全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (12): 2126~2132　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.10252126
收稿 2015-10-27　　修定 2015-12-02
资助 国家自然科学基金(31170261)和教育部博士点基金优先发
展领域课题(20130031130003)。
* 通讯作者(E-mail: wangnn@nankai.edu.cn; Tel: 022-
23504096)。
‘Micro-Tom’番茄SlSARK-like基因克隆及初步功能分析
王凤凤, 赵曦娟, 王丹, 苏杨起, 梅圆圆, 王宁宁*
南开大学生命科学学院, 天津300071
摘要: 从‘Micro-Tom’番茄(Solanum lycopersicum)中分离克隆了一个与叶片衰老相关、编码LRR型类受体蛋白激酶(recep-
tor-like protein kinase, RLK)的基因。序列分析显示, 该基因的编码产物与大豆和拟南芥中的SARK (SENESCENCE-ASSO-
CIATED RECEPTOR-LIKE KINASE)类似, 都具有典型的LRR-RLK结构, 且可能具有丝/苏氨酸和酪氨酸双底物特异性激酶
活性, 因此命名为SlSARK-like。半定量RT-PCR分析表明, 无论是自然衰老还是AtSARK过表达诱导衰老的‘Micro-Tom’叶片
中, SlSARK-like基因的表达水平都明显提高。进一步利用农杆菌介导的番茄转化技术获得了6个GVG:SlSARK-like转基因
‘Micro-Tom’株系, 发现DEX诱导SlSARK-like基因过表达导致转基因植株早衰, 说明SlSARK-like基因对‘Micro-Tom’叶片衰
老起正向调控作用。上述研究结果进一步支持了编码LRR-RLK的SARK基因参与叶片衰老调控的机制普遍存在于高等植
物中。
关键词: ‘Micro-Tom’番茄(Solanum lycopersicum); LRR型类受体蛋白激酶; SlSARK-like; 叶片衰老
Cloning and Preliminary Functional Analysis of SlSARK-like Gene in ‘Mi-
cro-Tom’ Tomato
WANG Feng-Feng, ZHAO Xi-Juan, WANG Dan, SU Yang-Qi, MEI Yuan-Yuan, WANG Ning-Ning*
College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China
Abstract: In this research, we reported the cloning and functional analysis of SlSARK-like gene in ‘Micro-Tom’
tomato (Solanum lycopersicum) that shares high similarity to SARK (SENESCENCE-ASSOCIATED RECEP-
TOR-LIKE KINASE) genes in soybean (Glycine max) and Arabidopsis thaliana. The encoded protein contains
typical domains of LRR receptor-like kinase and may also auto-phosphorylate on both serine/threonine and ty-
rosine residues. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that the expression of SlSARK-like was significant-
ly increased during both natural senescence and AtSARK-induced precocious senescence in ‘Micro-Tom’. Fur-
thermore, we obtained six GVG:SlSARK-like transgenic ‘Micro-Tom’ lines by Agrobacterium-mediated
transformation method, and we found that DEX-induced overexpression of SlSARK-like caused precocious se-
nescence in the transgenic ‘Micro-Tom’ tomato. Taken together, these results imply that SARK-induced leaf se-
nescence may be a common mechanism in higher plants.
Key words: ‘Micro-Tom’ tomato (Solanum lycopersicum); LRR receptor-like protein kinase; SlSARK-like; leaf
senescence
衰老是叶片生长发育的最后阶段, 是一个细
胞程序性死亡的过程, 这一过程实现了衰老的叶
片中营养物质向幼嫩的器官和种子中转移。叶片
衰老对营养物质的充分利用、提高植物的抗逆性
等具有重要的意义(Lohman等1994)。但另一方面,
对于大多数农作物来说, 早衰会降低作物的产量
和品质(Gan和Amasino 1995; Rivero等2007; Breeze
等2011)。叶片衰老是由外界多种环境因子和内部
发育信号协同控制的(Yoshida 2003; Guo和Gan
2005)。近年有关叶片衰老调控机制的研究已经取
得了很大进展, 但关于叶片衰老信号转导的途径、
植物体内部信号和外界环境因子之间如何“对话”
(cross-talk)等仍不清晰。
植物类受体蛋白激酶(receptor-like protein ki-
nases, RLKs)是一类包含胞外域、单次跨膜域和胞
内激酶域的蛋白分子, 可以通过独特的胞外受体
域特异识别并结合胞外信号分子, 通过单次跨膜
王凤凤等: ‘Micro-Tom’番茄SlSARK-like基因克隆及初步功能分析 2127
域的传递来激活胞内激酶域的自磷酸化和催化磷
酸化活性(Walker 1994)。目前, 在植物中已鉴定的
类受体激酶绝大多数属于LRR型, 该类型的激酶的
N-末端有信号肽和亮氨酸拉链基序, 胞外域包含
多个LRR基序, 激酶域位于C末端(Zhang 1998; 马
媛媛等2005)。近年来研究发现, 类受体蛋白激酶
广泛参与植物的叶片衰老调控过程(肖冬等2014)。
例如, 早期有人在拟南芥中发现一个编码LRR-
RLK的基因RPK1 (Hong等1997), 近期研究证明该
基因不仅仅正向调控叶片自然衰老还参与到ABA
诱导的衰老信号路径中(Lee等2011)。
在前期研究工作中, 本课题组从衰老的大豆
叶片中克隆了一个编码LRR-RLK的基因GmSARK,
利用RNAi技术沉默该基因的表达可以明显延缓转
基因大豆的叶片衰老(Li等2005), 过表达该基因则
导致转基因植株早衰致死(Li等2006); 进一步在拟
南芥中分离鉴定了GmSARK的同功能基因AtSARK,
利用诱导型启动子GVG系统驱动该基因的过表达
会加速转基因拟南芥衰老; 无论是GmSARK还是
AtSARK都具有丝/苏氨酸和酪氨酸双底物特异性
(Xu等2011)。我们分别在大豆和拟南芥中的研究
结果暗示, 可能在高等植物中普遍存在编码LRR-
RLK的SARK基因参与叶片衰老调控, 但在其他植
物包括番茄中还没有研究报告进行验证。本文通
过对AtSARK过表达所诱导的GVG:AtSARK转基因
微型番茄‘Micro-Tom’衰老叶片的基因芯片数据进
行分析, 筛选了一个编码LRR-RLK的基因, 其表达
随番茄叶片衰老上调, 命名为SlSARK-like。利用农
杆菌介导的番茄子叶转化法, 获得了6个GVG:Sl-
SARK-like转基因‘Micro-Tom’番茄株系, 并观察
DEX诱导SlSARK-like基因过表达对转基因番茄幼
苗的影响, 发现同GmSARK和AtSARK一样, Sl-
SARK-like基因也对番茄叶片衰老过程发挥正向调
控作用。
材料与方法
1 材料和处理
供试植物材料为‘Micro-Tom’番茄(Solanum
lycopersicum L.), 野生型‘Micro-Tom’番茄种子先
后分别经过75%乙醇和1% NaClO消毒1 min和7
min, 灭菌水清洗10次, 铺种于1/2MS固体培养基
上, 置于光照培养箱(光/暗周期16 h/8 h, 温度22 ℃)
中萌发生长, 苗龄为7 d时, 可用于‘Micro-Tom’遗
传转化。本文中GVG:GUS和GVG:AtSARK转基因
‘Micro-Tom’材料以及含GVG:SlSARK-like质粒的
LBA4404农杆菌菌株均由本课题组前期实验获得
并保存。
2 GVG:SlSARK-like的‘Micro-Tom’遗传转化
以‘Micro-Tom’番茄的子叶作为转化材料, 用
农杆菌介导的遗传转化法进行转化, 侵染转化后
的愈伤组织用潮霉素来筛选, 筛选出的新生愈伤
组织进行分化、生根、炼苗, 最后移栽到土里继
续培养(Ellul等2003)。
3 转基因‘Micro-Tom’番茄的基因组PCR检测
待转基因‘Micro-Tom’长出3~4片真叶时, 取
80~100 mg的植物叶片, 采用SDS法提取基因组
DNA, 分别用SlSARK-F (5′-TGGTAGGGTTTT-
GTTTCAGGC-3′)和7002B-R (5′-AACTTAGTAG-
GATTCTGGTGTGTGG-3′)以及HygP-F (5′-AT-
GAAAAAGCCTGAACTCAC-3′)和HygP-R (5′-
GCCTCCAGAAGAAGATGTTG-3′)扩增目的基因
SlSARK-like基因片段和潮霉素基因(Hygiene)片
段。PCR反应体系: 3 µL PCR Buffer, 0.6 µL dNTPs
Mix, 引物各0.6 µL, 0.3 µL Taq聚合酶, 1 µL基因组
作为模板, 加ddH2O补齐到30 µL。PCR反应条件
如下: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火
30 s, 72 ℃延伸45 s, 32个循环; 最后72 ℃延伸10
min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
4 RNA提取及半定量RT-PCR
植物材料的RNA提取采用Trizol法。具体的
RNA提取方法、反转录合成cDNA以及半定量RT-
PCR, 参考Liu等(2010)文献。在半定量RT-PCR分
析中, 分别使用引物 AtSARK-F (5′-GAGCAATGT-
GATCCCAAGATCATTC-3′)和7002B-R2 (5′-GGC-
AATGAAACTGATGCATTGAACT-3 ′)来扩增
AtSARK目的片段, RLK162S-F (5′-GCAGACTCT-
GGAGGTGGTTC-3′)和RLK162S-R (5′-TCGCCT-
GTGTACGGATAAGC-3′)来扩增SlSARK-like目的
片段; 用于实验的内标引物为Le18SrRNA-1 (5′-
TGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGAC-3′)和
Le18SrRNA-2 (5′-CTTTCGCAGTTGTTCGTC-
TTTCATAA-3′)。
植物生理学报2128
5 转基因‘Micro-Tom’植株的GVG水培诱导体系
将消毒后的野生型和转基因‘Micro-Tom’番茄
种子分别铺于无抗生素和含10 mg·L-1潮霉素的1/2
MS固体培养基上, 筛选出的阳性转基因幼苗转移
到无抗生素的1/2MS固体培养基恢复培养, 待植株
长出3~4片真叶时, 挑取长势一致的野生型和转基
因‘Micro-Tom’番茄幼苗分别置于含有10 µmol·L-1
地塞米松(dexamethasone, DEX)诱导液体培养基和
对照组液体培养基(MOCK液体培养基中仅含地塞
米松的溶剂无水乙醇)中处理10 d左右, 观察表型。
实验结果
1 SlSARK-like蛋白序列分析和结构预测
本文以GVG:AtSARK转基因‘Micro-Tom’番茄
为材料, 利用基因芯片技术分析过表达AtSARK对
转基因番茄转录组的影响, 从芯片数据中发现一个
编码LRR-RLK、随衰老表达上调的基因。Smart软
件分析结果显示, 同GmSARK和AtSARK一样, 该基
因编码的LRR-RLK也具有丝/苏氨酸和酪氨酸双
底物特异性。初步预测该基因与衰老相关, 克隆
该基因并命名为SlSARK-like。经http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/网站分析, 该基因开放阅读框长2 853
bp, 编码951个氨基酸残基。蛋白结构预测(图1-A)
表明SlSARK-like主要由N-端信号肽、胞外域、跨
膜域和保守的激酶域构成, 其中胞外域含有12个
完整的和1个不完整的LRR重复基序, 激酶域位于
C末端, 由7个亚结构域构成(Hanks等1988; Clark等
1997)。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站protein
BLAST结果显示SlSARK-like氨基酸序列与大多
数LRR型蛋白激酶序列具有一定的相似性。如图
1-B所示, ‘Micro-Tom’番茄中的SlSARK-like与马
铃薯(Solanum tuberosum)中的LRR-RLK (XP_
006358481.1, 功能未知)和烟草(Nicotiana tomento-
siformis)中的LRR-RLK (XP_009605193.1, 功能未
知)序列同源性分别为95%和84%, 它们在激酶域
都含有相应的保守氨基酸位点。
图1 SlSARK-like序列结构分析
Fig.1 The sequence and structure analysis of SlSARK-like protein
A: SlSARK-like结构预测; B: SlSARK-like序列同源性分析, 红色方框代表保守激酶结构域, ▲代表保守氨基酸位点。
王凤凤等: ‘Micro-Tom’番茄SlSARK-like基因克隆及初步功能分析 2129
2 SlSARK-like在番茄叶片自然衰老和AtSARK诱
导衰老过程中的表达特点
为了探究SlSARK-like基因与‘Micro-Tom’番茄
叶片衰老的关系, 首先选取成熟绿叶、衰老起始、
衰老中期和衰老晚期4种不同衰老程度的野生型
‘Micro-Tom’叶片(图2-A), 检测各叶片中SlSARK-
like基因表达情况。半定量RT-PCR结果显示(图
2-B): SlSARK-like基因在成熟绿叶中表达水平较
低, 伴随着叶片衰老的起始SlSARK-like基因表达明
显增加, 并随着叶片衰老程度的加深, 在衰老中期
达到高峰, 至衰老晚期该基因表达水平出现下降,
这暗示SlSARK-like基因可能参与‘Micro-Tom’叶片
自然衰老调控。同时本文又以转GVG:AtSARK基
因‘Micro-Tom’番茄幼苗为材料, 检测在AtSARK诱
导衰老的番茄叶片中SlSARK-like基因的表达情
况。此实验采用了糖皮质激素介导的转录诱导系
统(即GVG体系; Aoyama和Chua 1997)来驱动目的
基因的表达。我们挑取20 d苗龄的生长发育状态
一致的野生型、GVG:GUS转基因对照和GVG:
AtSARK转基因‘Micro-Tom’番茄幼苗, 转入含有10
µmol·L-1诱导剂地塞米松(dexamethasone, DEX)的
1/2MS液体培养基培养。由图3-A可以看出: 与
图2 ‘Micro-Tom’番茄叶片自然衰老过程中SlSARK-like表
达模式
Fig.2 The expression pattern of SlSARK-like during natural
senescence of wild type ‘Micro-Tom’ tomato
A: 叶片材料的选取; B: SlSARK-like基因的半定量RT-PCR鉴
定。编号1~4分别表示成熟绿叶、衰老起始、衰老中期和衰老晚
期4种不同衰老程度的叶片。
图3 AtSARK诱导的‘Micro-Tom’番茄早衰过程中SlSARK-like的表达模式
Fig.3 The expression pattern of SlSARK-like gene during AtSARK-induced leaf senescence in ‘Micro-Tom’ tomato
A: 外源DEX诱导AtSARK过表达的衰老表型; B: 诱导过程中AtSARK和SlSARK-like表达水平检测, 0~72 h表示DEX诱导处理的时间。
植物生理学报2130
MOCK对照组相比 , 诱导处理10 d后的GVG:
AtSARK转基因‘Micro-Tom’出现明显的生长抑制
和早衰表型。分别在处理0、2、6、12、24、48
和72 h的时间点取样, 利用半定量RT-PCR检测不
同处理时间的GVG:AtSARK转基因‘Micro-Tom’中
AtSARK基因和SlSARK-like基因表达情况, 结果(图
3-B)显示: AtSARK和SlSARK-like基因的表达水平
在DEX处理2 h时开始明显增加且分别在诱导24 h
和12 h时达到最高。上述2个衰老体系中的检测结
果暗示SlSARK-like基因可能参与对番茄叶片衰老
过程的调控。
3 GVG:SlSARK-like转基因‘Micro-Tom’番茄的获
得和分子鉴定
为了进一步分析SlSARK-like在番茄叶片衰老
调控中的功能, 我们构建了利用GVG可诱导启动
子系统来驱动SlSARK-like基因过表达的表达载
体, 利用农杆菌介导的番茄遗传转化方法获得了6
个独立的GVG:SlSARK-like转基因‘Micro-Tom’番
茄株系。基因组PCR结果(图4-A)显示6个独立株
系都能扩增出与阳性对照一样大小的片段, 而野
生型‘Micro-Tom’则不能扩增出任何条带。选取
其中2个典型转基因株系GVG:SlSARK-like-3和
GVG:SlSARK-like-10, 挑取生长发育状态一致的
幼苗, 转入含10 µmol·L-1 DEX的液体培养基中, 分
别诱导处理0、2、6、12、24、48和72 h, 半定量
RT-PCR结果(图4-B)显示: SlSARK-like-3和Sl-
SARK-like-10两个转基因株系分别在DEX处理6 h
和2 h后明显诱导出SlSARK-like基因表达, 且DEX
处理12 h后两株系中SlSARK-like基因表达水平达
到最高峰。
4 SlSARK-like过表达导致转基因番茄幼苗早衰
为了进一步确定SlSARK-like基因的功能, 选
取生长发育状态一致的GVG:SlSARK-like-3和
GVG:SlSARK-like-10转基因‘Micro-Tom’番茄幼苗
进行DEX诱导处理, 并以相同处理的GVG:GUS转
基因植株为转化对照, 观察SlSARK-like过表达对转
基因番茄幼苗生长发育的影响。由图5可见, 与过
表达AtSARK 转基因‘Micro-Tom’表型类似, DEX诱
导处理11 d后, 2个GVG:SlSARK-like转基因株系的
‘Micro-Tom’番茄幼苗都表现出明显的早衰。这说
明同拟南芥和大豆中的SARK一样, 番茄中的Sl-
SARK-like也参与正向调控叶片的衰老进程。
讨　　论
本课题组前期研究发现大豆中的GmSARK和
拟南芥中的AtSARK都参与叶片衰老的正向调控过
图4 GVG:SlSARK-like转基因‘Micro-Tom’番茄的获得
Fig.4 The acquisition of GVG:SlSARK-like transgenic ‘Micro-Tom’ tomato lines
A: 各转基因株系基因组PCR检测, 1为野生型, 2~7分别为GVG:SlSARK-like-3、-4、-5、-6、-7、-10转基因株系, 8为正对照(以
GVG:SlSARK-like质粒为模板), 9为负对照(以ddH2O为模板); B: 转基因株系GVG:SlSARK-like-3 (a)和GVG:SlSARK-like-10 (b) DEX诱导表达
检测, 0~72 h表示DEX诱导处理的时间。
王凤凤等: ‘Micro-Tom’番茄SlSARK-like基因克隆及初步功能分析 2131
程。这2个SARK基因的共同特点是都编码具有双
底物特异性的LRR型类受体蛋白激酶(Li等2006;
Xu等2011)。本文从‘Micro-Tom’番茄中克隆了编
码LRR-RLK的基因SlSARK-like, 序列分析结果表
明, SlSARK-like也具有双底物特异性。自然衰老
和SARK过表达诱导衰老的‘Micro-Tom’番茄叶片
中SlSARK-like的表达显著上调, DEX诱导SlSARK-
like过表达加速转基因‘Micro-Tom’番茄株系的衰
老。这些结果暗示SlSARK-like很可能是番茄中
GmSARK和AtSARK的同功能基因, 在番茄叶片衰
老调控中发挥重要功能, 这一结果也进一步支持
了SARK类具有丝/苏氨酸和酪氨酸双重底物特异
性的LRR-RLK对叶片衰老的调控机制可能在高等
植物中普遍存在。
到目前为止, 番茄叶片衰老过程中一些调控
基因逐渐被报道。如, 在转反义ACO基因的番茄
中发现乙烯合成受阻, 果实成熟和叶片衰老明显
延缓(Picton等1993); 利用衰老特异性启动子PSAG12
和PSAG13驱动IPT基因在番茄中表达, 可以延缓番茄
叶片衰老(Swartzberg等2006); 利用RNAi技术抑制
番茄中蔗糖转化酶抑制蛋白基因(INVINH1)的表
达, 明显延缓了叶片的衰老(Ruan等2010); 超表达
SlFYFL基因的番茄叶片和花萼衰老延迟, 果实成
熟延缓(Xie等2014)等。但人们对番茄叶片衰老启
动的早期事件了解较少, 有关番茄叶片衰老信号
传递路径的研究工作也不多见。我们前期工作发
现无论GmSARK还是AtSARK, 都分别在大豆和拟
南芥叶片衰老启动和衰老信号传递的早期发挥作
用, 对番茄中SlSARK-like基因功能和作用机制的深
入研究, 将为进一步解析番茄叶片衰老调控的分
子机制奠定基础。
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图5 DEX诱导SlSARK-like基因过表达导致转基因
‘Micro-Tom’番茄早衰
Fig.5 DEX-induced overexpression of SlSARK-like caused
precocious senescence in transgenic ‘Micro-Tom’ tomato lines
从左到右5个植株, 第1株为GVG:GUS, 第2、3株为SlSARK-
like-3, 第4、5株为SlSARK-like-10。
植物生理学报2132
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