全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (2): 197~201 197
收稿 2011-11-17　　修定 2011-12-29
资助 国家自然科学基金项目(30970308)、中科院“西部之光”
人才培养计划(08DF01)和中国博士后科学基金面上资助
(20090461309)。
* 通讯作者(E-mail: wangyj@nwu.edu.cn; Tel: 029-88303484)。
小蔓长春花组织培养快速繁殖中的遗传稳定性
何斌, 侯恩太, 王英娟*, 李多伟, 步怀宇
西北大学西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室, 西安710069
摘要: 以小蔓长春花茎段为外植体, 在含1.5 mg·L-1 NAA的MS固体培养基上直接生根, 多次继代培养、移栽, 建立小蔓长春
花组织培养快速繁殖体系。利用RAPD技术结合高效液相色谱技术对连续三次继代无菌苗和炼苗后小蔓长春花的遗传稳
定性、长春胺含量稳定性进行分析。结果显示, 实验选取的20条随机引物共扩增出清晰的46个条带, 不同植株扩增获得的
条带数目和带型一致, 在所检测范围内继代培养和炼苗均未影响小蔓长春花DNA序列。同时HPLC测得相应材料中长春胺
含量均在0.12%以上, 培养过程中长春胺含量稳定。本实验建立的小蔓长春花组织培养快速繁殖体系遗传稳定、长春胺含
量稳定, 可用于大量繁殖小蔓长春花无菌植株, 为长春胺生产的提供资源。
关键词: 小蔓长春花; 遗传稳定; RAPD; HPLC
Analysis of Genetic Stability in Rapid Propagation of Vinca minor L.
HE Bin, HOU En-Tai, WANG Ying-Juan*, LI Duo-Wei, BU Huai-Yu
Ministry of Education Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Northwest University, Xi’an
710069, China
Abstract: The stem-segmens of Vinca minor were cultured on MS medium supplemented with 1.5 mg·L-1
NAA. A few of roots were induced and then rapid propagation system was established. Random amplified poly-
morphic DNA (RAPD) markers were used to assess the genetic stability of regenerated plantlets and HPLC was
used to assess the stability of vincamine contents. The results demonstrated that the 20 screened primers used in
this analysis yielded 46 scoreable bands. These 46 bands were monomorphic with identical bands at DNA level
among all leaves from the regenerated plantlets, transplants and control plants of Vinca minor. The average
vincamine contents of different plants of Vinca minor are all above 0.12% and have no significant differ-
ence. This rapid propagation system of Vinca minor might be used for micropropogation of vincamine.
Key words: Vinca minor L.; genetic stability; RAPD; HPLC
小蔓长春花为夹竹桃科(Apocynaceae)蔓长春
花属多年生藤本植物, 全草入药(张宗勤和杨金祥
1995)。长春胺(vincamine)为小蔓长春花中的一种
主要生物碱, 能有效预防和治疗缺血性心脑血管
疾病及其并发症, 具有良好的市场前景。
本实验室的组织培养中, 发现离体培养的小
蔓长春花中长春胺的含量与种植基地植株差异不
显著, 利用组织培养生产长春胺有其可行性。但
相关文献报道, 植物组织培养过程中普遍存在体
细胞无性系变异现象(Rani和Raina 2000; Tripathi等
2006; 丰先红等2010), 组织培养植株比常规方法繁
殖植株常表现出更多的变异(冯霞等2006; 李莉等
2004)。因此, 为保证无菌植株中长春胺含量的稳定,
组织培养无菌植株的稳定遗传是非常重要的。
本文拟通过RAPD技术结合HPLC分析小蔓长
春花离体培养中各阶段的遗传和长春胺含量的稳
定性, 为离体培养生产长春胺方案的可行性提供
遗传稳定性数据。
材料与方法
1 材料
小蔓长春花(Vinca minor L.)植株采自陕西省
渭南市。
2 试剂与仪器
长春胺标准品(中国药品生物制品鉴定所, 编
植物生理学报198
号为100747-200501); 甲醇为色谱纯(Fisher Chemi-
cal ChemAlert); 其他试剂均为国产分析纯; PCR引
物购自上海Sangon公司的80条随机引物(编号
S1~S80); 2×Taq PCR Master Mix和Marker等购自
北京TIANGEN公司。
实验涉及到的仪器设备包括Waters 2965型高
效液相色谱仪(2695型高压恒流泵、2996 PDA检
测器和Empower系统); DENVER UB-7标准型pH
计; W201恒温水浴锅(上海申生科技有限公司);
Sartorius BS210S型分析天平; RE-52AA旋转蒸发
仪(上海亚荣生化仪器厂); SHB-III循环水式多用
真空泵(郑州长城科工贸有限公司); Eppendorf
5332型PCR仪; SHIMADZU UV-2550型紫外分光
光度计。
3 实验方法
3.1 无菌苗体系的建立、继代及炼苗和移栽
小蔓长春花植株地上部分清水洗净后 , 用
75%乙醇浸泡30 s, 无菌水冲洗3次, 然后用0.1%
HgCl2浸泡灭菌8 min, 无菌水冲洗5次后置于无菌
滤纸上吸干水分。将处理后的植株截成2~3 cm带
腋芽的茎段接种于含1.5 mg·L-1 NAA的MS固体培
养基上, 置于温度为(25±1) ℃, 光照强度为30~50
μmol·m-2·s-1, 日照时间为16 h/8 h (光/暗)的条件下
培养, 35 d时统计生根成活率。
无菌植株培养至35 d时, 截取长2~3 cm无菌植
株茎段扦插在含1.5 mg·L-1 NAA的MS固体培养基
上培养, 以后每35 d继代培养一次。
选取植株健壮、根系发达, 苗高约5 cm的无
菌植株于自然光温室中炼苗3 d后, 移栽于营养盆
钵(蛭石:腐殖土:田园土=2:1:1)中并覆盖塑料薄膜
保湿培养, 7 d以后逐渐揭开薄膜, 35 d统计炼苗的
移栽成活率。
3.2 引物的筛选
参考文献(顾红雅和瞿礼嘉1998; Gupta等2011),
采用CTAB法提取小蔓长春花基因组DNA, 并用紫
外分光光度法测定样本DNA浓度, 并稀释至30 ng·
μL-1备用。
PCR反应体系为20 μL: 10 μL 2×Taq PCR
Master Mix、1 μL引物(S1~S80)、2 μL模板DNA、
7 μL ddH2O。PCR扩增条件为: 94 ℃预变性5 min,
94 ℃变性50 s, 36 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 72 ℃
延伸10 min; 30个循环。PCR 产物进行1.5%琼脂
糖凝胶电泳后, 紫外凝胶成像仪记录电泳条带的
数目和位置, 选取其中扩增条带数目多且清晰的
20条引物用于RAPD分析(岑举人等2009)。
3.3 RAPD分析
用3.2节中PCR反应体系、程序及确定的20条
随机引物分别对大田种植小蔓长春花、连续三次
继代无菌苗(第5~7代)和移栽后培养50 d小蔓长春
花的基因组进行RAPD分析。
3.4 长春胺含量测定
3.4.1 色谱条件 参考侯恩太等(2010a)方法如下,
Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm), 流
动相为甲醇: 1%二乙胺(磷酸调pH值至7.5)=65:35
(v/v), 流速为1.0 mL·min-1, 检测波长为280 nm, 柱
温为室温, 进样量20 μL。
3.4.2 标准品溶液制备 称取长春胺标准品5 mg,
色谱甲醇定容至10 mL, 得浓度为0.5 mg·mL-1标准
品溶液, 4 ℃保存备用。
3.4.3 供试品制备 分别收集经过RAPD分析的大
田种植小蔓长春花、连续3次继代无菌苗和移栽
小蔓长春花, 80 ℃杀青30 min, 60 ℃下烘干至恒
重。分别称取上述样品1 g, 石油醚脱色后, 加5倍
体积的甲醇, 80 ℃索氏提取5 h, 回收甲醇至干, 1
mol·L-1盐酸溶解过滤后氨水调至pH 9.0, 氯仿萃取,
回收氯仿至干, 色谱甲醇定容至10 mL, 以0.45 μm
微孔滤膜过滤(侯恩太等2010b)。
3.4.4 线性关系分析 吸取适量标准品溶液分别稀
释至0.4、0.3、0.2、0.12、0.1、0.05 mg·mL-1, 按
上述色谱条件进行测定, 以峰面积的积分值为纵
坐标(Y), 长春胺含量为横坐标(X)绘制标准曲线。
实验结果
1 无菌苗体系的建立及无菌苗的炼苗和移栽
小蔓长春花在含1.5 mg·L-1 NAA的MS固体培
养基上生长旺盛, 15 d即可生根(图1-A)。35 d统计
小蔓长春花外植体生根成活率为60%。选取植株
长势良好、根系发达且株高在5 cm以上的植株(图
1-B)进行炼苗和移栽。
将长势较好的无菌植株于自然光温室中炼苗
后, 移入营养盆钵中, 于阴暗处培养, 15 d即有新芽
长出, 长势良好。35 d时统计小蔓长春花无菌苗炼
何斌等: 小蔓长春花组织培养快速繁殖中的遗传稳定性 199
苗、移栽成活率为70% (图1-C)。
2 引物筛选及RAPD的扩增结果
80条随机引物对小蔓长春花无菌植株基因组
进行RAPD分析, 大多数引物只能扩增出少数条带
或条带不清晰, 部分引物未扩增出条带, 其中能扩
增出清晰条带的引物有20条(图2)。因此, 选取该
20条引物(S22、S24、S38、S42、S46、S51、
S52、S53、S55、S56、S58、S60、S65、S67、
S71、S72、S73、S74、S75、S76)作为小蔓长春
花的遗传稳定性RAPD分析的引物。
用上述所选的20条引物分别对野生小蔓长春
花、连续3次继代无菌苗和移栽小蔓长春花进行
RAPD扩增。
RAPD扩增结果(图3)显示: 20条随机引物在
不同植物材料中扩增带数在1~5条之间, 总带数为
46条, 平均2.3条; 并且每一引物在不同材料中获得
的扩增带数和带型基本一致, 表明在所检测的范
围内继代培养和炼苗及移栽均未影响小蔓长春花
DNA序列, 继代试管苗和移栽苗以及野生小蔓长
春花间完全保持一致。RAPD扩增结果中只是在
S24、S73的扩增条带中, 第5~7代间谱带带型亮度
会有微弱差异。所以RAPD分析揭示, 小蔓长春花
经离体再生、移栽培养等过程获得的再生植株
DNA水平上基本没有变化, 未显示出多态性, 说明
小蔓长春花组织培养过程中没有引起植物体细胞
无性系的明显变异。
3 长春胺含量
长春胺峰面积积分值(Y)与长春胺含量(X)之
间的线性回归方程为: Y=1E+07X–874522 (R2=
0.995, n=6)。结果表明, 在0.05~0.50 mg·mL-1范围
内, 长春胺含量与其峰面积线性关系良好。
采用上述色谱体系分别对大田种植小蔓长春
花、连续三次继代无菌苗和移栽小蔓长春花中长
春胺含量进行HPLC测定(表1)。测定结果经单因
素方差分析, 野生小蔓长春花、连续三次继代无
菌苗和移栽小蔓长春花中长春胺含量差异不显著
[F(4,10)=1.887, P=0.189>0.05], 表明小蔓长春花植株
在继代培养过程中长春胺含量稳定。
图1 小蔓长春花无菌苗体系建立及炼苗过程
Fig.1 The procedure of regenerated plantlets and transplanted plantlets of V. minor
A: 小蔓长春花的诱导生根; B: 小蔓长春花的无菌苗; C: 小蔓长春花炼苗后移栽成活的株系。
图2 小蔓长春花能扩增出清晰条带的RAPD扩增结果
Fig.2 RAPD amplification from the regenerated plantlets of V. minor in efficient primers
M: DL2000分子量标准。
植物生理学报200
讨　　论
RAPD分析结果显示, 小蔓长春花经离体再
生、移栽培养等过程中植株DNA水平上没有变化,
图3 小蔓长春花不同植株的RAPD扩增
Fig.3 RAPD amplification from the different plants of V. minor
1: 野生小蔓长春花；2~4: 继代5~7次的无菌苗；5: 炼苗、移栽后的小蔓长春花。
小蔓长春花植株继代培养过程中遗传稳定; HPLC
法同步分析长春胺含量表明, 小蔓长春花植株在
继代培养过程中长春胺含量稳定。同时小蔓长春
花离体培养具有周期短, 繁殖量大等优点, 利用组
何斌等: 小蔓长春花组织培养快速繁殖中的遗传稳定性 201
织培养无菌植株生产长春胺的方案是可行的。
小蔓长春花原产欧洲, 大田种植小蔓长春花
生长较慢, 产量低, 采用组织培养离体快速繁殖小
蔓长春花对长春胺生产具有重要意义(王怀智等
1996)。本研究以小蔓长春花带腋芽茎段为外植
体, 不经愈伤组织直接诱导生根, 获得了植株再生
体系, 利用RAPD技术鉴定了不同小蔓长春花的遗
传稳定性, 在检测的范围内继代培养和炼苗均未
引起小蔓长春花DNA片段长度多态性和核苷酸序
列的变化。这与文献中未经愈伤组织直接由体细
胞分化成器官, 可以降低由愈伤组织诱导产生的
间接器官再生过程中细胞内染色体变异的机率,
即降低组织培养过程中体细胞无性系变异机率相
一致(丰先红等2010; 冯霞等2006)。
小蔓长春花的DNA变化在继代培养及炼苗过
程中表现出较高的遗传稳定性, 其离体培养是一
种稳定的繁殖方式 , 这一结果与本实验室在土
三七、滇黄芩上的结果相符(岑举人等2009, 2010)。
但由于小蔓长春花基因组庞大, 即使我们利用一
些引物检测了DNA的稳定性, 鉴定结果还是有一
定的局限性(Peredoa等2009), 实验结果还有望得到
其他分子标记技术的进一步确定。
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表1 小蔓长春花不同植株的长春胺含量(n=3)
Table 1 Vincamine contents of different plants
of V. minor (n=3)
植株样品 长春胺含量/‰
野生小蔓长春花 1.484±0.003
第5次继代无菌苗 1.489±0.002
第6次继代无菌苗 1.485±0.003
第7次继代无菌苗 1.489±0.003
移栽小蔓长春花 1.487±0.005