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唐菖蒲的愈伤组织诱导和植株再生



全 文 :植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月 473
收稿 2009-03-10 修定  2009-04-09
资助 国家自然科学基金(30 4 71 2 2 1)。
* 通讯作者(E-ma i l : ymfa ng@cau .edu .cn; T el : 0 1 0 -
6 2 7 3 3 8 1 7 )。
唐菖蒲的愈伤组织诱导和植株再生
徐哲 1, 郝京辉 1, 何秀丽 2, 义鸣放 1,*
1中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100193; 2乳山市农业局, 山东乳山 264500
提要: 以唐菖蒲品种 ‘Advanced red’的籽球、花柱、子房和花丝为外植体, 研究了不同种类和浓度生长调节物质以及籽球
的不同接种方式对愈伤组织诱导和植株再生的影响。结果表明: 唐菖蒲籽球的中部切片为最佳外植体, 倒接(形态学下端向
上)是最佳接种方式, 诱导非胚性(NEC)和胚性(EC)愈伤组织形成的最佳诱导培养基分别为MS+6 mg·L-1 NAA和MS+6 mg·L-1
TDZ, 诱导率分别达 65.53%和 71.88%。NEC和EC均能分化不定芽, 分化率分别达88.89%和 61.11%。最佳生根培养基上
的生根率为87.50%。
关键词: 唐菖蒲; 外植体; 组织培养; 愈伤组织; 植株再生
Callus Induction and Plant Regeneration of Gladiolus hybridus Hort.
XU Zhe1, HAO Jing-Hui1, HE Xiu-Li2, YI Ming-Fang1,*
1College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2Rushan Agriculture Bureau,
Rushan, Shandong 264500, China
Abstract: Effects of several plant growth regulating substances in different concentrations and different cormlet
inoculation methods on callus induction and plant regeneration were investigated with cormlets, styles, ovary
and stamens of Gladiolus hybridus cv. ‘Advanced red’ as explants. The results showed that the optimal explants
were central sections of cromlets, the optimal inculation method was inverse inoculation. The optimal induction
mediums for NEC and EC induction were MS+6 mg·L-1 NAA and MS+6 mg·L-1 TDZ with the induction rates of
65.53% and 71.88%, respectively. Calli from NEC and EC could differentiate adventitious shoots and the
differentiation rates were 88.89% and 61.11%, respectively. Rooting rate on the optimal rooting medium was
87.50%.
Key words: Gladiolus hybridus; explants; tissue culture; callus; regeneration
唐菖蒲是鸢尾科唐菖蒲属多年生球根花卉, 世
界四大切花之一。目前我国唐菖蒲主栽品种陈旧,
生产用种球因长期无性繁殖导致病害和种性退化严
重, 制约着我国唐菖蒲优质切花生产和种球的国产
化, 因此急需对品种进行改良。唐菖蒲采用常规杂
交育种年限很长, 转基因技术为其新品种培育提供
了新途径。建立具有稳定外植体来源的高效植株
再生体系是采用基因工程技术对其遗传改良的基础
(闫新甫 2003)。
唐菖蒲组织培养再生途径中不同品种间差异
较大(Kim和Lee 1993; Stefaniak 1994), 目前国内对
唐菖蒲红色系主栽品种‘Advanced red’的组织培养
和植株再生研究较少, 主要是通过直接再生途径(张
智乾等 2008), 以籽球为外植体的愈伤组织再生途
径研究未见报道。按照中国传统文化, 红色是喜庆
吉祥的象征, 红色系花卉在我国花卉市场上用量巨
大, 因此本文以 ‘Advanced red’为材料, 对其高效
的愈伤组织再生体系的建立作了探讨。
材料与方法
以唐菖蒲(Gladiolus hybridus Hort.)品种 ‘Ad-
vanced red’ 的籽球、花柱、子房和花丝为外植
体。种球直径 2.5~3.0 cm, 籽球直径 0.6~0.8 cm,
购自辽宁金城种球试验基地。2008年 4月种球种
植于本校科学园试验地。分别将低温处理 1个月
后剥去外表皮的籽球和2~3 d内即将开放的花苞, 洗
净后, 用 75%的酒精浸泡 30 s, 再用 3%的次氯酸
钠溶液振荡处理 15 min, 无菌水清洗 3次,每次振
荡清洗 1 min, 无菌滤纸吸干后备用。以MS培养
基为基本培养基, 蔗糖浓度为 3%, 用 0.7%琼脂固
化, pH 5.8~5.9, 121 ℃湿热灭菌 20 min, 分装在培
养皿或三角瓶中。接种后放在无菌室内培养, 温度
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月474
为(25±1) ℃, 光照强度为 30~40 μmol·m-2·s-1, 光照
时间为 12 h·d-1。
将消毒籽球横切成厚度 2 mm左右的圆片(不
含顶部芽点和根盘)。从消毒后未开放的花朵中取
下花丝、花柱和子房, 分别接种于含 2~10.0 mg·L-1
NAA+0~1.0 mg·L-1 6-BA或 2~10.0 mg·L-1 TDZ+0~
1.0 mg·L-1 NAA的MS培养基上暗培养进行愈伤组
织诱导。采用双因素完全随机设计, 以不加任何激
素的MS培养基为对照, 共 19个处理。籽球切片
每处理接种 32个外植体, 花器官每处理接种 24个
外植体, 重复 3次, 每隔 15 d更换一次培养基, 40 d
后统计不同激素对唐菖蒲不同外植体愈伤组织的诱
导率。
籽球切片接种方式和部位影响愈伤组织的诱
导试验分 2个方面。 (1)以籽球切片为外植体, 采用
正接(形态学下端向下)和倒接(形态学下端向上) 2
种接种方式, 接种于筛选出的最适宜培养基上, 暗
培养。每个处理 32个外植体, 重复 3次。每隔 15
d更换一次培养基, 40 d后统计不同放置方式对唐
菖蒲愈伤组织的诱导率。( 2 )将籽球的形态学上
部、中部、下部切片以倒置方式接种在最适培养
基上暗培养, 每个处理 32个外植体, 重复 3次。每
隔15 d更换一次培养基, 40 d后统计唐菖蒲籽球不
同部位切片愈伤组织的诱导率。
作愈伤组织分化不定芽试验时, 将2种愈伤组
织分别接种在含 BA (0.2、0.6、1.0 mg·L-1)的MS
固体培养基上光照培养,每个处理 24个外植体, 重
复 3次。以不加任何激素的MS培养基为对照, 每
隔 15 d更换一次培养基, 40 d后统计唐菖蒲 2种愈
伤组织分化不定芽数。
作生根与结球试验时, 将不定芽切下, 移至不
同生根培养基 1/2MS+IBA (0、0.2、0.5、1.0
mg·L-1)中光照培养, 25 d后统计生根率、平均单
苗根数和最长根长度, 40 d后统计结球数。
数据统计按下列公式, (1)愈伤组织诱导率(%)=
(愈伤组织分化的外植体数/接种外植体数)×100%;
(2)不定芽再生率(%)=(再生不定芽的外植体数 /接
种外植体数)×100%; (3)外植体平均再生芽数=再生
芽总数/再生不定芽的外植体数; (4)生根率(%)=(生
根苗数 /接种苗数)×100%; (5)平均单苗根数=生根
数 /生根苗数。试验数据采用 Excel和Dps软件处
理, 并作方差分析。
实验结果
1 愈伤组织诱导外植体和培养基的筛选
由表1可以看出, 唐菖蒲的花丝和花柱都只有
1个处理能产生愈伤组织, 且愈伤组织诱导率很低;
虽在 3个处理下从子房诱导出愈伤组织, 但愈伤组
织诱导率最高仅为 12 .50%。而且花丝、子房、
花柱在接种 25 d后逐渐褐化死亡。
以唐菖蒲籽球切片为外植体接种到不同培养
基中后可诱导出 2类愈伤组织。第 1类为乳白色
或浅黄色颗粒状, 质地较松软, 生长较快, 为非胚性
愈伤组织(NEC) (图1-a); 第2类为米黄色或淡黄绿
色颗粒状, 质地较硬, 生长较慢, 为胚性愈伤组织
(EC) (图 1-b)。在NAA与 6-BA激素组合中, 含高
浓度NAA的培养基(I4~I9)均能诱导NEC, 诱导率最
高为 71.88%, 但是加入 6-BA (I5、I6、I8、I9)促
进叶片的分化, 从而影响了愈伤组织的进一步增
图 1 唐菖蒲非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导
Fig.1 The inductions of non-embryogenic callus and
embryogenic callus of G. hybridus
a, b: 非胚性和胚性愈伤组织; c, d: 倒接和正接条件下非胚性
愈伤组织; e, f: 倒接和正接条件下胚性愈伤组织; g, h, i: 籽球上
部、中部和下部条件下胚性愈伤组织。
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月 475
殖。在NAA与 TDZ激素组合中, 均能诱导EC, 但
在单一添加高浓度TDZ的培养基中愈伤组织诱导
率最高达到 78.13%。
以上结果表明, 对唐菖蒲品种 ‘Advanced red’
来说, 籽球切片比花丝、花柱和子房更适合作愈伤
组织诱导的外植体。单一高浓度的NAA仅能诱导
NEC的分化, 而单一高浓度的TDZ有EC的生成, 结
果与前人的报道(Emek和 Erdag 2007; Paslaru等
2002)相似。为了避免高浓度生长调节物质对芽分
化产生的不良影响, 在诱导率差异不大的情况下, 尽
量选择生长调节物质浓度较低的处理。据此确定,
唐菖蒲籽球切片诱导非胚性和胚性愈伤组织的最适
培养基应为MS+6 mg·L-1 NAA和MS+6 mg·L-1
T D Z。
2 籽球切片接种方式和部位对愈伤组织诱导的影

(1)籽球切片不同的放置方式对NEC的诱导率
无显著影响, 但倒接的愈伤组织的生长量明显多于
正接(表2), 同时正接的愈伤组织在增殖前期便会分
化芽, 抑制了愈伤组织的进一步增殖(图 1-c~f)。
表 2 唐菖蒲籽球切片不同诱导方式对愈伤组织分化的影响
Table 2 Effect of induction methords on the differentiation of
calli derived from cormlet sections of G. hybridus
愈伤组织诱导率 /%
放置方式
非胚性愈伤组织 胚性愈伤组织
正接 48.96Aa 45.83B
倒接 62.50Aa 83.33A
表 1 不同生长调节物质组合对唐菖蒲愈伤组织分化的影响
Table 1 Effects of different growth regulation substances on callus differentiation of G. hybridus
植物生长调节剂 /mg·L-1 愈伤组织诱导率 /%
处理 籽球外植体的诱导情况
NAA 6-BA TD Z 籽球 花丝 子房 花柱
对照 - - - 0 0 0 0 褐化死亡
I1 2 - - 0 0 0 0 根
I2 2 0.5 - 0 0 0 0 根
I3 2 1 - 0 0 0 0 根
I4 6 - - 65.63Aa 0 8.33 0 NEC
I5 6 0.5 - 71.88Aa 6.94 0 0 NEC, 有不定芽
I6 6 1 - 68.75Aa 0 0 0 NEC, 有不定芽
I7 1 0 - - 56.25Aa 0 0 0 NEC
I8 1 0 0.5 - 62.50Aa 0 0 6.94 NEC, 有不定芽
I9 1 0 1 - 59.38Aa 0 0 0 NEC, 有不定芽
II1 - - 2 41.67BCcd 0 0 0 EC
II2 0.5 - 2 28.13Cd 0 0 0 EC或根
II3 1 - 2 22.92Cd 0 0 0 EC或根
II4 - - 6 71.88Aab 0 8.33 0 EC
II5 0.5 - 6 62.50ABab 0 0 0 EC或根
II6 1 - 6 56.25ABbc 0 0 0 EC或根
II7 - - 1 0 78.13Aa 0 0 0 EC
II8 0.5 - 1 0 66.67ABab 0 12.50 0 EC或根
II9 1 - 1 0 62.50ABab 0 0 0 EC或根
  同一列中不同小写字母表示在 0.05 水平上差异显著, 不同大写字母表示在 0.01 水平上差异显著。下表同。EC 表示胚性愈伤组
织; N EC 表示非胚性愈伤组织。
不同的放置方式对 EC诱导率差异极显著, 倒接的
籽球切片愈伤组织诱导率达到 83.33%。这些结果
表明, 唐菖蒲籽球切片倒接更有利于愈伤组织的分
化, 诱导 EC表现出的极性差异更显著。
(2)籽球各部分诱导的愈伤组织状态无明显差
别, 但是籽球中、下部切片的非胚性和胚性愈伤组
织诱导率显著高于上部切片的, 中部切片的非胚性
和胚性愈伤组织诱导率最高, 分别达到 68.75%和
81.25% (表 3)。据此认为, 唐菖蒲籽球的中部切
片是诱导愈伤组织的最佳外植体(图 1-g~i)。
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月476
3 愈伤组织分化不定芽
籽球切片产生的非胚性和胚性愈伤组织都可
以诱导芽的分化。NEC在接种 7 d后即有绿色芽
点出现, 且不定芽生长迅速, 12 d可达生长高峰期。
而 EC不定芽生长较慢, 20 d后才能达到生长高峰
期(图 2-a、b)。从表 4可以看出, NEC在 6-BA浓
度为0.6 mg·L-1时不定芽再生率和每块外植体再生
芽数均最高, 为 88.89%和 12.5块。而 EC不定芽
分化可能受前期TDZ的抑制, 在较低浓度0.2 mg·L-1
时再生率最高, 为 61.11%, 每块外植体再生芽数却
在不含6-BA的MS基本培养基上最多, 为23.4。综
合考虑认为, EC分化不定芽的最适6-BA浓度为0.2
表 4 不同浓度 6-BA对唐菖蒲不同类型愈伤组织分化不定芽的影响
Table 4 Effects of different concentrations of 6-BA on adventitious buds from different calli of G. hybridus
愈伤组织类型 6-BA浓度 /mg·L-1 不定芽分化率 /% 每外植体分化芽数 /块 不定芽状态
非胚性愈伤组织 0 19.44Cc 2.83Cc 绿色, 较纤细
0.2 52.78Bb 8.17Bb 绿色, 健壮
0.6 88.89Aa 12.50Aa 绿色, 健壮
1.0 63.89Bb 9.67Aa 绿色, 健壮
胚性愈伤组织 0 27.78Bbc 23.40Aa 绿色, 健壮
0.2 61.11Aa 16.60ABb 绿色, 健壮
0.6 40.28ABb 12.00Bb 绿色, 生长放缓
1.0 19.44Bc 3.80Cc 绿色, 多不能正常发育
表 3 唐菖蒲籽球不同部位愈伤组织的分化
Table 3 Effects of different parts from cormlet sections on
callus differentiation of G. hybridus
愈伤组织诱导率 /%
籽球部位
非胚性愈伤组织 胚性愈伤组织
上部 42.71Ab 46.88Bb
中部 68.75Aa 81.25Aa
下部 51.04Aab 60.42ABb
mg·L-1。这 2种愈伤组织分化的不定芽在外观形态
上无明显差异。
4 生根
如表5所示, 不定芽在各生根培养基中的生根
率无明显差异, 都达到 80%以上。MS基本培养基
中, 根系粗壮, 但单苗根数最少, 平均只有 1.75, 且
几乎无侧根发生。在 1/2MS培养基中随着培养基
中 IBA的浓度升高, 单苗根数明显增多, 根系更粗
壮, 但根系生长变慢, 且侧根发生减少。说明高盐
和IBA都有促进根系增粗生长以及抑制根系伸长生
长和侧根发生的作用。生根苗在接种 14 d后, 基
部开始膨大, 形成球茎。综合各项指标认为, 1/2MS+
0.5 mg·L-1 IBA为生根的最适培养基(图 2-c、d)。
讨  论
迄今我国关于唐菖蒲遗传转化的研究报道很
少, 而制约唐菖蒲遗传转化研究的一个重要原因就
是缺少唐菖蒲稳定高效的再生体系。到目前为止,
图 2 唐菖蒲的愈伤组织诱导和植株再生
Fig.2 callus induction and plantlet regeneration of
G. hybridus
a、b: 胚性和非胚性愈伤组织分化不定芽; c、d: 不定芽在
1/2MS+0.5 mg·L-1 IBA培养基上生根和结球。
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月 477
表 5 不同培养基对不定芽生根的影响
Table 5 Effects of medium on rooting of adventitious buds
培养基 /mg·L-1 生根率 /% 单苗根数 /条 最长根长度 /cm 根长势
MS 79.17Aa 1.75Bb 3.25Bb 粗壮, 侧根少, 生长较快
1/2MS 85.42Aa 3.11Bb 5.33Aa 纤细, 侧根多, 生长快
1/2MS+IBA 0.2 83.33Aa 3.40Bb 3.15Bb 较纤细, 侧根多, 生长较快
1/2MS+IBA 0.5 87.50Aa 6.67Aa 3.22Bb 较粗壮, 侧根较多, 生长较慢
1/2MS+IBA 1.0 93.75Aa 7.11Aa 3.00Bb 粗短, 有侧根, 生长慢
各种转基因手段的转化效率还相对较低, 一般只有
0.1% (王关林和方宏筠 2002), 急需建立一个高效、
易于转化的再生体系。唐菖蒲籽球获得容易, 可长
期贮藏, 是一种稳定的外植体来源。本文以唐菖蒲
的主流品种 ‘Advanced red’的籽球为外植体, 建立
了唐菖蒲非胚性和胚性愈伤组织的再生体系, 从而
为今后利用转基因技术对其进行遗传改良建立了基
础。
唐菖蒲的花器官有稳定的来源, 也具备作为遗
传转化体系外植体的基本条件。其他植物中已有
以花器官作为外植体诱导愈伤组织(Stefanello等
2005), 但在唐菖蒲中还未见报道。本文结果表明,
对于唐菖蒲品种 ‘Advanced red’来说, 花器官并不
是诱导愈伤组织适宜的外植体, 其各部分愈伤组织
诱导率均很低。这可能与基因型有关, 因此适于不
同外植体愈伤组织诱导培养基的筛选还有待进一步
研究。
2,4-D作为诱导愈伤组织应用最广泛的生长调
节物质, 对唐菖蒲许多品种同样有效(Kim和 Lee
1993; 刘志洋和车代弟2004), 但有些品种仅对NAA
敏感(Stefaniak 1994), 存在一定的品种特异性。
TDZ近年来在植物组织培养中广泛应用, 对许多难
以再生的植物愈伤组织分化有促进作用(徐晓峰和
黄学林 2003), 但在唐菖蒲中还未见报道。本文的
预试验表明, 2,4-D并不能诱导唐菖蒲品种 ‘Ad-
vanced red’籽球的脱分化。因此我们分别以NAA
和TDZ作为主要生长调节剂进行愈伤组织诱导的
结果表明, 单独使用NAA和TDZ可诱导出非胚性
和胚性愈伤组织, 证明TDZ能有效诱导唐菖蒲愈伤
组织分化, 原因可能是TDZ改变了细胞内源IAA的
代谢, 而内源IAA在诱导胚性愈伤组织的过程中起
关键性作用(Sasaki等 1994; Murthy等 1995; 陈以
峰等1998)。NEC和EC都能正常分化芽和根系, 但
通过EC再生过程比NEC长15 d左右, 可能是由于
EC诱导过程中高浓度 TDZ抑制后期芽的分化所
致。
唐菖蒲愈伤组织的诱导有明显的极性现象, 其
籽球切片不同接种方式对愈伤组织诱导的差异明
显, 即愈伤组织主要形成于外植体形态学下端。王
丽等(1998)也曾报道过内源IAA在其中起关键的作
用。同时也有报道表明, 生长素极性运输的抑制
剂 2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)可以减少体细胞胚发
生, 但不能降低用TDZ处理的组织中生长素的浓度
(Hutchinson等 1996)。因此推测, 唐菖蒲愈伤组织
诱导的极性现象可能与 IAA极性运输有关。唐菖
蒲籽球的不同部位愈伤组织的诱导亦有明显差异,
籽球的中部切片愈伤组织诱导率最高, 这与Remotti
和 Löffler (1995)报道的结果一致。他认为这可能
是由于籽球中部缺乏分生组织从而有利于未分化组
织的生长所致, 对此还需从细胞组织结构的角度进
一步观察验证。
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