全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1421~1426 1421
收稿 2013-09-05 修定 2013-10-21
资助 国家科技支撑计划课题(2011BAI07B07)、高等学校博士
点基金(20091501110002)、国家自然科学基金(30660015)
和内蒙古大学“211工程”创新人才培养计划。
* 通讯作者(E-mail: guilinchen@aliyun.com; Tel: 0471-
4992577)。
锁阳愈伤组织诱导和增殖及不定根分化
岳鑫, 段园园, 陈贵林*
内蒙古大学生命科学学院, 内蒙古自治区中蒙药材规范化生产工程技术研究中心, 呼和浩特010021
摘要: 以药用寄生植物锁阳的不同部位肉质茎为外植体, 研究外植体形态及植物生长调节剂配比对愈伤组织形成、增殖及
不定根分化的影响, 建立了高效的锁阳肉质茎愈伤组织诱导、增殖和不定根分化体系。结果表明, 锁阳茎下部大小为1.5
cm×1.5 cm×1.5 cm的外植体, 维管束平行于培养基放置, 有利于愈伤组织形成; 外植体培养50 d, 愈伤组织形成。高效的愈
伤组织诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 3.0 mg·L-1, 愈伤组织诱导率可达67%; 增殖培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+
2,4-D 1.5 mg·L-1, 增殖系数为74%; 在MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1分化培养基中, 不定根诱导率达56%。
关键词: 药用寄生植物; 肉质茎; 不定根; 愈伤组织
In vitro Callus Induction, Proliferation and Adventitious Root Organogenesis
of Cynomorium songaricum
YUE Xin, DUAN Yuan-Yuan, CHEN Gui-Lin*
The Good Agriculture Practice Engineering Technology Research Center of Chinese and Mongolian Medicine in Inner Mongolia,
College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China
Abstract: Effects of different explants and plant growth regulators on callus formation, proliferation and
differentiation were studied to establish high-performance tissue culture method of succulent stems of medicinal-
parasitic plant Cynomorium songaricum. The results indicated that the lower part of the succulent stems were of
highest callus formation rate with the size 1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm and vascular bundle parallel placing. The
optimal callus induction medium was MS+1.0 mg·L-1 6-BA+3.0 mg·L-1 2,4-D, the inductivity of which would be
67%. It was MS medium containing 0.5 mg·L-1 6-BA and 1.5 mg·L-1 2,4-D that promoted the proliferation of
callus with the proliferation coefficient 74%. It was MS medium including 1.0 mg·L-1 6-BA and 2.0 mg·L-1 NAA
that benefited the differentiation of callus to adventitious root with the differentiation ratio 56%.
Key words: medicinal-parasitic plant; succulent stems; adventitious root; callus
锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)是多年生
药用寄生植物, 寄生于蒺藜科(Zygophyllaceac)白刺
属 ( N i t r a r i a L . )植物的根部及该科的骆驼蓬
(Peganum hamala L.)根部(Nickrent等2005)。锁阳
是常用的中蒙药材, 具有调节哺乳动物生殖细胞活
力、促进性腺激素分泌及睾丸发育的作用; 同时还
具有抗氧化(Jin等2012)及抑制HIV蛋白活性的作用
(Nakamura 2004)。目前, 锁阳药材几乎全部来源于
野生资源, 过度采挖导致资源蕴藏量剧减, 野生居
群已不多见。因此, 通过人工种植锁阳药材既可解
决当前燃眉之急, 又能使野生资源得到可持续利
用。在自然条件下, 锁阳对寄主依赖性极强,种子
萌发率低, 人工栽培难度大。本课题组在已经公开
专利“锁阳肉质茎愈伤组织诱导方法”的基础上(陈
贵林等2009), 深入研究了锁阳肉质茎不同部位、
大小及放置方式对愈伤组织形成的影响; 选用广泛
的植物生长调节剂配比筛选更高效的愈伤组织诱
导培养基; 进而对愈伤组织继代培养及不定根分化
进行了研究, 拟推进锁阳寄生生物学研究及微繁方
法的建立, 促进锁阳产业的发展。
材料与方法
1 材料及保存
锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)肉质茎取
自内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗独贵塔拉镇 (东经
植物生理学报1422
108°42′; 北纬40°36′)。锁阳肉质茎经表面灭菌后,
置于4 ℃冰箱冷藏待用。
2 方法
2.1 锁阳外植体筛选与愈伤组织诱导培养
2.1.1 愈伤组织诱导培养基 MS培养基添加蔗糖30
g·L-1, 酪蛋白(AHC) 0.5 g·L-1, 琼脂6.8 g·L-1, 并分别
添加不同浓度的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯
氧基乙酸(2,4-D), 或者不同浓度的6-BA和萘乙酸
(NAA) (表2)。调节pH值至6.0, 灭菌, 冷却, 待用。
2.1.2 外植体前处理及培养条件 将锁阳肉质茎
用自来水冲洗30 min。参照段园园等(2012)的方
法, 将锁阳肉质茎依上至下分为茎上部、茎中部
和茎下部(图1-A)。在超净工作台上进行灭菌与接
种: 70%乙醇浸泡外植体0.5 min, 无菌水冲洗3次;
0.1%氯化汞浸泡9 min, 无菌水冲洗5次, 用灭菌滤
纸吸干表面水分, 切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm、1.0
cm×1.0 cm×1.0 cm及1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的块茎,
以块茎维管束平行或垂直于培养基接种。每瓶接
种2~3块, 每种外植体接种10瓶。将接种了外植体
的三角瓶随机置于培养箱中, 25 ℃暗培养50 d后,
统计愈伤组织形成率。
2.1.3 分泌物观察 黑暗培养20 d后, 观察外植体上
是否有白色分泌物的出现。分泌物形成率(%)=有
分泌物的外植体数/接种外植体总数×100。
2.2 锁阳愈伤组织增殖与不定根培养基筛选
2.2.1 愈伤组织增殖培养基 对6-BA和2,4-D诱导
的愈伤组织进行增殖培养。增殖培养基以MS为基
本培养基, 添加蔗糖30 g·L-1、AHC 0.5 g·L-1、琼脂7
g·L-1以及不同浓度2,4-D与6-BA组合(表3), 调节pH
值至5.8~6.0, 灭菌。将2.1节中得到的愈伤组织切
成0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm的小块, 或将愈伤组织和
外植体共同接入增殖培养基中暗培养, 20 d后测定
愈伤组织生长量。
2.2.2 不定根分化培养基 对6-BA和NAA诱导的愈
伤组织进行不定根分化培养。分化培养基以MS培
养基添加蔗糖30 g·L-1、AHC 0.5 g·L-1、琼脂7 g·L-1
和6-BA 1.0 mg·L-1为固定因素, 分别添加0、1.0、2.0、
3.0 mg·L-1 NAA; 调节pH值至5.8~6.0; 灭菌。将
愈伤组织及外植体共同接入分化培养基中暗培养。
以上每瓶接种2块, 每个处理3瓶, 设3次重复。每7 d
图1 锁阳肉质茎愈伤组织形成、增殖及不定根分化
Fig.1 Callus formation, proliferation and adventitious root differentiation from C. songaricum succulent stems
A: 完整的锁阳肉质茎, a为茎上部, b为茎中部, c为茎下部, d为不定根; B: 茎下部外植体形成的愈伤组织; C: 茎上部外植体形成的愈伤
组织; D: 继代愈伤组织; E: 继代培养20 d的愈伤组织; F: 愈伤组织分化为不定根; G: 与培养基接触的不定根尖形成愈伤组织; H: 未与培养
基接触的不定根尖形成愈伤组织; I: 生长在培养基中不定根的形态; J: 全身布满不定根的未出土锁阳(球形, 直径约3 cm)。
岳鑫等: 锁阳愈伤组织诱导和增殖及不定根分化 1423
观察1次, 50 d时统计各处理的不定根分化率、不
定根的数量及不定根根尖形成愈伤组织的数量。
愈伤组织增殖系数(%)=(W2–W1)/W1×100,
其中W2=培养后愈伤组织质量, W1=接种时愈伤组
织质量; 愈伤组织不定根分化率(%)=形成不定根
的愈伤组织数/接种愈伤组织总数×100。
实验结果
1 锁阳愈伤组织形成
1.1 外植体形态对褐变程度的影响
不同部位、大小和放置方向的锁阳肉质茎外
植体, 接种到愈伤诱导培养基中。培养5 d后, 部分
外植体上有白色的分泌物产生, 在培养20 d后进行
统计(表1)。结果显示, 分泌物的产生与外植体大
小相关, 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的3个部位的外植
体 , 产生分泌物的比例达26%, 而1.5 cm×1.5
cm×1.5 cm的3个部位的外植体, 产生分泌物的比例
为18%; 其次, 不同部位外植体产生分泌物的比例
差异明显, 3种大小的茎上部和茎中部外植体产生
分泌物的比例分别为26%和25%, 而下部产生分泌
物的比例为16%; 再次, 放置方式对分泌物的产生
也有影响, 维管束平行放置的所有外植体, 产生白
色分泌物的比例为20%, 而维管束垂直放置的外植
体, 产生白色分泌物的比例为25%。产生分泌物的
外植体褐化程度大, 未形成愈伤组织。
1.2 锁阳愈伤组织最适培养条件的筛选
外植体接种到培养基2 d后出现褐变, 且褐变
程度随培养时间的延长不断加深。不同部位的外
植体, 褐变程度有显著差异。茎上部外植体褐变
后的颜色为紫红色, 中部外植体为淡红色, 而下部
外植体为褐色。培养50 d, 愈伤组织开始形成, 对
于不同的外植体, 愈伤形组织成的部位不同。茎
下部外植体的维管组织处增厚膨大(图1-B), 膨大
组织出现裂缝, 愈伤组织从裂缝处产生, 颜色为白
色; 茎上部和中部的外植体, 整体膨大, 维管组织
处形成愈伤组织, 颜色为白色(图1-C)。因此, 下部愈
伤组织产生于外植体内部, 由内而外生长; 茎上部和
中部的愈伤组织形成于接触培养基的维管组织
处。培养70 d左右, 愈伤组织生长量达到最大值。
生长素和细胞分裂素对锁阳愈伤组织形成的
协同作用效果见表2。单独添加NAA或2,4-D的培
表2 植物生长调节剂配比对锁阳肉质茎愈伤组织诱导率的影响
Table 2 Effects of plant growth regulators on callus formation of C. songaricum succulent stems
编号 NAA/mg·L-1 6-BA/mg·L-1 愈伤诱导率/% 编号 2,4-D/mg·L-1 6-BA/mg·L-1 愈伤诱导率/%
1 0.5 0 0 11 0.5 0 0
2 1.0 0 0 12 1.0 0 0
3 2.0 0 0 13 2.0 0 0
4 3.0 0 0 14 3.0 0 0
5 0.5 0.5 1.7±1.1d 15 0.5 0.5 33±8.5bc
6 1.0 1.0 16±9.1cd 16 1.0 1.0 41±13b
7 2.0 1.0 32±12.9bc 17 2.0 1.0 46±8.1b
8 3.0 1.0 16±8.1cd 18 3.0 1.0 67±10a
9 2.0 0.5 1.3±0.1d 19 2.0 0.5 34±12bc
10 3.0 0.5 1.0±0d 20 3.0 0.5 16±8.1cd
数字旁不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
表1 锁阳肉质茎外植体形态与褐变程度的关系
Table 1 The relationships between appearance and browning
of explants from C. songaricum succulent stems
部位 外植体大小/cm 放置方向 分泌物/% 褐化程度
上部 0.5×0.5×0.5 平行 29 ***
中部 0.5×0.5×0.5 垂直 33 ****
下部 0.5×0.5×0.5 平行 17 ***
上部 1.0×1.0×1.0 垂直 26 ***
中部 1.0×1.0×1.0 平行 23 ***
下部 1.0×1.0×1.0 垂直 20 **
上部 1.5×1.5×1.5 平行 20 **
中部 1.5×1.5×1.5 垂直 22 **
下部 1.5×1.5×1.5 平行 12 **
“*”代表褐化的程度, “*”越多褐化程度越大。放置方向: 外植
体的维管束与培养基的相对位置。n=3。
植物生理学报1424
养基上, 无愈伤组织形成。NAA和6-BA组合对锁
阳愈伤组织形成的促进作用普遍低于2,4-D和
6-BA组合。添加NAA和6-BA组合的培养基上, 愈
伤组织形成率最高可达32%。当NAA与6-BA的比
例为1:1~3:1时 , 愈伤诱导效果良好。添加3.0
mg·L-1 2,4-D和1.0 mg·L-1 6-BA的培养基上, 愈伤组
织形成率可达NAA和6-BA最佳诱导率的2倍。当
2,4-D与6-BA的比例为1:1~6:1时, 愈伤组织诱导效
果良好。因此, 锁阳愈伤组织最佳诱导培养基为
MS+ 3.0 mg·L-1 2,4-D+1.0 mg·L-1 6-BA, NAA和6-BA
的组合中最好的是MS+2.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1
6-BA。
2 锁阳愈伤组织的继代增殖
锁阳愈伤组织在添加不同质量浓度的6-BA和
2,4-D的培养基中进行继代增殖培养(表3)。结果
发现, 外植体和愈伤组织一起继代的增殖培养中,
添加1.5 mg·L-1 2,4-D, 0.25~0.75 mg·L-1 6-BA, 愈伤
组织增殖快, 生长良好, 但增殖系数较小, 各个处
理间无明显差异; 添加1 mg·L-1 2,4-D和0.5 mg·L-1
6-BA时, 愈伤组织无增长。接种愈伤组织的继代
培养中, 2,4-D和6-BA的比例为3:1时, 愈伤组织质
地紧密, 呈淡黄色, 增殖系数为74%; 当2,4-D和
6-BA的比例为2:1时, 愈伤组织为淡褐色、增殖系
数较小。当2,4-D和6-BA的比列为6:1时, 愈伤组织
呈褐色, 增殖慢(图1-E)。总之, 当2,4-D和6-BA比
值为3:1时, 有利于锁阳愈伤组织的增殖; 比值增大
不利于愈伤组织增殖。在随后的培养中, 继代愈
伤组织未出现分化。因此, 锁阳最适愈伤增殖培
养基为MS+1.5 mg·L-1 2,4-D+6-BA 0.5 mg·L-1。
3 锁阳愈伤组织的分化
锁阳愈伤组织在添加1.0 mg·L-1 6-BA和不同
浓度NAA的培养基中进行不定根分化培养。结果
发现, 在分化培养基中培养20 d后, 愈伤组织表面
出现白色突起; 25 d不定根出现, 且生长很快, 形态
粗壮、纤细或宽扁(图1-F); 40 d不定根顶端出现愈
伤组织(图1-G、H), 后续未观察到愈伤组织继续分
化为不定根。分化培养基中NAA浓度对锁阳愈伤
组织不定根分化、不定根数量和不定根尖形成愈
伤组织的影响见表4。结果显示, 在NAA浓度低时,
锁阳愈伤组织不定根分化率和不定根数量随着
NAA浓度的增加而增加。当NAA为3 mg·L-1时, 不
定根分化率下降。因此, 锁阳愈伤组织不定根分
化最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0
mg·L-1。
讨 论
1 锁阳肉质茎愈伤组织诱导的外植体选择
在本实验中, 分泌物广泛出现在各部位外植
体上, 且出现分泌物的外植体褐变严重、最终不
能形成愈伤组织。作者对分泌物进行了细菌平板
划线培养, 但是未得到菌落; 同时对其成分进行了
初步测定 , 结果显示含有多糖 (硫酸 -苯酚比色
法)、氨基酸(茚三酮显色法)以及黄酮类化合物(硝
酸铝显色法) (本文未显示上述实验结果)。这些成
表3 植物生长调节剂对锁阳愈伤组织增殖的影响
Table 3 Effects of plant growth regulators on proliferation of
C. songaricum callus
植物生长调节剂/ 外植体+愈伤组织 愈伤组织
mg·L-1 增殖系数/% 生长状况 增殖系数/% 生长状况
6-BA 0.75+2,4-D 1.5 26 ++ 53 ++
6-BA 0.50+2,4-D 1.5 30 ++ 74 +++
6-BA 0.25+2,4-D 1.5 26 ++ 39 +
6-BA 0.50+2,4-D 1.0 0 + 57 ++
“+”越多, 说明愈伤组织生长越好。n=3。
表4 NAA对锁阳愈伤组织分化为不定根的影响
Table 4 Effect of NAA on differentiation of C. songaricum callus to adventitious root
NAA/mg·L-1 不定根分化率/% 不定根数/条 根尖形成愈伤组织的不定根/条
0 0 0 0
1.0 22±10b 1.2±0.7b 0
2.0 56±10a 5.6±2.0a 2.3±0.7a
3.0 33±17b 2.0±0.7b 0.5±0.4b
同列数字旁不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。n=3。
岳鑫等: 锁阳愈伤组织诱导和增殖及不定根分化 1425
分均为锁阳中所含有的成分, 说明分泌物是由外
植体产生的。这种现象类似于伤流, 而分泌物即
为伤流液(时向东等2006)。产生伤流液的外植体,
由于营养成分流失, 外植体迅速死亡, 所以褐变程
度快, 且最终不能形成愈伤组织。同时在锁阳破
土后, 全植株的营养物质优先供给茎上部, 因此,
组织培养过程中, 茎上部和中部外植体的分泌物
较多。
锁阳的维管组织与寄主根部的维管组织连通,
从下至上运送营养物质。维管束在肉质茎中呈波
浪式环状排列, 随着茎的增粗, “波浪”上下幅度逐
渐增大, 维管束数目由4个逐渐增加到10~12个。
而且上、下维管束周围的细胞类型也不相同(李志
军等2002)。因此将锁阳肉质茎从上至下分为茎上
部、中部和下部3种外植体用于愈伤组织培养。
本研究发现, 体积较大的锁阳外植体更适合组织
培养, 这一结论与肉苁蓉的外植体大小研究结果
是一致的(朱咏华等2001)。但是由于锁阳与肉苁
蓉的肉质茎在解剖结构上有本质的区别: 即肉苁
蓉肉质茎为草本双子叶植物茎结构, 由表皮、皮
层、维管组织、髓组成; 而锁阳肉质茎结构类似
于单子叶植物茎的结构, 由表皮、基本组织、散
布于基本组织中的维管束组成(宋玉霞等2002)。
因此, 肉苁蓉的外植体分为维管组织和髓组织(徐
亮胜2005); 而锁阳不能特化出“髓组织”, 只能根据
维管束的分布及外植体最适大小的要求, 将切口
选在维管束周围。在3种外植体中, 愈伤组织均形
成于维管组织处, 其形成率的高低取决于维管组织
分布情况。这一结果与报道的肉苁蓉维管组织为
诱导愈伤组织的最佳外植体一致(Ouyang等2005)。
2 锁阳愈伤组织的继代增殖
在培养初期, 植物生长调节剂是诱导外植体
脱分化、愈伤组织生长的必要条件, 尤其对于寄
生植物而言, 植物生长调节剂的作用还包括解除
寄生植物对寄主的依赖性。在寄生植物组织培养
中, 使用较多的植物生长调节剂包括2,4-D、NAA、
KT和6-BA (Deeks等1999)。增殖培养中需要降低
植物生长调节剂的用量, 愈伤组织生长更好(刘德
华和朱咏华2003)。本研究发现, 锁阳增殖培养中
添加2,4-D和6-BA的比例与诱导培养基中的比例
相同, 只是用量减少。将外植体与愈伤组织一起
移入增殖培养基, 愈伤组织生长良好, 增殖量大。
而增殖系数较小的原因可能是外植体失水造成质
量减轻, 从而使继代培养后总质量增加较小。直
接继代的愈伤组织, 在培养后期褐化严重, 生长缓
慢。有报道将槲寄生愈伤组织置于山毛榉愈伤组
织上共培养, 发现2种愈伤组织一起生长良好而无
任何接触抑制作用(Deeks等1999)。因此推断外植
体的母体或者寄主的愈伤组织可能起到提供营养
或过滤矿质元素的作用, 从而与外植体共同继代
的愈伤组织生长良好, 这很可能是其寄生生长的
特性决定的。
3 锁阳愈伤组织的分化
本研究发现, 当NAA与6-BA比例为2:1时, 不
仅有利于愈伤组织诱导, 还有利于愈伤组织分化
为不定根, 而且不定根很快产生愈伤组织, 这说明
根尖部分的细胞分化能力很强。野生锁阳下部生
有不定根, 根尖在接触到寄主根时粘于其上, 膨大
并将其具有分生能力的细胞植入寄主根中, 这些
细胞在寄主根内沿皮层向四周扩展, 呈带状分布,
并产生新的芽体(李天然等1994)。目前, 寄生植物
愈伤组织诱导出不定根的有分布于桑寄生科、檀
香科、玄参科和列当科的共8种植物(Deeks等
1999)。本方法丰富了寄生植物组织培养研究, 并
为锁阳寄生生物学研究探索了新的方法。
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