全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1291~1300 1291
收稿 2013-06-17　　修定 2013-10-16
资助 国家自然科学基金(31171830和31272027)。
* 通讯作者(E-mail: hsdong@njau.edu.cn; Tel: 025-84399006)。
烟草TTG2蛋白质对NPR1介导的抗病防卫反应与ARF8影响的生长发育
进行交叉调控的机制
韩冰, 朱茜, 葛军, 徐曼宇, 董汉松*
南京农业大学植物保护学院, 南京210095
摘要: NPR1蛋白是水杨酸信号和系统获得性抗性的转录调节因子, 它的功能受蛋白质降解酶体CUL3-E3的控制。植物的
发育主要受生长素信号通路的控制, 生长素反应因子(ARF)参与生长素信号转导转录调控。植物转录因子NPR1和ARF8分
别在蛋白质降解酶体CUL3-E3与CUL1-E3控制下, 调控抗病防卫与生长发育。烟草TTG2促进ARF8从细胞质向细胞核转运
及其转录调控作用, 因此促进生长发育; 相反, TTG2把NPR1扣留在细胞质, 阻止它对防卫反应基因的转录调控作用, 从而
抑制抗病性。TTG2与NPR1或ARF8并不直接互作, 说明存在协助因子。
关键词: TTG2; 交叉调控; 抗病防卫; 生长发育; 信号转导
Molecular Mechanisms Underlying the Roles of the TTG2 Protein in Modulating
NPR1-Regulated Pathogen Defenses and ARF8-Engaged Development in Tobacco
HAN Bing, ZHU Qian, GE Jun, XU Man-Yu, DONG Han-Song*
College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: The NPR1 (nonexpressor of pathogenesis-related genes 1) protein is a transcription regulator of
salicylic acid (SA) signaling and systemic acquired resistance, and the protein functions under the control of the
cullin 3-based E3 ligase (CUL3-E3) proteasome in plants. In frequent crosstalk with the resistance, plant
development is largely regulated by the auxin signaling pathway, which depends on auxin response factor
(ARF) proteins to regulate auxin responses of plants. The transcriptional function of ARFs is repressed when
binding to Aux/IAA proteins, and activated by the CUL1-E3 proteasome, which degrades Aux/IAA to release
ARFs. The defensive role of NPR1 and the developmental role of ARF8 were oppositely regulated by the
TRANSPARENT TESTA GLABRA 2 (TTG2) protein in tobacco. TTG2 suppresses resistance to viral and
bacterial pathogens by sequestering NPR1 from the nucleus but promotes the developmental role of ARF8 by
facilitating its localization to the nucleus. However, TTG2 does not directly interact with NPR1 or ARF8,
suggesting that potential proteins assist TTG2 in modulating the nucleocytoplasmic transports. Starting with
identifying the postulated assistant factors, this report aims to elucidate the mechanism of TTG2 modulating the
nucleocytoplasmic trafficking of NPR1 and ARF8 and the following impact on E3 proteasome.
Key words: TTG2; crosstalk; pathogen defense; development; signal transduction
1 引言
植物抗病防卫反应与生长发育交叉调控的意
义类似于人类“战争与和平”的关系, 防卫反应服从
生长发育, 应该“召之即来挥之即去”。植物在遭受
病原物侵染时, 能够快速调动防卫反应机制, 有效
抵御病原物侵染与致病。
这种变化过程涉及多种植物激素与非激素信
号转导通路的相互作用(Robert-Seilaniantz等2011;
Desaki等2012; Spaepen和Vanderleyden 2011; Van der
Does等2013), 其中, 植物激素水杨酸与生长素信号
转导之间的对抗关系至关重要(Robert-Seilaniantz
等2011; Li等2012)。在这一对抗关系中, 植物TRAN-
SPARENT TESTA GLABRA 2 (TTG2)蛋白质作为
交叉调控因子, 发挥十分关键的作用(Li等2012)。
早期文献把TTG界定为调节表皮毛与种子发
育的蛋白质(Larkin等1994; Leon-Kloosterziel等
1994; Szymanski等2000), 陆续阐释了这种功能的
生理与分子机理(Vetten等1997; Petroni和Tonelli
植物生理学报1292
2011; Bouyer等2008)。TTG通过影响花青素生物
合成途径, 改变花和种皮的颜色(Vetten等1997;
Petroni和Tonelli 2011); 通过蛋白质-蛋白质互作,
调控表皮毛发育(Bouyer等2008)。最近研究发现,
TTG还有调控植物抗病及抗逆防卫反应的功能(Li
等2012; Jiang等2012; Nguyen等2013; Wang等
2009)。这个新发现为深入探讨植物防卫反应与生
长发育交叉调控的机制提供了新视野(Li等2012;
Wang等2009), 抗病防卫反应调控因子的行止动态,
执行功能或闲置备用, 实际上受到细胞信号转导
正反两种力量的制约(Robert-Seilaniantz等2011;
Van der Does等2013; Li等2012; Wang等2013), 以保
证植物防卫反应与生长发育之间的转变, 用最低
的适应性代价完成对病原物侵染与致病性的有效
抵御, 并迅速恢复生长发育进程。
2 水杨酸与生长素信号转导机制和相关问题
水杨酸介导的系统性获得抗性 ( sys temic
acquired resistance, SAR)是各种植物广谱抗病性最
重要的机制, 可以有效抵御各种病原物致病性的
发生发展(Dong等1999; Dong 1998; Ryals等
1996)。水杨酸在正常生长的植物体内处于基础水
平, 防卫反应机制闲置; 植物受病原物侵染后, 体
内水杨酸含量升高 , 引发一系列抗病防卫反应
(Dong等1999; Ryals等1996)。水杨酸信号由NPR
(nonexpressor of pathogenesis-related genes)蛋白质
NPR3或NPR4识别, 转变为细胞内信号转导过程,
调动多种调控因子参与防卫反应(Fu等2012; Shi等
2012)。WRKY (WRKYGQK motif-binding protein)
转录因子调控NPR1基因表达水平, 决定NPR1蛋白
质产生的量(Eulgem和Somssich 2007)。NPR1与
TGA (TGACG motif-binding factor)转录因子互作,
共同调控防卫反应基因(如pathogenesis-related 1,
PR1)的表达(Cao等1997; Fan和Dong 2002; Ryals等
1997)。转录调控呈现一次性效应(图1), 一个NPR1
分子启动PR1一轮转录之后, 便由依赖cullin (CUL)
蛋白质CUL3的E3泛素连接酶体(CUL3-E3酶体)进
行降解, 下一轮转录调控由新的NPR1分子另行担
当(Spoel等2009)。因此, 每个NPR1分子在PR1一
轮转录完成之后即行降解, 每轮转录调控都需要
更换新的NPR1分子, 避免组成性防卫反应的发生
(Mukhtar等2009; Spoel等2009)。
如图1所示, NPR1功能调控过程还有多个未
知环节 , WRKY有待鉴定(Eulgem和Somssich
2007), Adp-A和Adp-B属何种物质, 目前也不清楚
(Mukhtar等2009; Kinkema等2000)。在未发生SAR
的细胞质内, Adp-A把未磷酸化的NPR1引领到
CUL3-E3酶体上接受降解; 在发生了SAR的细胞
内, 磷酸化的NPR1与CUL3-E3酶体之间的互作需
要Adp-B, 它能提高互作程度, 保证NPR1有效降
解。与CUL3-E3对NPR1的作用不同, CUL1-E3酶
体负责降解Aux/IAA (auxin/indole-3-acetic acid)蛋
白质, 释放生长素反应因子(auxin response factor,
ARF), ARF得以参与生长素信号转导转录调控
(Tada等2008)。这种差别可能是水杨酸与生长素
信号转导对抗关系的原因之一。
IAA是植物天然合成的生长素, 有调控植株顶
端优势与向性生长以及细胞分裂、伸长与分化等
多重功能(Tada等2008; Wiermer等2010), 影响多种
器官的生长发育, 如胚胎形成(Mou等2003)、根茎
叶的生长(Quint和Gray 2006; Vanneste和Friml
2009)、花器官建成(Julliard等1992)以及种子发育
(Holm和Key 1969)。参与这些发育过程的调控因
子分3类 : (1)生长素受体TIR1 (F-box protein
transport inhibitor response 1)和ABP1 (auxin-
binding protein 1) (Wilmoth等2005; Julliard等1992);
(2) ARF蛋白质家族的转录因子(Calderón等2012;
Hayashi 2012; Guilfoyle等1998; Tiwari等2003;
Ulmasov等1999); (3) Aux/IAA蛋白质家族的转录
抑制因子(Guilfoyle等1998; Tiwari等2003)。这些
蛋白质按转录调控与非转录调控两种方式发挥作
用(Hayashi 2012; Strader和Nemhauser 2013), 影响
细胞内信号转导过程(图2)。如图2所示, 转录调控
机制实际上是一个很短但功能强大的细胞核内信
号转导过程: 生长素与TIR1结合, 诱导CUL1-E3酶
体(SCFTIR1)的活性, 使Aux/IAA降解, ARF得以释放
(Tada等2008; Wilmoth等2005; Hayashi 2012;
Guilfoyle等1998; Tiwari等2003), 转而调控生长素
反应(auxin-responsive)基因的表达(Julliard等1992;
Nitsch 1952; Calderón等2012)。ARF分转录激活子
与抑制子两类, 特征分别是序列中部富含谷氨酸
(glutamine, Q)与丝氨酸(serine, S) (Tada等2008;
Nitsch 1952), 这种功能分化是生长素信号转导能
够调控植物不同生长发育过程的重要原因(Tada等
2008; Julliard等1992; Hayashi 2012; Tiwari等2003;
韩冰等: 烟草TTG2蛋白质对NPR1介导的抗病防卫反应与ARF8影响的生长发育进行交叉调控的机制 1293
Ulmasov等1999)。
因植物种类而不同, ARF蛋白质家族成员有
23~29个不等, 何种ARF调控哪种发育过程还不完
全清楚(Gray等2001; Liscum和Reed 2002; Strader
和Nemhauser 2013; Rushton等2008)。烟草(Nicot-
iana tabacum) ARF家族至少有12个成员得到鉴定
(Rushton等2008), 但目前仅对ARF1参与烟碱合成
的功能有所了解(Remington等2004)。可见, 研究
特定ARF与特定生长发育过程的关系, 还是一项艰
巨的任务, 现在研究主要关注影响抗病性以及生
长素与水杨酸信号转导交叉调控的ARF种类。
3 水杨酸与生长素交叉调控植物抗病性与生长发
育的机制和相关问题
水杨酸与生长素对植物生长与抗病性呈对抗
关系, 表现为两个方面(Remington等2004; Wu等
2011; Rushton等2008)。一方面, 水杨酸通过抑制
生长素信号转导来加强植物防卫反应能力, 提高
抗病性(Rushton等2008)。在拟南芥(Arabidopsis
thaliana)中, 水杨酸不仅削弱TIR1对生长素的识别
能力, 而且抑制CUL1-E3的活性, 保护Aux/IAA免
受降解, 因此阻止ARF释放与转录调控作用的发
生。在此情况下, 拟南芥生长变弱, 但防卫反应基
因表达水平提高, 病原物繁殖能力与致病性受到
抑制。另一方面, 生长素通过抑制水杨酸信号转
导来抑制抗病防卫反应(Wu等2011; Rushton等
2008)。拟南芥过表达TIR1基因(Navarro等2006),
或者用IAA或NAA (人工合成的生长素萘乙酸)
(Rushton等2008)处理以后, 对病原物的抗性都会
减弱。相反, 削弱拟南芥对生长素的敏感性, 则可
提高抗病能力(Rushton等2008)。表达恶臭假单胞
图1 NPR1降解与植物防卫反应
Fig.1 NPR1 degradation and plant defense responses
根据文献(Mukhtar等2009)改画。根据植物生长的条件, NPR1经历形态与核质定位的改变(Dong 2004; Spoel等2009)。在未发生SAR
的细胞内, NPR1由S-亚硝基硫醇(S-nitrosothiol, SNO)介导, 借助二硫键形成低聚体, 并停留在细胞质。在发生了SAR的细胞质内, 硫氧还蛋
白质(thioredoxin, TRX)调控细胞氧化还原状态, 使NPR1低聚体解离为单体, 大量NPR1单体转移到细胞核。进入细胞核后, NPR1对靶标基
因(如PR1)的转录调控作用受蛋白质分解酶体控制。A: 在未发生SAR的细胞内, 时常有少量NPR1单体进入细胞核, 与一个未知蛋白质互
作, 结合到PR1基因启动子上。但此时NPR1并不能与TGA结合, PR1也不能转录。相反, NPR1通过一个未知的底物接头(Adp-A)与CUL3-
E3酶体结合, 通过泛素(ubiquitin, Ub)介导进行降解。B: 在发生了SAR的细胞内, 大量NPR1单体进入细胞核, 在作用于靶标基因之前被磷
酸化。磷酸化与未磷酸化的NPR1都能与TGA结合。NPR1与TGA一旦结合, PR1基因转录便能启动。未磷酸化的NPR1也能作用于靶标基
因, 但需要一个未知的、不同于TGA的转录因子来合作, 使RNA聚合酶II (RNA polymerase II, Pol II)起始复合体(IC)得以装配, 随后启动靶
标基因转录。在这一反应中, 与Pol II结合的一个蛋白激酶(Kin)可能担当NPR1磷酸化的功能。磷酸化的NPR1与CUL3-E3酶体之间需要底
物接头Adp-B, 它能提高CUL3-E与NPR1的亲和性, 保证高度互作, 使NPR1在完成一次转录调控任务之后旋即降解, 下一轮转录调控由新
的NPR1分子另行承担。
植物生理学报1294
菌(Pseudomonas putida)水杨酸水解酶基因NahG的
转基因植物不能积累水杨酸, SAR随之丧失(Li等
2012; Todd等2010)。如果把与NahG转基因植物与
失去生长素敏感性(auxin response, axr)的突变体
axr2-1杂交, 杂交后代对生长素也不敏感, 对病原
物的抗性随之加强, 说明对生长素敏感性的缺失
可以弥补由于缺少水杨酸而引起的抗病性丧失
(Rushton等2008)。这些研究说明, 抑制生长素信
号转导是水杨酸对SAR进行调控的一个要素。
但也有相反的报道。拟南芥突变体aux1和
axr4失去生长素极性运输能力, 但SAR水平不是降
低, 而是提高, 说明SAR需要生长素信号(Truman等
2010)。这项发现的研究人员比较了自己与他人
(Navarro等2006; Wang等2007)相悖的试验结果, 解
释是: SAR在诱发早期需要生长素信号, 随发展进
程, 可能需要由生长素信号介导转变为水杨酸信
号介导, 水杨酸介导、NPR1调控的防卫反应机制
使植物早有准备, 因而能够快速实现信号调控的
转变(Todd等2010)。这至少说明, 不同激素信号之
间的交叉调控不仅复杂而且精细。关于生长素抑
制(Wu等2011; Rushton等2008)或促进(Todd等
2010)抗病防卫反应的机理及其与水杨酸信号的关
系, 目前了解甚少, 研究工作只是刚刚开始。
还有一个问题是, 水杨酸与生长素的对抗关
系在植物抗病防卫与生长发育交叉调控机制中的
份量。仅从抗病防卫反应信号转导不同通路来说,
交叉调控并不限于生长素与水杨酸之间, 其他激
素也有重要作用 (Rober t -Se i lan iantz等2011;
Spaepen和Vanderleyden 2011; Van der Does等2013;
Dong 1998; Navarro等2006; Wang等2007; Gaffney
等1993)。公认的观点是: 无论是以调控植物生长
发育为基本功能的植物生长激素(乙烯、生长素、
赤霉素、细胞分裂素), 还是以抑制植物生长发育
或调控逆境反应为基本功能的植物逆境激素(如脱
落酸), 都是通过影响水杨酸与茉莉酸或乙烯信号
转导交叉调控而影响植物的抗病性 ( R o b e r t -
图2 生长素信号转导转录调控与非转录调控模式
Fig.2 Model of transcriptional and non-transcriptional auxin responses
根据文献(Hayashi 2012; Strader和Nemhauser 2013)改画。红色菱形表示生长素。ABP1识别生长素信号, 诱导非转录调控。ABP1由
CBP1 (glycosylphosphatidylinositol-anchored protein)绑定在细胞膜上, 可能受LRR-RLK (leucine-rich repeat receptor-like protein kinase)激活,
与生长素结合, 促进ROP (Rho-related protein from plants)的活性。ROP转而激活RIC (ROP-interactive CRIB-containing protein), RIC加强F-
纤维型肌蛋白质在细胞膜上的集结作用, 防止PIN蛋白质家族生长素运输载体的内吞作用。转录调控机制在正文叙述。
韩冰等: 烟草TTG2蛋白质对NPR1介导的抗病防卫反应与ARF8影响的生长发育进行交叉调控的机制 1295
Seilaniantz等2011; Spaepen和Vanderleyden 2011;
Van der Does等2013; Wang等2007; Gaffney等
1993)。绝大多数研究结果显示, 水杨酸在抗病防
卫反应调控过程中与所有其他激素相对抗(Robert-
Seilaniantz等2011; Spaepen和Vanderleyden 2011;
Van der Does等2013; Dong 1998; Navarro等2006;
Wang等2007; Gaffney等1993)。1990~2000年间,
至少有3个研究小组采用不同诱变方法, 对NPR1位
点进行遗传标记与图位克隆(Ryals等1996; Truman
等2010), 先后报道了关于突变体与基因克隆的研
究结果(Cao等1994), 其中2个小组使用了基因异名
NIM1 (non-expressor of immunity 1) (Ryals等1997;
Delaney等1995)和SAI1 (salicylic acid-insensitive 1)
(Delaney 1997)。“殊途同归”的一个原因在于,
NPR1是调控抗病性的一个强势基因, 易于诱导, 诱
导的转录本丰度高, 为遗传标记、突变体筛选与
图位克隆带来了方便(Cao等1997; Ryals等1997;
Mauch-Mani和Mauch 2005; Delaney等1995;
Delaney 1997)。由于水杨酸-NPR1信号转导通路
功能强大, 植物必须预备多种机制予以制衡, 避免
防卫反应失控 , 减少生长发育为此付出的代价
(Mukhtar等2009; Spoel等2009; Cao等1994)。植物
需要强有力的交叉调控因子, 在可以终止防卫反
应、回到正常生长发育程序的时候发挥作用。近
十多年来, 关于植物激素信号转导交叉调控的研
究文献与日俱增, 但文献库(如NCBI PubMed)显示,
个例研究大都偏重防卫反应的一种机制抑制另一
种, 如茉莉酸或乙烯介导的抗虫性对抗水杨酸介
导的抗病性(Robert-Seilaniantz等2011; Spaepen和
Vanderleyden 2011; Van der Does等2013; Dong
1998; Rushton等2008; Todd等2010; Ghanashyam和
Jain 2009; Navarro等2006; Wang等2007; Gaffney等
1993)。这种情况益发凸显对制衡水杨酸-NPR1信
号转导通路、交叉调控生长发育的因子进行研究
的重要性, NtTTG2就是这样一种因子。
4 NtTTG2在烟草中抑制抗病性和促进生长发育
的作用与问题
研究表明, 烟草NtTTG2有抑制抗病性(Li等
2012)、促进生长发育的功能。我们先选用普通烟
烤烟型品种‘NC89’进行研究, 因为它是烤烟优质
品种, 抗病性差, 有助于SAR诱导(Delaney等1995;
Shah等1997; Yu等1998; 董汉松1995); 花在发育过
程中花色由白变红, 有利于从花青素代谢途径与
遗传基础两方面研究调控机制(Chen等2008a; Sun
等2010; Wu等2010)。
我们克隆了‘NC89’的NtTTG2基因, 预测蛋白
符合植物TTG的结构特征(Tanaka等2010), 即含
WD40功能域(Li等2012; Larkin等1994; Vetten等
1997; Petroni和Tonelli 2011; Bouyer等2008; Jiang
等2012; Nguyen等2013; Wang等2009; Tanaka等
2010; Todd等2010; Xu和Min 2011; Peng等2003)。
通过发卡结构介导的基因沉默, 获得了NtTTG2基
因表达水平下调、NtTTG2蛋白产量微弱的4个
‘NC89’转基因系(TTG2RNAi 1~4号)。把花椰菜花
叶病毒35S启动子、NtTTG2与红色荧光蛋白(red-
fluorescent protein, RFP)基因(rfp)构建成融合基因,
转化‘NC89’, 产生了过表达NtTTG2基因、NtTTG2
蛋白产量大幅度提高的4个转基因系(35S/TTG2/rfp
1~4号)。把只含rfp的构建引入‘NC89’, 产生了转
基因系W T / r f p , 用作对照。与W T / r f p相比 ,
TTG2RNAi抗烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,
TMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,
CMV)和大白菜软腐病毒(Pectobacterium carot-
ovorum subsp. carotovorum, Pcc)的能力显著提高,
PR1和PR2表达水平提高4~7倍; 35S/TTG2/rfp感病,
PR1和PR2表达水平降低2~5倍。这说明, NtTTG2
是一个抗病性抑制因子(Li等2012)。
普通烟东方型(香料烟)品种‘Xanthi’及其表达
NahG基因、不积累水杨酸的转基因系被广泛用来
研究水杨酸介导的抗病性(Li等2012; Ryals等1996;
Gaffney等1993; Shah等1997; Yu等1998; 董汉松
1995)。我们分别构建了NtTTG2与NPR1同时过表
达或同时沉默的‘Xanthi’转基因系, 并把NtTTG2基
因过表达与沉默分别引入‘Xanthi’ NahG。与NPR1
或NtTTG2单独过表达的转基因系相比, 同时过表
达这两种基因的转基因系感病性增加; 相反, 无论
NPR1沉默还是NahG表达, 都能弥补NtTTG2过表
达引起的抗病性损失。这表明NtTTG2通过抑制水
杨酸信号转导和NPR1的功能而抑制抗病性。
与抑制抗病性的作用相反, NtTTG2促进烟草
生长发育。NtTTG2基因表达受生长素诱导, 无器
官特异性, 在根、茎、叶、花和果的组织内都能
植物生理学报1296
表达, 说明NtTTG2可能全程参与烟草生长发育。
NtTTG2基因沉默以后, 烟草营养生长与细胞伸展
素基因EXP1、EXP2的表达都受到显著抑制, 但
NtTTG2过表达则促进烟草生长, 提高EXP表达水
平。细胞伸展受包括生长素在内的植物激素诱导
而产生(Pang等2003; 王元琮等2010), 帮助细胞松
弛以便于伸展(Peng等2009), 促进植物生长(Lee和
Kende 2001; Chen等2008b)。因此, NtTTG2通过促
进烟草细胞伸展素基因表达而促进烟草植株营养
生长。但是目前对NtTTG2的功能链尚没有一个比
较完整的认识, 还有一些问题须解决, 如: ARF8仅
是烟草ARF蛋白质家族的成员之一(Rushton等
2008), 其他成员是否介入NtTTG2对烟草生长发育
的调控作用, 不同成员是否有功能冗余性; 另外,
GH3、SAUR、Aux/IAA各自构成基因家族(Cox等
2004; Cosgrove 1998; Lee和Kende 2001; Chen等
2008b), 而生长素反应基因在烟草上只鉴定了3种
(Cosgrove 1998; Lee和Kende 2001; Chen等2008b),
烟草是否还有其他的生长素反应基因, 它们的表
达是否也受NtTTG2与ARF8调控等等。
5 NtTTG2交叉调控NPR1抗病功能与ARF8发育
功能的可能机制
NtTTG2对烟草抗病性与生长发育交叉调控
有十分重要的作用, 也是影响生长素与水杨酸信
号转导交叉调控的重要因子(Li等2012)。NtTTG2
把NPR1扣留在细胞质, 阻止它向细胞核转移, 防卫
反应转录调控作用无从发生, 烟草抗病性因此受
到抑制(Li等2012)。相反, NtTTG2促进ARF8从细
胞质转入细胞核, ARF8对GH3表达的调控作用得
以实现, 烟草生长发育受到促进。因此, 应先从蛋
白质结构与功能的关系 (构效关系 )入手 , 研究
NtTTG2对ARF8与NPR1核质转运的调控机制; 然
后根据生长素与水杨酸信号在细胞核内转导的关
键环节, 研究NtTTG2通过影响CUL1-E3 (图2)与
CUL3-E3 (图1)蛋白质降解酶体, 对ARF8与NPR1
的功能进行调控的机制。
先看NtTTG2构效关系。它与NtTTG1类似,
含典型的WD40功能域(Li等2012; Wang等2009;
Tanaka等2010)。WD40是各类生物多种蛋白质普
遍保守的蛋白质-蛋白质互作功能域(Li等2012;
Larkin等1994; Leon-Kloosterziel等1994; Bouyer等
2008; Tanaka等2010; Todd等2010; Xu和Min 2011;
Petroni和Tonelli 2011; Bombarely等2012; Hagen和
Guifoyle 2002; Dargeviciute等1998), 最早的定义是
含色氨酸(tryptophan, W)与天冬氨酸(aspartic acid,
D)二缩肽(WD)、40个左右氨基酸残基的序列(Xu
和Min 2011), 最新定义为44~60个氨基酸的短肽,
其前半段长11~24个氨基酸, 含甘氨酸(glycine, G)
与组氨酸(histidine, H)二缩肽(GH), 后半段是
WD40 (Petroni和Tonelli 2011) (图3-A)。在不同蛋
白质序列上, WD40以不同数目的重复单元出现,
重复单元之间形成β-螺旋桨(β-propeller)结构, 成为
互作蛋白质之间稳定或可逆结合的平台(Petroni和
Tonelli 2011; Bombarely等2012)。WD40可适时变
换互作对象, 作为底物受体或分子接头, 与性质各
异的蛋白质结合 ( L i等2 0 1 2 ; L a r k i n等1 9 9 4 ;
Guilfoyle和Hagen 2007; Kumar等2012; Lund等
1997)。因此, 含WD40功能域的蛋白质既能与信
号转导调控因子互作, 直接介入细胞信号转导, 也
能充当分子接头, 为其他蛋白质互作牵线搭桥, 借
此影响细胞信号转导(Li等2012; Bouyer等2008;
Tanaka等2012; Todd等2010; Hagen和Guilfoyle
2002; Dargeviciute等1998)。
再看NPR1构效关系。它含一个BTB功能域
和一个IκB功能域, BTB在N-端(Fan和Dong 2002;
Kinkema等2000), IκB位于中部(Cao等1997; Ryals
等1997)。含BTB功能域的蛋白质既可充当CUL3-
E3酶体底物接头, 又可能是酶体的直接底物(Roux
和Perrot-Rechenmann 1997; Xu和Min 2011), 所以
NPR1能结合到CUL3-E3酶体上 (Kinkema等
2000)。IκB既是磷酸化功能域(Kinkema等2000),
也是WD40的互作对象(Roux等1998; Xu和Min
2011)。
虽然NtTTG2、NPR1 (Li等2012)、ARF8都有
蛋白质互作功能域, 但前者与后两者都不能直接
互作, 说明另有协助因子产生影响。如果存在协
助NtTTG2把NPR1扣留在细胞质(Li等2012)的蛋白
质cNPR1d (cytosolic NPR1 detaining protein), 那么,
滞留在细胞质的NPR1就不仅有同源低聚体(Dong
2004; Spoel等2009), 还有异源低聚体或多聚体。
与同源低聚体相比, 异源低聚体或多聚体对NPR1
的功能动态(Mukhtar等2009; Kinkema等2000)可能
韩冰等: 烟草TTG2蛋白质对NPR1介导的抗病防卫反应与ARF8影响的生长发育进行交叉调控的机制 1297
更有制约力。
分子核输入依靠核输入载体(importin, IMP)。
IMP有α和β两种类型 , 以“底物 - IMPβ”或“底
物-IMPα-IMPβ”复合体的方式执行运输功能, 后一
种方式有助于提高底物运输的专化性(Runne和
Chen 2013)。由于IMPα和IMPβ都有穿越核孔的能
力, “底物-IMPα-IMPβ”复合体可以变换接头, IMPα
充当运输载体(Runne和Chen 2013)。ARF8可能以
类似“底物-IMPα-IMPβ”复合体的方式向细胞核转
移, 某种IMPα或类似蛋白质充当ARF8的运输载体
ARF8C (ARF8 carrier protein); NtTTG2处在IMPβ
的位置上, 借助WD40螺旋桨结构(Petroni和Tonelli
2011; Bombarely等2012), 提高ARF8与ARF8C结合
的稳定性。
与ARF8相似, NPR1也必须依靠核输入载体
(NPR1 carrier protein, NPR1C), 才可能进入细胞
核。特别是在细胞水杨酸含量上升(Mukhtar等
2009; Kinkema等2000; Mou等2003)、NtTTG2低于
基础水平(Li等2012)的情况下, 大量NPR1单体进
入细胞核(图1) (Mukhtar等2009; Kinkema等2000),
要求NPR1C有很高的运输效率。NtTTG2对ARF8
与NPR1在细胞核内的功能动态可能也有不同
影响。
先看ARF8。ARF与其束缚蛋白质Aux/IAA之
间存在密切的功能关联。大多数Aux/IAA蛋白质
序列上都有I、II、III、IV功能域(Tada等2008;
Wilmoth等2005; Nitsch 1952), I与II在N-端, I是转
录抑制位点; II是降解子, 把Aux/IAA引到CUL1-E3
酶体SCFTIR1上接受降解, 因此也是TIR1与Aux/IAA
对生长素信号的识别位点; III和IV位于C-端, 都是
互作功能域。大多数ARF蛋白质都有这两个互作
功能域, 序列N-端另有DNA结合位点(nucleotide-
binding site, NBS), 转录激活子与抑制子序列中段
分别富含谷氨酸和丝氨酸(Tada等2008; Nitsch
1952; Calderón等2012; Hayashi 2012; Guilfoyle等
1998; Tiwari等2003)。功能域的保守性为NtTTG2
介入CUL1-E3酶体SCFTIR1提供了可能。已知
CUL4-E3酶体使用含WD40功能域的蛋白质作底
物接头(Xu和Min 2011), SCFTIR1通过含WD40功能
域的蛋白质FBX2来调控植物对低磷胁迫的反应
(Stimimann等2010; Yan和Willis 2013)。这说明含
WD40功能域的蛋白质有可能替换F-box蛋白质,
充当SCFTIR1的底物接头(Xu和Min 2011), 介入
SCFTIR1对Aux/IAA的降解作用, 促进ARF释放与转
录调控的发生。
再看NPR1。在水杨酸含量上升(Mukhtar等
2009; Kinkema等2000; Mou等2003)或NtTTG2低于
基础水平(Li等2012)的细胞核内, NPR1受CUL3-E3
酶体制约, 在调控防卫反应基因表达的同时, 抑制
生长素信号转导(Todd等2010)。低含量ARF8可能
仍然有作用, 借助CUL1-E3酶体而释放并行使转录
调控功能, 以保持植物生长发育。因此, CUL3-E3
作为水杨酸抑制生长素信号转导的一个要素, 与
CUL1-E3可能有功能对抗关系。
已知交叉环节有生长素信号识别(TIR1)与转
导(AXR2) (Todd等2010), ARF作为生长素反应基
因的转录因子(Wilmoth等2005; Julliard等1992;
Nitsch 1952; Calderón等2012; Hayashi 2012), 也必
然介入。水杨酸这方, 受体(NPR3、NPR4) (Fu等
2012; Shi等2012)与调控NPR1核质动态的因子(如
WRKY) (Eulgem和Somssich 2007)和Trx (Yu等
1998)), 都可能参与水杨酸对生长素信号转导的抑
制作用。这个问题涉及NtTTG2-ARF8与TTG2-
NPR1功能链的构成, 也关系烟草抗病性与生长发
育交叉调控的运行机制。
6 结语
本文的一个核心问题是, NtTTG2如何通过核
质转运与蛋白质降解机制, 对ARF8与NPR1的功能
动态进行调控, 从而交叉调控植物抗病性与生长
发育。围绕这个核心问题进行研究, 期望通过这
一个例, 揭示作物抗病防卫反应与生长发育交叉
调控以合乎自然规律的方式而运作的机制: 作物
在病害循环过程中, 如何有效实现生长发育与防
卫反应之间的转变, 用最低的适应性代价完成对
病原物侵染与致病性的有效抵御, 并及时终止防
卫反应, 迅速恢复生长发育进程。
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