全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月 677
收稿 2009-05-05 修定 　2009-06-17
资助 国家自然科学基金(30 8 00 7 4 8)和中国博士后科学基金
(2 00 704 110 80 )。
* 通讯作者( E-ma i l : l i u s y @o i l c ro ps . cn ; T el : 0 2 7 -
8 6 8 1 2 8 9 6 )。
水杨酸途径中的防御基因在转草酸氧化酶基因油菜中的表达
冀瑞琴 1,2, 董祥柏 2, 冯辉 1, 高荣村 2, 刘越英 2, 刘胜毅 2,*
1 沈阳农业大学园艺学院, 沈阳 110161; 2 中国农业科学院油料作物研究所, 武汉 430062
提要: 采用RT-PCR方法检测对水杨酸依赖的信号途径中PR-1、GLU和CHI 3个防御基因在转OXO基因与非转基因的油
菜中表达差异的结果表明, 在转基因油菜株系中这3个基因都有不同程度的上调表达, 暗示转OXO基因的油菜抗菌核病的
能力增强可能与对水杨酸依赖的信号途径受诱导有关。
关键词: 对水杨酸依赖的信号途径; 防御基因; 油菜; 菌核病
Expressions of Defense Genes of Salicylic Acid-Dependent Signal Pathway in
Oxalate Oxidase Transgenic Oilseed Rape (Brassica napus L.)
JI Rui-Qin1,2, DONG Xiang-Bai2, FENG Hui1, GAO Rong-Cun2, LIU Yue-Ying2, LIU Sheng-Yi2,*
1College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China; 2Oil Crops Research Institute, Chinese
Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China
Abstract: Expressions of three defense genes (PR-1, GLU and CHI) of salicylic acid (SA)-dependent signaling
pathway were measured by RT-PCR in transgenic oilseed rape (Brassica napus) lines and wild plants. The
results showed that the three genes were all up-regulated expressed in transgenic lines, which indicated that the
mechanism of enhanced resistance to Sclerotinia sclerotiorum of transgenic lines was related to the induction of
SA-dependent signaling pathway.
Key words: salicylic acid (SA)-dependent signaling pathway; defense genes; oilseed rape (Brassica napus);
Sclerotinia sclerotiorum
在植物与病原互作中发生的一系列生化反应
与大量的基因受诱导表达有关, 这些基因编码的蛋
白质参与植物对病原物的防御反应, 称之为防御相
关基因(defense-related genes)或简称为防御基因
(defense genes)。至今己从不同植物中分离出多种
防御基因的 cDNA 克隆和基因组克隆(Glazebrook
1999; 董霞等 2007)。最近有人在拟南芥中的研究
发现, 防御反应受一个复杂的信号网络调控, 其中
包括对水杨酸(salicylic acid, SA)依赖的信号途径、
对茉莉酸(jasmonic acid, JA)/乙烯(ethylene, ET)依
赖的信号途径和氧爆发(oxygen burst, OB)途径等
(Glazebrook 1999; Feys 和 Parker 2000)。就特定
的植物 - 病原系统来说, 植物对病原的反应可能包
括这些途径中的一种或几种, 每条途径各有其标记
基因, 其中病程相关蛋白-1基因(pathogenesis related
proteins-1, PR-1)、葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase,
Glu)和几丁质酶基因(Chitinase, Chi)等被普遍认为
是对SA依赖的信号途径的防御基因, PR-1 为该途
径的标记基因(Glazebrook 1999)。
此外, 菌核病是世界范围内多种作物的严重病
害。到目前为止, 人们在防治菌核病中已做了较多
研究(黄剑华等 2001; Liu等 2005; 冀瑞琴等 2006),
但进展较缓慢。研究认为, 草酸氧化酶(oxalate
oxidase, OXO)可以通过降解核盘菌分泌的毒素草酸
而生成H2O2 (Dong等2008), 并认为H2O2有以下几
方面的防御作用: (1)植物组织中一定浓度的H2O2直
接对病原微生物产生毒害作用(Peng和 Kuc 1992);
(2)可能对植物细胞壁有一定的加固作用(Bolwell等
1995); (3)能激发SA的合成(Leon等1995); (4)能对
信号转导网络中的多种防御反应起调控作用, 如过
敏反应(hypersensitive response, HR)的诱导、对 JA/
ET依赖的信号途径的诱导(冀瑞琴等 2009)以及病
程相关(pathogenesis related, PR)蛋白和植物抗毒素
的合成等(Greenberg等 1994; Hammond-Kosack和
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月678
Jones 1996)。H2O2 的这些作用吸引了从事分子植
物病理学研究者的兴趣, 他们试图采用产H2O2的酶
超表达来增强植物的抗病性。现已有很多成功的
例子。如表达小麦OXO酶的转基因大豆(Donaldson
等 2001)、转基因白杨(Liang 等 2001)和转基因向
日葵(Hu等 2003)表现出对产草酸(oxalic acid, OA)
病原菌(如Sclerotinia sclerotiorum)的抗性。我们的
前期工作曾用基因工程技术将小麦OXO基因导入
寄主植物甘蓝型油菜品系‘84039M’中, 这些转基因
株系都表现出一定的抗菌核病的效应( Dong 等
2008)。我们推测此种抗病性的增强有双重作用,
一是降解草酸, 减少草酸的毒害; 二是诱导防御信
号转导途径。前者已得到证实(Dong 等 2008), 但
抗病反应产生是否与防御信号途径中对SA依赖的
信号途径的诱导有关尚不清楚。所以本文以对SA
依赖的信号途径中几种防御基因的表达对此问题进
行了检测。
材料与方法
我们课题组曾以农杆菌介导方法将OXO导入
甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品系 ‘84039M’ 中。
并通过加代扩繁获得了 T 6 代转 O X O 油菜株系
(Dong 等 2008)。本文以 T6 代转 OXO 油菜株系和
非转基因植株为材料进行试验。
T6代转OXO油菜种子在25 ℃下催芽后, 选露
白种子并播于 9 cm×9 cm的钵中, 温室中土培(土:
蛭石 =5:1), 每天 16 h光照(25 ℃)、8 h黑暗(20 ℃),
光照强度为 200 μmol·m-2·s-1, 相对湿度为 70%。油
菜幼苗长到四叶一心期取样, 置于液氮中速冻, 于
-80 ℃保存备用。
提取RNA时, 分别取T6代转OXO株系和非转
基因植株叶片, 采用TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad,
CA)试剂提取 RNA (参照 TRIZOL 说明书进行)。
采用 SuperscriptTM II (Invitrogen)合成第一链
cDNA (参照说明书进行)。线性扩增期确定时, 以
不同浓度 ‘84039M’ 的 cDNA 为模板, 检测内参基
因ACTIN在不同循环数下产物量的差异, 找出线性
扩增期循环数作为半定量过程中的参照循环数。
RT-PCR检测时, 以合成的各转基因株系和非
转基因植株的第一链cDNA为模板, 以各基因及内
参基因 ACTIN 的引物(上海生工合成)在线性扩增
期进行半定量 PCR, 相关参数见表 1。
表 1 RT-PCR 中防御基因的引物、退火温度和循环数
Table 1 The primers, annealing temperature and cycle numbers of defense related genes for RT-PCR
基因 NCBI 序列号 引物 序列(5→3) 产物长度 /bp 退火温度 /℃ 循环数 / 个
ACTIN AF111812 F TCTGGCATCACACTTTCTACAACGAGC 669 6 6 2 2
R CAGGGAACATGGTCGAACCACC
OXO AY884024 F GTCCTGCAGCATGGGGTACTCCAAAAC 692 5 5 2 2
R CCGTCGACTTAAAACCCAGCGGCAAAC
PR-1 AY623008 F AAGTCACTAACTGTTCTCGAC 541 5 5 2 2
R GAATATGTAAACACGTCCAC
CHI Q06209 F AGGCGGTAGTCTTGGTAGCATTGT 260 5 8 2 6
R TGTTGTTCTCGTCGCAGTAGTCAC
GLU NM_117722.2 F CAGCGGTTGATATGACTTTGATTG 400 5 2 2 6
R CGTGCCGCCAGGTTCGT
实验结果
1 小麦OXO基因在油菜植株内正常转录
通过RT-PCR的方法检测了T6代转OXO基因
PCR检测阳性植株中OXO的表达, 以非转基因植株
为阴性对照, 结果表明, 3 个转基因株系中 OXO 基
因均有不同程度的表达, 在 OX14 中表达量最高,
OX10 次之, OX1 中表达量最低, 而在对照中未见
表达(图 1)。
2 PR-1基因的表达分析
从图2可见, PR-1基因在3个转基因株系中都
有明显的上调表达, 非转基因油菜中, 此种基因表
达量较低。3个转基因株系中, OX1的表达量最高,
OX10次之, OX14较低, 但这3个转基因株系的PR-1
基因表达量均明显高于非转基因的植株。
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3 CHI基因的表达分析
图 3显示, CHI 基因在 3个转基因株系中都有
一定的上调表达, 而在非转基因植株中, 几乎没有
表达, 条带用肉眼很难辨认; 在 3 个转基因株系中,
CHI 在OX1中表达量最高, 条带较清晰。OX10和
OX14 中 CHI 的 PCR 条带隐约可见。
株系中都隐约可见, 3 个株系中, OX1 的条带较明
显, 表达量相对较高, 其它 2个株系的表达量较低。
图 1 OXO 基因在转基因株系与非转基因
植株中表达的 RT-PCR 分析
Fig.1 RT-PCR analyses of OXO expression in OXO
transgenic plants and non-transgenic plants
1 ~ 3 分别为转基因株系 O X1 4、O X1 0 和 O X 1。
图 2 防御基因 PR-1在油菜转 OXO基因株系与
非转基因植株中的 RT-PCR 分析
Fig.2 RT-PCR analyses of defense gene PR-1 in OXO
transgenic oilseed rape lines and non-transgenic plants
1 ~ 3 分别为转基因株系 O X1 4、O X1 0 和 O X 1。
图 3 防御基因 CHI 在转 OXO 基因油菜株系与
非转基因植株中的 RT-PCR 分析
Fig.3 RT-PCR analyses of defense gene CHI in OXO
transgenic oilseed rape lines and non-transgenic plants
1 ~ 3 分别为转基因株系 O X1 4、O X1 0 和 O X 1。
4 GLU基因的表达分析
图 4 结果表明, 非转基因植株中, GLU 基因几
乎没有表达, 条带用肉眼很难辨认; 而 3 个转基因
讨　　论
在以前的工作中, 我们对稳定遗传的 T6 代转
OXO基因油菜株系进行离体叶和田间抗病鉴定的
结果表明, 转OXO基因的油菜抗菌核病能力显著增
强, 而且它们的抗草酸能力也显著提高(Dong 等
2008)。本文结果又显示, 转基因株系中OXO表达
量与抗病能力呈正相关, 抗病能力最高的OX14中
OXO表达量也最高(图1), 用二氨基联苯胺(DAB)染
色方法检测接菌的转基因油菜, 其H2O2含量显著高
于非转基因植株(Dong 等 2008)。这些表明, OXO
的表达使油菜抗菌核病能力提高, 在这一过程中生
成的 OXO 降解 OA 后产生了 H2O2。
已有资料表明, OXO引起的抗病性与H2O2介
导的防御反应有关(Greenberg 等 1994; Hammond-
Kosack 和 Jones 1996)。对 SA 依赖的信号途径是
植物防御信号转导中的一个主要途径(王利军等
2002)。本文结果表明, 在 3 个 T6 代转 OXO 基因
油菜株系 OX10、OX14、OX1 中, 对 SA 依赖的
信号途径中的关键基因 PR-1 都有明显的上调表
达。株系 OX1 中表达量最高, OX10 中表达量次
之, OX14中表达量最低, 但都明显高于非转基因植
株(图 2)。据此, 我们推测, 小麦 OXO 基因导入油
菜后, 可能介导了对SA依赖的信号转导途径, 从而
进一步增强了转基因油菜的抗菌核病能力。为了
证实这一观点, 我们选取这一途径的另外两个下游
基因 CHI 和 GLU, 进行表达分析的结果也与 PR-1
表达趋势类似, 均表现为在OX1株系中的表达量最
高, 其它两个株系中的表达量较低, 但在 3 个转基
图 4 防御基因 GLU 在转 OXO 基因油菜株系与
非转基因植株中的 RT-PCR 分析
Fig.4 RT-PCR analyses of defense gene GLU in OXO
transgenic oilseed rape lines and non-transgenic plants
1 ~ 3 分别为转基因株系 O X1 4、O X1 0 和 O X 1。
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因株系中的表达量都高于非转基因植株(图 2~4)。
基于 PR-1、GLU 和 CHI 都是对 SA依赖的信号途
径中的防御基因这一认识, 我们推测, 转OXO基因
油菜抗菌核病能力的增强可能与草酸降解过程中产
生的 H2O2 可诱发对 SA 依赖的信号途径有关。
防御信号途径之间存在相互作用的研究已有
很多报道(Niki 等 1998; Gupta 等 2000)。本文比较
3个转基因株系中OXO基因的表达与对SA依赖的
信号途径中防御基因表达规律时也见到二者呈现负
相关。OXO 在 OX1、OX10 和 OX14 三个转基因
株系的表达结果显示, OX14 中的表达量高于其它
两个株系, OX1 中的表达量最低(图 1), 而在 OXO
表达量最低的 OX1 株系中所检测的 3 个防御基因
表达量却最高(图 2~4), 其原因可能与H2O2介导的
多条防御信号途径之间的相互作用有关。
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