全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (2): 167–176　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0673 167
收稿 2015-12-16　　修定 2016-01-19
资助 国家自然科学基金委重点项目(31130006)。
致谢 感谢Salk研究所基因组研究实验室(Salk Institute Genomic
Analysis Laboratory)以及俄亥俄州立大学拟南芥生物资源
中心(Ohio State University Arabidopsis Biological Center)
为本研究提供chal、chal cll1、chal cll2、以及chal cll1 cll2
突变体种子。
* 通讯作者(E-mail: fangchang@fudan.edu.cn)。
胞外多肽激素基因CHAL/CLL1/CLL2在拟南芥雄蕊发育过程中发挥重要
作用
何卓娜1,2, 王双双1,2, 马红1,2, 常芳1,2,*
复旦大学1生命科学学院, 2植物科学研究所, 上海200438
摘要: 细胞-细胞间通讯是雄蕊正常发育过程所必需的, 然而目前对于参与此过程的信号分子却鲜有报道。前期报道CHAL/
CLL1/CLL2胞外多肽激素在拟南芥气孔发育过程中发挥重要作用, 但是chal cll1 cll2三突变体同时表现出植株育性异常的
表型。然而, 这三个基因在植物雄蕊发育过程中的表达和具体功能并未见深入研究。本研究发现CHAL/CLL1/CLL2这三个
基因在拟南芥花丝及5-9期花药的绒毡层和生殖细胞中高表达。同时, 对三个基因功能缺失突变体的雄性育性情况进行分
析后发现: 单基因突变植株未表现出明显的育性异常, 但双突(chal cll1和chal cll2)和三突(chal cll1 cll2)植株育性逐级下降,
尤其是三突表现出一系列雄蕊异常的表型: 花丝短小、花药绒毡层发育异常、部分花粉败育, 且花粉萌发率亦较野生型有
显著降低。进一步研究发现, chal cll1 cll2三突变体中雄蕊发育途径中关键基因BAM1、EMS1、TPD1、bHLH089、
TSM1、MS1和AMS的表达水平发生显著变化。以上结果一致表明CHAL/CLL1/CLL2基因在拟南芥雄蕊发育过程中发挥重
要作用。
关键词: 拟南芥; 花药; 胞外多肽激素; CHAL、CLL1、CLL2。
雄蕊是植物重要的生殖器官, 其正常发育直
接影响到植物传种接代和农作物的产量。研究植
物雄性生殖器官-花药的正常发育过程、揭示调控
此过程的重要信号传导网络, 对于通过遗传改良
增加作物产量具有重要意义。而且, 雄性不育系
还是作物育种的关键材料。
在雄蕊发育过程中, 胞外多肽激素和受体激
酶介导的细胞-细胞间信号传递在协调早期雄蕊细
胞分裂分化、以及后期生殖细胞发育的过程发挥
重要作用。已有的研究表明: 细胞外多肽TPD1
(TAPETUM DETERMINANT 1)和受体蛋白激酶
EMS1/EXS (EXCESS MICROSPOROCYTES1/EX-
TRA SPOROGENOUS CELLS)作为复合物调节绒
毡层的分化与功能(Canales等2002; Jia等2008;
Yang等2003, 2005; Zhao等2002); 受体蛋白激酶
ER/ERL1/ERL2 (ERECTA/ERECTA-LIKE 1/
ERECTA-LIKE 2)功能冗余的调控花药细胞早期分
化以及药室数目(Hord等2008); 受体蛋白激酶
BAM1/2 (BARELY ANY MERISTEM1/2)功能冗余
地调节花药早期体细胞和生殖细胞的协调分化
(Hord等2006)。相对而言, 胞外多肽因为序列相对
较短、相应突变体少等特点, 目前在雄蕊发育过
程中功能的研究相对较少。而对于胞外多肽激素-
受体激酶共同作用、协调细胞分裂分化的研究更
是罕有报道。
EPFL (EPIDERMAL PATTERNING FAC-
TOR-LIKE)家族是一类编码45~75个氨基酸长度的
小分子胞外多肽的基因家族, 其家族成员编码的
氨基酸序列通常具有N端的分泌信号序列和C端的
6个或8个相对保守的半胱氨酸残基 (Kondo等
2009; Sugano等2009; Takata等2013)。EPFL家族在
拟南芥中共有11个成员, 参与植物的多种发育过程
(Rychel等2010)。例如: EPF1、EPF2和EPFL9/
Stomagen在气孔发育过程中发挥重要作用(Hara等
2007; Hunt和Gray 2009; Jewaria等2013; Hunt和
Gray 2010)。其中EPF1和EPF2在气孔中表达, 而
EPFL9/Stomagen则在叶肉细胞中表达, 三者都是
通过受体激酶TMM (TOO MANY MOUTH)来调
节气孔发育; EPFL4/CLL2和EPFL6/CHAL都能够
和ER (ERECTA)受体激酶相互作用, 并功能冗余地
介导表皮细胞和韧皮部细胞的信号交流, 并最终
调控拟南芥花序的结构(Uchida等2012)。
在EPFL基因家族的11个成员中, EPFL5/CLL1
(CHALLAH-LIKE1)和EPFL4/CLL2的C端与EPFL6/
植物生理学报168
CHAL的C端氨基酸序列高度保守(同一性为17/18),
因此3个基因被统称为CHALf (CHAL family)配基
(Abrash等2011)。此外 , 除了调控气孔发育 ,
CHALf多肽激素作为ER家族基因的配基还调控植
株的高度、花梗的长度、以及花序的紧凑度等方
面(Abrash和Bergmann 2010; Abrash等2011; Uchida
等2012; Uchida和Tasaka 2013)。 有意思的是, chal
cll1 cll2三突变体植株育性明显异常(Abrash等
2011) , 但这三个基因在育性调控方面的功能研究
并未见深入报道。
因此, 本文通过启动子驱动GUS报告基因以
及RNA原位杂交深入研究了CHAL、CLL1和CLL2
基因在拟南芥花序及雄蕊中的表达模式, 并进一
步以单突、双突和三突变体植株为材料, 系统分
析了突变体植株在雄性育性方面的表型, 检测了
突变体植株中与花药发育相关的重要基因的表达
情况, 最终揭示了这三个基因是通过调节雄蕊发
育重要基因的表达而在雄蕊花丝伸长、花药绒毡
层及小孢子发育过程中发挥重要功能。
材料与方法
1 植物材料和植物培养
本研究所用到的拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)
材料均为哥伦比亚(Columbia)生态型背景。包括:
拟南芥野生型(Col-0)、CHAL单突变体植株(chal-2)、
以及CHAL分别与CLL1、CLL2的双突变体植株
(chal-2 cll1-1、chal-2 cll2-1)和三突变体植株(chal-2
cll1-1 cll2-1)。突变体植株均来自于俄亥俄州立大
学拟南芥生物资源中心[Arabidopsis Biological
Resource Center (ABRC), Ohio State University]。
本文所有拟南芥材料均种植于复旦大学人工
气候室。种植条件为: 温度22°C, 湿度为65%, 光周
期16 h/8 h (光/暗)。
2 Promoter::GUS双元载体构建及转基因植物的
筛选
TAIR网站(www.arabidopsis.org)上检索获得
CHAL、CLL1、CLL2基因序列信息, 并设计引物
扩增基因启动子及基因全长(表1)。PCR扩增所得
特异性DNA片段通过BP反应重组入pDoNR载体,
后转化大肠杆菌DH5α, 在含博来霉素抗生素(50
g·mL-1)的2×YT固体培养基上筛选pDoNR-CHAL::
CHAL、pDoNR-CLL1::CLL1和pDoNR-CLL2::CLL2
质粒的阳性克隆, 并进一步通过测序进行序列验
证。序列正确的质粒与PGWB3进行LR重组反应,
转化大肠杆菌DH5α, 然后在含有卡那霉素的(50
g·mL-1)培养基上分别筛选含有pGWB3-CHAL::
表1 本研究中所用的引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 引物序列(5—3) 用途
CHAL-in situ-F1 CCACTTCGACTTCTTCTCCAT In situ
CHAL-in situ-R1 TCCGGTCACCGATCTTCCTA In situ
CLL1-in situ-F1 CTCACCGGTCCTGGCTAATG In situ
CLL1-in situ-R1 CCTGGTTGAATCGGAACGTG In situ
CLL2-in situ-F2 TGCACTCGTCACATTTGCTCT In situ
CLL2-in situ-R2 GAGAAGCACAAGAAATGAGG In situ
CLL2-RealTime-F2 CCACCGACGTGTAGATCGAA 定量PCR
CLL2-RealTime-R2 CTTGTTGCCACACTTGCACC 定量PCR
CLL1-RealTime-F CTCACCGGTCCTGGCTAATG 定量PCR
CLL1-RealTime-R CCTCCACTGGGACGTTGAAG 定量PCR
CHAL-RealTime-F TTCTATGCAAAGGAGGAAGGCA 定量PCR
CHAL-RealTime-R CGGAGTGCATCTTCCACACT 定量PCR
CLL2(P+G)-F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGTCGGATTACTGGTTTAATAAGATG 载体构建
CLL2(P+G)-R GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGGGCATGAAGAGCTTGTTGC 载体构建
CLL1(P+G)-F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTAGGGTTGAAGGTTGATTATCAAGTGAT 载体构建
CLL1(P+G)-R GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGGGCATGAAGAGTTTGTTGCCAC 载体构建
CHAL(P+G)-F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACTTACCAAAGACTATTCTTTCACGT 载体构建
CHAL(P+G)-R GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTGGCATGTACAACTTGTTGCC 载体构建
　　P表示promoter序列, G表示对应gene序列。
何卓娜等: 胞外多肽激素基因CHAL/CLL1/CLL2在拟南芥雄蕊发育过程中发挥重要作用 169
CHAL-GUS、pGWB3-CLL1: :CLL1-GUS和
pGWB3-CLL2::CLL2-GUS质粒的阳性克隆。
测序正确的克隆提取质粒后分别转化到农杆
菌中, 在含有卡那霉素(50 g·mL-1)、利福平霉素(50
g·mL-1)、庆大霉素(50 g·mL-1)三抗的LB培养基中
筛选带有阳性质粒的农杆菌克隆。然后, 通过农
杆菌浸花法浸染拟南芥Col-0植株。T0代转基因种
子铺于带有潮霉素抗性的1/2MS培养基(25 g·mL-1
潮霉素, 1%蔗糖浓度)上筛选2周, 移栽抗性苗至土
中, 正常光照培养。待开花时, 取花序进行GUS染
色, 拍照。
3 原位杂交探针的制备和检测
首先分别将 CHAL, CLL1和CLL2三个基因的
cDNA序列在NCBI网站上进行序列比对, 找到各
自基因特异的cDNA序列设计探针引物(表1)。然
后以拟南芥花序cDNA为模板, 扩增各自探针序列,
链接至pGEM-T载体, Amp抗生素筛选及测序得到
阳性克隆。分别用Apal酶和Spe酶剪切成线性片段
后, 对应用SP6和T7分别转录, 纯化anti-sense和
sense探针。
取Col-0的整朵花序用RNase free的多聚甲醛
固定液进行固定, 真空抽气10 min, 至材料沉底, 更
换一次新鲜固定液, 4°C静置过夜; 4°C乙醇逐级脱
水; 依次更换至50%二甲苯-50%乙醇1次、75%二
甲苯-25%乙醇1次、100%二甲苯2次以透明化植
物组织; 然后将植物材料置入50%二甲苯-50%石
蜡溶液中 , 60°C过夜; 最后更换为纯石蜡浸蜡 ,
60°C保温, 每12 h更换一次石蜡, 共6次, 然后包埋
成块。包好的蜡块4°C保存。切片、粘片、杂
交、显色、脱色、封片等按Coen等(1990)的方法
进行。
4 亚历山大红染色
亚历山大红染色方法参照Peterson等(2010)的
方法进行。取拟南芥Col-0和突变体植株已经露白
的12期的花于卡诺溶液中固定过夜。挑取5~10朵
花朵放入亚历山大红染料中 , 室温静置染色30
min。在解剖镜下剥去花萼、花瓣和雌蕊, 只留下
花药。然后用盖玻片盖住 , 轻轻按压。在配有
AXIO Cam HRc 相机的AXIO Scope A1荧光显微
镜(Zeiss)下观察、拍照。
5 半薄切片
首先材料固定: 取拟南芥野生型和突变体的
花序放入装有FAA固定液的青霉素小瓶中, 抽真
空, 直至组织材料完全下沉, 更换新的FAA溶液,
4°C过夜保存。脱水: 分别为70%、85%和95%酒
精各30 min; 100%乙醇处理2 h, 2次。在第2次加入
少许的伊红染料, 使组织着色。预渗透: 倒掉酒精,
然后加入适量预渗透溶液, 即无水乙醇和Base liq-
uid Technovit 7100等体积混匀, 渗透1~2 h。渗透:
倒掉预渗透液, 加入适量的渗透液, 即1 g硬化剂1
溶于100 mL的Base liquid Technovit 7100溶液中,
渗透3 h-过夜。包埋: 将1 mL的硬化剂2加入到15
mL的渗透液中, 混匀, 然后200 μL包埋一个孔板
中。调整花序的摆放, 然后放置在42°C热板上缓
慢凝固, 在移至65°C干燥箱中烘干, 切片。在半薄
切片机上进行切片, 厚度为1 μm。
6 RNA提取及SuperReal荧光实时定量PCR
分别取两朵Col-0和chal cll1 cll2三突变体花
序, 按照Quigen公司植物总RNA试剂盒(THE Epi-
genetics COMPANY, R2024)流程提取总RNA。电
泳检测RNA完整性, 并利用Nano Drop2000 (Ther-
mo SCIENTIFIC 公司)测定RNA浓度和质量。
使用ABI StepOnePlus 荧光定量PCR仪进行荧
光实时定量PCR实验。PCR体系: 10 μL SYBR pre-
mix ExTaqII, 0.4 μL ROX Reference Dye, 适量
cDNA模板, 正反向引物各0.5 μL, mili-Q水补充至
20 μL。扩增标准程序: 预变性95°C 30 s; 95°C 5 s;
60°C 30 s; 95°C 15 s; 60°C 15 s。循环40个。以野
生型作为对照, EF1α基因作为内参, 用2-ΔCT方法进
行运算。所用引物见(表1)。
7 花粉萌发
按照Lin等(1996)的方法。新鲜开放的野生型
及突变体的花, 室内干燥2 h, 然后将花粉轻轻涂抹
在新鲜配制的固体花粉萌发培养基表面。22°C避
光保湿培养5 h后观察、拍照。
花粉萌发培养基配方如下: 18%蔗糖、0.01%
Broic acid、1 mmol·L-1 CaCl2、1 mmol·L
-1 MgSO4、
1 mmol·L-1 Ca(NO3)2和0.5%琼脂。调pH值到7.0
使用。
实验结果
1 CHAL/CLL1/CLL2基因在花及花药中均有较高
水平的表达
为了明确CHAL、CLL1和CLL2在生殖发育过
植物生理学报170
程中的可能的功能, 研究组首先分析了3个基因在
拟南芥花序中的表达情况。对3个基因的自身启
动子驱动GUS报告基因的转基因植物花序的染色
分析结果表明: CHAL和CLL2在花序组织中有很高
的表达, 包括12期的花丝和花药(图1-A、D和C、
F); 而CLL1只在早期的花苞中表达, 在12期的花丝
和花药中没有表达(图1-B、E)。此结果暗示CHAL
和CLL2在可能在整个花发育过程中均发挥功能,
而CLL1则可能只在花早期发育过程中发挥重要作
用。同时, CHAL和CLL2在花药和花丝中均有表
达, 暗示其在花药发育以及花丝伸长的过程中可
能存在重要作用。
进一步以拟南芥1~12期花序为材料的荧光定
量PCR数据也表明: CHAL、CLL1、CLL2这三个
基因在花序中均有表达, 并且CHAL表达最高, 其
次是CLL2, 再次是CLL1 (图2-A)。4~7期花药的
RNA-seq数据进一步表明CHAL、CLL1、CLL2基
因在花药4~7期中的表达(图2-B), 暗示这三个基因
可能在花药发育过程中发挥重要功能。
2 CHAL/CLL1/CLL2在花药绒毡层和花粉母细胞
中特异表达
为了更进一步明确CHAL、CLL1和CLL2基因
在花药发育过程中的时空表达模式, 本研究通过
RNA原位杂交的方法检测了以上三个基因在花药
不同发育阶段的表达水平。结果如图3所示, CHAL
基因从第5期开始在花粉母细胞和绒毡层中表达,
持续至第8期开始减弱至信号消失(图3-A~G)。
图2 CHAL/CLL1/CLL2基因在花序组织
和花药中的表达水平
Fig.2 Expression level of CHAL/CLL1/CLL2 genes
in the anther and the flower
A: 将CHAL、CLL1、CLL2基因的表达量分别减去内参基因
EF1α基因的表达量后得到ΔCT, 在用2-ΔCT方法进行运算得到的值
表示。生物学样本重复3次。B: 数据是通过收集花药的4~7期的
花药进行转录组测序获得。
图1 CHALpro::CHAL-GUS, CLL1pro::CLL1-GUS和CLL2pro::CLL2-GUS转基因植物的GUS染色分析
Fig.1 GUS staining analysis of CHALpro::CHAL-GUS, CLL1pro::CLL1-GUS and CLL2pro::CLL2-GUS transgenic plants
A、D: CHALpro::CHAL-GUS; B、E: CLL1pro::CLL1-GUS; C、E: CLL2pro::CLL2-GUS。A~C的标尺为5 mm, D~F的标尺为10 mm。
何卓娜等: 胞外多肽激素基因CHAL/CLL1/CLL2在拟南芥雄蕊发育过程中发挥重要作用 171
CLL1基因第5期在花药绒毡层和小孢子母细胞有
较弱的表达, 第6期在这两层细胞中表现出更高水
平的表达, 一直持续至第8期, 之后表达水平减弱
(图3-H~O)。CLL2在第5期开始在花粉母细胞和绒
毡层中高表达 , 一直延续到第8期开始减弱(图
3-P~V)。 CHAL、CLL1和CLL2在花药绒毡层、小
孢子母细胞和小孢子中的表达暗示了三者在花药
发育过程中的重要作用。同时, 三者表达模式的
相似性进一步表明它们在功能上的相关性, 很有
可能是功能冗余的发挥功能。
3 CHAL/CLL1/CLL2基因功能缺失导致雄蕊发育
异常
Abrash等曾报道了chal、chal cll1、chal cll2
和chal cll1 cll2突变体植株的果荚相较野生型有不
同程度的缩短, 暗示这三个功能冗余的基因可能
参与到植物的育性调节过程。但文中并未对这一
现象进行详细的分析。为了明确突变体育性的异
常表型, 以进一步揭示CHAL/CLL1/CLL2基因在生
殖发育过程中的功能, 本研究首先对野生型Col-0、
chal、chal cll1、chal cll2和chal cll1 cll2突变体花
及花药的形态进行了分析。结果如图4所示, 与野
生型相比, CHAL/CLL1/CLL2基因单突、双突、及
三突的花都具有和野生型相同的四轮花器官数目
(图4-A~E)。野生型Col-0、chal、chal cll1和chal
cll2植株雌蕊的柱头上可见黄色花粉黏附, 相比之
下, chal cll1 cll2三突变体雄蕊的花丝显著的比野
生型短小、 雌蕊的柱头未见黄色成熟花粉黏附
(图4-F~J), 表明这三个基因可能功能冗余的在花
丝伸长的调控上发挥重要作用。
为了进一步分析CHAL、CLL1和CLL2基因在
花药发育过程中的功能, 本研究通过亚历山大红
染色对Col-0、chal、chal cll1、chal cll2和chal cll1
cll2突变体的花粉活性进行了检测。染色后可育
(紫红色)和不育(蓝灰色)的花粉将会呈现不同的颜
色。结果如图1所示, 野生型花药内分布大量可育
的花粉, 未见败育的花粉; chal、chal cll1和chal
cll2花药中, 花粉数目略有减少, 但未见败育花粉,
说明花粉发育过程基本正常; 相比之下, chal cll1
cll2三突表现出不同程度的花粉败育现象(图4-O~
P): 有的花粉完全败育, 有的花药中同时存在可育
和败育的花粉。这些结果表明CHAL/CLL1/CLL2
这三个基因功能冗余的在花药发育过程中发挥重
要作用。
4 CHAL/CLL1/CLL2基因调节花药绒毡层早期发
育和降解
为了更进一步检测chal cll1 cll2三突花粉败育
的关键环节, 本研究通过半薄切片的方法观察了
花药发育各时期的形态变化。如图5所示, 野生型
Col-0花药有4个药室, 每个药室由5层细胞组成: 由
内至外分别为生殖细胞、绒毡层(tapetum)、内皮
图3 CHAL、CLL1和CLL2基因在花药中的表达模式
Fig.3 Expression patterns of CHAL, CLL1 and CLL2 genes in anthers
A~G: 表示CHAL基因在花药5~11期的的表达; H~O: CLL1基因在花药5~11期的的表达; P~V: CLL2基因在花药5~11期的的表达。
sense: 正义链所作的负对照。标尺为10 µm。
植物生理学报172
图4 Col-0、chal, chal cll1、chal cll2和chal cll1 cll2花的形态
Fig.4 Phenotypic analyses of the Col-0 and different CHAL/CLL1/CLL2 gene mutants
A、F、K: 分别表示Col-0野生型的花俯视图、花正视图以及花药亚历山大红染色情况。B、G、L分别表示chal单突突变体的花俯视
图、花正视图以及花药亚历山大红染色情况。C、H、M分别表示chal cll1双突突变体的花俯视图、花正视图以及花药的形态。D、I、N
分别表示chal cll2双突突变体的花俯视图、花正视图以及花药亚历山大红染色情况。E、J、O分别表示chal cll1 cll2三突突变体的花俯视
图、花正视图以及花药亚历山大红染色情况。O~P表示chal cll1 cll2三突突变体花药败育的两种不同程度的败育。A~J中的标尺为10 mm,
K~P的标尺为25 mm。
层(endothecium)、中间层(middle layer)和表皮层
(epidermis)。在花药第5期, 野生型花药的绒毡层
细胞近似正方形, 并且有序的排列成一圈, 规则地
环绕在小孢子母细胞外围; 第6期, 生殖细胞(小孢
子母细胞)进行减数分裂并于第7期完成减数分裂
形成四分体; 第8期, 包裹四分体的胼胝质降解、
小孢子得以独立释放, 并且在后续的9~12期完成
花粉的发育和成熟。相比之下, chal cll1 cll2植株
第5期花药的绒毡层细胞形状不规则, 排列松散、
数目多、局部区域呈现两层(图5-E)。这种绒毡层
的异常一直持续到绒毡层降解完全(图5-E~H和
L~M)。这些结果说明CHAL/CLL1/CLL2在调控绒
毡层的数目和规则排列上发挥重要功能。另外,
Col-0的绒毡层细胞到花药发育的第12期已经全部
降解完全, 而同一时期的chal cll1 cll2却依然存在
完整的绒毡层, 说明CHAL/CLL1/CLL2也参与了绒
毡层的降解过程。
5 CHAL/CLL1/CLL2基因参与花粉萌发过程
CHAL/CLL1/CLL2三基因功能缺失的三突变
体花粉育性下降、绒毡层发育和降解异常, 但仍
存在少量亚历山大红染色正常的花粉(图4-O~P)。
因此, 本研究又进一步检测了这些亚历山大红染
色正常的花粉是否具有正常的萌发和花粉管伸长
能力。结果表明: 与野生型相比, chal cll1、chal
cll2、chal cll1 cll2突变体的花粉萌发率均出现不
同程度的降低(图6)。其中chal cll1 cll2萌发率最
低, 仅为17.4%, 大大低于野生型98.8%的萌发率,
而chal cll1和chal cll2两个双突也仅分别为40.0%
和51.4% (图6-E), 表明CHAL、CLL1和CLL2在花
粉萌发过程中也发挥重要功能, 且功能冗余。
6 CHAL/CLL1/CLL2基因共同调控花药和花粉发
育途径相关下游基因的表达
为了明确这三个功能冗余的基因可能影响的
下游基因和重要发育途径, 本研究以野生型和三
突变体植株的花序组织为材料, 分别检测了一些
已知在花药和花粉发育过程中发挥重要功能的基
因的表达水平。结果显示: 与野生型相比, 花药早
期发育的重要转录因子S P L、受体蛋白激酶
何卓娜等: 胞外多肽激素基因CHAL/CLL1/CLL2在拟南芥雄蕊发育过程中发挥重要作用 173
BAM1、EMS1、以及EMS1可能的配基TPD1的表
达水平均有明显变化(图7-A)。同时, 调控花粉发
育及花粉外壁形成的重要基因A7、CYB704B1、
TSM1、CYB703A2等基因也显著上调(图7-B)。另
外, 在绒毡层发育和功能行使过程中发挥重要作
用的转录因子bHLH089、bHLH010、AMS、MS1
也发生了显著变化(图7-C)。进一步表明CHAL/
CLL1/CLL2通过功能冗余的调控绒毡层以及花粉
外壁形成相关的信号途径核基因表达, 从而在雄
蕊的发育和育性调节过程中发挥重要作用。
讨　　论
1 CHAL/CLL1/CLL2功能冗余的在拟南芥花药发
育过程发挥重要作用
植物雄蕊的正常发育直接影响作物的传种和
产量, 而花药的正常发育是雄蕊正常传粉的关键
因素, 因此研究调节花药的正常发育过程和了解
调控此过程的重要信号传导网络, 对于提高作物
的育性和产量具有重要的意义。目前, 关于花药
发育相关的基因, 已有一些功能及其分子机制的研
究, 但大都局限于各自单独功能的及调控的研究,
对其调控网络的研究还相当少。此外, 花药正常发
育过程的不同细胞间的协调分裂、分化、以及相
互之间的通讯也不清楚。本文通过对其CHAL、
CLL1和CLL2相关的单基因突变植株, 双基因突变
和三基因突变植株育性进行分析发现 : 花丝长
度、花药绒毡层和花粉萌发率出现程度递进的下
降, 表明三个基因在调控这些过程中功能冗余。
拟南芥中一共有11个EPFL成员, 并且这些成
员在序列上高度保守(Takata等2013)。因此推测这
图5 野生型和chal cll1 cll2突变体的花药半薄切片
Fig.5 Semi-thin cross-sections of Arabidopsis wild type and chal cll1 cll2 triple mutant anthers
图中展示的是花药4个药室中的一个。A~D、I~K: Col-0野生型花药。E~H、L~N: chal cll1 cll2突变体花药。A、E: 第5期; B、F: 第6
期; C、G: 第7期; D、H: 第8期; I、L: 第9期; J、M: 第10期; K、N: 第12期。E: 表皮层; EN: 内皮层; ML: 中间层; T: 绒毡层; Ms: 小孢子母
细胞; Tds: 四分体; MSp: 小孢子。标尺为10 µm。
植物生理学报174
些序列高度相似的EPFL成员功能上的差异可能在
一定长度上取决于其表达模式的差异。本研究关
注的3个EPFL成员序列高度保守、在花序、雄
蕊、以及花药的不同表达时期和表达位置上均高
度相似, 进一步表明三者在调控花药发育、花丝
伸长、以及花粉发育过程中的功能冗余。
2 CHAL/CLL1/CLL2基因影响花药发育的可能机制
花药的发育过程中, 花药不同细胞层之间的
信号交流和相互协调对于形成正确的花药结构和
功能至关重要。而细胞-细胞间的信号交流则必需
胞外多肽和受体激酶介导信号传导途径。CHAL/
CLL1/CLL2作为功能冗余的基因, 其编码的小分子
多肽在介导拟南芥叶片气孔发育过程中的功能已
被报道: CHAL/CLL2和ER/ERL1相互作用, 可能
作为配基-受体复合物进一步激活下游途径进而调
节气孔的发育、气孔密度(Abrash和Bergmann
2010; Abrash等2011; Uchida等2012; Uchida和Tasaka
2013)。Hord等(2008)也报道了ER/ERL1/ERL2基因
在花药的发育过程中同样发挥着重要作用, 主要
影响花药药室数目以及组成药室的五层细胞的发
育。鉴于CHAL/CLL1/CLL2和ER/ERL1/ERL2均在
雄蕊表达, 并且突变体均表现出雄性育性显著下
降的表型, 推测可能在雄蕊发育的过程中也作为
配基-受体复合物发挥重要功能。当然, 进一步验
图6 野生型和CHAL/CLL1/CLL2三基因不同
突变体花粉萌发情况
Fig.6 Pollen germination analysis of WT and different mu-
tants of CHAL/CLL1/CLL2 genes
A~D: 分别表示Col-0、chal cll1、chal cll2、chal cll1 cll2的花
粉萌发情况; E: 花粉萌发率。**表示chal cll1、chal cll2和chal cll1
cll2突变体花粉萌发率较野生型有显著差异(P<0.01)。图中标尺为
25 μm。
图7 一些与花药发育相关的重要下游基因在野生型和chal
cll1 cll2 三突变体花序中的表达情况
Fig.7 Relative expression of several Arabidopsis anther genes
in the Col-0 and chal cll1 cll2 triple mutant inflorescence
何卓娜等: 胞外多肽激素基因CHAL/CLL1/CLL2在拟南芥雄蕊发育过程中发挥重要作用 175
证这种假设还需要一系列的生化、遗传、及细胞
生物学的分析。
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植物生理学报176
Peptide hormones CHAL, CLL1, and CLL2 are important for stamen develop-
ment in Arabidopsis
HE Zhuo-Na1,2, WANG Shuang-Shuang1,2, MA Hong1,2, CHANG Fang1,2,*
1School of Life Sciences, 2Institute of Plant Biology, Fudan University, Shanghai 200438, China
Abstract: Cell-cell communication is important for normal anther development and male fertility, but little is
known about signals important for this process. The polypeptide hormones CHAL/CLL1/CLL2 are redundantly
required for normal stomata cell development in Arabidopsis, but the chal cll1 cll2 triple mutants exhibited re-
duced fertility. However, the function of the CHAL/CLL1/CLL2 genes in the regulation of Arabidopsis fertility
has not been investigated. In this study, we showed that the CHAL/CLL1/CLL2 genes were highly expressed in
anther filaments, tapetal cells, and male reproductive cells at anther stage 5–9. Single mutants of the CHAL/
CLL1/CLL2 genes did not show obvious fertility defects, but the double (chal cll1 and chal cll2) and triple mu-
tants (chal cll1 cll2) showed incremental defects in fertility: short filaments, abnormal tapetal development,
aborted pollens, and extremely low pollen germination rate. Further studies showed that, the expression of
many anther development-required genes were obviously altered in the chal cll1 cll2 triple mutant, including
BAM1, EMS1, TPD1, bHLH089, TSM1, MS1, and AMS. These data together strongly support the idea that
CHAL/CLL1/CLL2 play important roles in Arabidopsis stamen development.
Key words: Arabidopsis thaliana; anther; polypeptide hormone; CHAL, CLL1, CLL2
Received 2015-12-16 Accepted 2012-01-19
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31130006).
*Corresponding author (E-mail: fangchang@fudan.edu.cn).