 烟草打顶; 腐胺 N-甲基转移酶基因(PMT); 半定量 RT-PCR; Northern杂交
The Influence of Tobacco (Nicotiana tabacum L.) Topping on the Expression of
Putrescine N-methyltransferase Gene
QI Yuan-Cheng1,2, MA Lei1, WANG Fei-Fei2, LIU Wei-Qun1,2,*
1College of Tobacco Science, 2College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: The tobacco (Nicotiana tabacum) plants were topped after water cultured for 65 d and the top leaf
nicotine contents of the topped and untopped were examined. Total RNA were extracted respectively from the
roots of topped and untopped tobacco plants. Expression analysis of putrescine N-methyltransferase gene (PMT)
was carried out by semi-quantitative RT-PCR with the tobacco actin as control and by Northern blotting with
the digoxin-labelled PMT RT-PCR product as probe. Results showed that PMT expression and the nicotine
content in the top leaf increased after topping.
Key words: tobacco topping; putrescine N-methyltransferase gene (PMT); semi-quantitative RT-PCR; North-
ern blotting
烟碱合成的第一步是在腐胺 N- 甲基转移酶
(putrescine N-methyltransferase, PMT)催化下腐胺
向N-甲基腐胺的转化(Hibi等1994; Chou和Kutchan
1998)。打顶是影响烟株中烟碱合成积累的农艺措
施之一。Shi等(2006)的研究表明, 烟株打顶后, 生
长素合成减少, 茉莉酸内酯增加, 最终烟碱生物合
成量增加。Saunders和 Bush (1979)研究表明烟株
打顶后根中烟碱合成相关酶类活性增加, 烟碱含量
也增加。迄今, 将烟株打顶后烟碱的快速积累与
PMT转录水平直接联系起来的报道尚少见。为此,
本文用半定量RT-PCR并结合Northern杂交的方法
研究了打顶对烟株中PMT基因表达的影响, 从分子
水平揭示烟碱合成关键基因转录和烟碱生物合成量
之间的平行关系。
材料与方法
实验材料为烟草(Nicotiana tabacum L.)品种
‘K326’。采用漂浮育苗法培育至四叶期时, 移入
Hoagland营养液中, 水培 65 d时打顶, 于打顶后 24
h 时进行实验。
打顶烟草和不打顶烟草根部总RNA的提取依
照 TIANGEN公司的总 RNA提取试剂盒(TRNzol
Total RNA Reagent)说明书进行。
提取总 RNA后, 以 1%琼脂糖凝胶法检测总
RNA的提取质量。根据 A260/A280值, 计算其纯度,
并通过 A260值对总 RNA作定量分析。
取等量打顶和不打顶烟株的根部总 RNA, 用
TaKaRa试剂盒M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit
合成第一链 cDNA。
根据烟草 actin序列(EU938079), 设计特异引
物, 进行烟草肌动蛋白的 PCR扩增。向 25 μL反
应体系中分别加入等量的 cDNA (3 μL)模板、10
倍的 PCR缓冲液、200 μmol·L-1的 dNTPs、1.5
mmol·L-1的MgCl2、0.4 μmol·L-1的 actin特异引物、
1 U Taq DNA聚合酶。反应程序: 94 ℃预变性 3
min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min,
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18个循环; 72 ℃延伸 5 min。
取等体积的 PCR产物进行 1%琼脂糖凝胶电
泳。溴化乙锭(EB)染色后, 用UVBand紫外 -可见
分光光度计计算机软件对电泳条带进行灰度分析,
以调整 PMT基因 PCR扩增时的模板量。
根据已克隆的烟草 PMT (GenBank登录号为
D28506)序列设计特异引物, 正向引物序列为: 5
CAGAACGGGACAATCAGC 3; 反向引物序列为: 5
GGACCTTCAGTAGAGCAGT 3。PCR扩增条件
同上, 按actin扩增后灰度分析的结果添加模板量。
取等体积的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳, EB染
色, UVBand紫外 -可见分光光度计观察照相。
Northern杂交按照戚元成等(2004)文中的方法
进行, 探针是DIG DNA Labeling Kit (Roche)标记的
PMT基因 RT-PCR产物。
打顶 24 h后, 取打顶和不打顶烟草的上部叶,
重复3个。烟碱含量测定采用王瑞新(2003)书中的
紫外分光光度法。实验数据分析用 Student’s t检
验(P≤ 0.05)。
结果与讨论
1 RNA电泳检测
提取的总RNA以1%琼脂糖凝胶电泳检测的结
果(图 1)显示, 28S、18S、5S三条带中 28S和 18S
带比较亮, 说明RNA样品纯度高, 并未发生降解, 因
此认为可用于 cDNA第一链的合成。
图 1 总RNA的电泳检测
Fig.1 Total RNA separated on agarose gel
1~5: 不打顶烟株; 6~11: 打顶烟株; 12: DNA marker DL2000。
2 PMT引物和内参引物分管 PCR分析
从图2可以看出, PCR扩增产物的条带比较清晰,
基本上没有拖尾现象。打顶烟株的条带亮度大于不
打顶烟株的, 但两类烟株的 actin扩增产物差异不显
著, 说明烟草打顶后根部PMT基因表达量明显增加。
图 3 PMT表达的Northern 杂交分析
Fig.3 Northern blotting analysis of the PMT expression
rRNA 的 EB 染色条带作上样量对照。
3 PMT表达的Northern杂交分析
由Northern杂交结果(图 3)可知, 在两个泳道
rRNA的量一致的情况下, 打顶烟株的杂交带比不
打顶烟株的条带亮, 这表明烟草打顶后根部PMT基
因表达量明显增加。
图 4 烟株打顶前后的烟碱含量变化
Fig.4 Changes in nicotine contents before and after
topping of tobacco plants
图 2 PMT的半定量RT-PCR分析
Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR analysis of PMT
1、2 : 不打顶烟株; 3、4 : 打顶烟株。以 a c t in 扩增产物
为内参。
4 上部烟叶烟碱含量变化
从图 4可见, 烟株移栽 65 d时, 上部叶中烟碱
含量为 0.19%, 打顶后 24 h的上部叶中烟碱含量为
0.266%; Student’s t检验(P≤ 0.05)分析表明, 打顶
后的烟碱合成量比打顶前显著上升。这跟PMT表
达的半定量RT-PCR和Northern杂交结果存在一定
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的平行关系。
参考文献
戚元成, 张世敏, 王丽萍, 王明道, 张慧(2004). 谷胱甘肽转移酶基
因过量表达能加速盐胁迫下转基因拟南芥的生长. 植物生理
与分子生物学学报, 30 (5): 517~522
王瑞新(2003). 烟草化学. 北京: 中国农业出版社, 271~272
Chou WM, Kutchan TM (1998). Enzymatic oxidations in the
biosynthesis of complex alkaloids. Plant J, 15: 289~300
Hibi N, Higashiguchi S, Hashimoto T, Yamada Y (1994). Gene
expression in tobacco low-nicotine mutants. Plant Physiol,
6: 723~735
Saunders JW, Bush LP (1979). Nicotine biosynthetic enzyme
activities in Nicotiana tabacum L. genotypes with different
alkaloid levels. Plant Physiol, 64 (2): 236~240
Shi QM, Li CJ, Zhang FS (2006). Nicotine synthesis in Nicotiana
tabacum L. induced by mechanical wounding is regulated by
auxin. J Exp Bot, 57 (11): 2899~2907