全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (2): 209–215　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0663 209
收稿 2015-12-16　　修定 2016-01-13
资助 国家自然科学基金(31270655)和国家“863”计划(2011-
AA10020102)。
致谢 美国佛罗里达大学Eric Mclamore教授在生长素测定方面
给予技术支持和指导, 中国农业科学院作物科学研究所傅
永福研究员课题组在实时定量PCR方面给予技术支持。
* 通讯作者(E-mail: ybshen@bjfu.edu.cn)。
反式-2-己烯醛抑制拟南芥根尖生长素极性运输
张婷, 闫素丽, 董杉杉, 焦春阳, 张笑, 沈应柏*
北京林业大学生物科学与技术学院, 林木育种国家工程实验室, 北京100083
摘要: 以拟南芥植株为材料, 观察了反式-2-己烯醛熏蒸处理后拟南芥初生根生长变化。采用非损伤微测技术, 从动态生长
素流的角度研究了反式-2-己烯醛处理对拟南芥根尖生长素转运的影响, 并结合实时定量PCR技术检测了反式-2-己烯醛处
理后生长素极性转运相关基因的表达。结果表明, 反式-2-己烯醛处理能够抑制拟南芥初生根生长, 且浓度越高抑制作用越
强烈。反式-2-己烯醛显著抑制拟南芥根尖分生区及过渡区的生长素外排, 并显著下调了生长素极性转运基因PIN1、
PIN2、PIN3及生长素感知基因TIR1的表达。说明反式-2-己烯醛抑制拟南芥根尖生长素的极性转运从而影响初生根生长。
关键词: 拟南芥; 反式-2-己烯醛; 生长素; 极性转运; 非损伤微测技术
绿叶性气体(green leaf volatiles, GLVs)是一类
含有6个碳的小分子醛、醇和酯类化合物(Hatanaka
等1987; Matsui 2006)。正常状态下的植物释放极
少量的GLVs, 当植物遭受机械损伤(Kessler等
2006)、昆虫取食(Pare和Tumlinson 1997; Allmann
和Baldwin 2010)或病菌侵染(Croft等1993; Shiojiri
等2006a)等非生物或生物胁迫后, 细胞膜上游离出
的亚油酸及α-亚麻酸经脂氧合酶(lipoxygenases,
LOXs)和氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,
HPL)作用迅速合成GLVs并大量释放出来(Scala等
2013)。GLVs是虫害诱导植物挥发物(herbivore-in-
duced plant volatiles, HIPVs)的重要组成部分。
反式-2-己烯醛(E-2-hexenal)属于GLVs的一
种, 是大多数绿色植物受损伤后都能快速合成并
释放的挥发性物质。以往的研究表明, 反式-2-己
烯醛可以影响某些植食性昆虫的取食、交配及产
卵(Li等2014; Reddy和Guerrero 2000)行为, 还能作
为吸引植食性昆虫天敌的“报警信号”, 帮助植株间
接抵御虫害袭击(许宁等1999; Shiojiri等2006b)。
反式-2-己烯醛具有较高的抗菌活性, 能有效抑制
某些病原菌及真菌的生长(Croft等1993; Kishimoto
等2008)。除此之外, 反式-2-己烯醛也被证明是一
种气体信号物质, 参与诱导植物防御基因的表达
和防御物质的合成。外源己烯醛熏蒸处理激活了
拟南芥体内茉莉酸途径及苯丙烷类途径相关基因
的表达, 诱导植物抗毒素的合成及叶片木质化程
度增加, 继而增强拟南芥的抗病能力(Bate和Roth-
stein 1998; Kishimoto等2006a, b)。反式-2-己烯醛
还会影响植物其他生理过程, 如抑制种子萌发和
影响根部形态建成(Arimura等2010)。
经反式-2-己烯醛熏蒸处理后, 拟南芥初生根
生长明显受抑制, 这一现象与防御信号物质茉莉
酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)作用类似(Bate和
Rothstein 1998)。在GLVs中, 反式-2-己烯醛影响根
生长的作用具有特异性, 这与其特有的化学结构
α,β-不饱和羰基密切相关(Mirabella等2008)。然而
到目前为止关于己烯醛抑制根长生长的机理并不
清楚。生长素(indole-3-acetic acid, IAA)是植物体
内最重要的激素类物质, 它通过极性运输的方式
在植物体内形成以器官顶端为中心的浓度梯度,
维持植物不同组织的生长素浓度差, 从而有效调
节植物各个生长发育过程(李俊华和种康 2006)。
反式-2-己烯醛抑制根长生长的作用是否与生长素
相关, 尚未见研究报道。本研究中, 我们利用非损
伤微测技术(non-invasive micro-test technology,
NMT)实时监测了反式-2-己烯醛处理后拟南芥根
尖生长素的转运过程, 并检测了根尖生长素极性
转运相关基因的表达, 以期揭示反式-2-己烯醛抑
制根长生长的机理。
材料与方法
1 实验材料
本实验材料为野生型拟南芥(Arabidopsis
thaliana L., Col-0)幼苗。首先将拟南芥种子用70%
植物生理学报210
乙醇消毒4 min, 再用去离子水冲洗7~8次, 均匀播
种于含有1/2MS培养基(含2%蔗糖与1.2%琼脂, pH
5.8)的9 cm培养皿上。将培养皿放于4°C黑暗环境
下低温春化2 d, 后垂直放置于Percival公司生产的
拟南芥培养箱内(型号: I-36VL), 培养温度(22±1)°C,
湿度70%, 光周期为16 h光照和8 h黑暗(L16:D8),
光照强度80~110 μmol·m-2·s-1。
反式-2-己烯醛(≥97%)与甲醇(methanol)均购
自Sigma-Aldrich, 取反式-2-己烯醛溶于甲醇配制
成0.32 mol·L-1的溶液, 并置于4°C环境贮存。
2 实验方法
2.1 熏蒸处理
取出培养箱中生长4 d的拟南芥幼苗, 挑选长
势一致的10~15棵幼苗放于1/2MS新培养皿上。将
培养皿垂直放置于容积2 L的玻璃钟罩内, 钟罩内
顶部悬挂一个直径1 cm左右的脱脂棉球。向棉球
上滴加25 μL的反式-2-己烯醛贮存液, 使各钟罩内
反式-2-己烯醛气态浓度分别达到0.5、1、2和4
μmol·L-1, 滴加完毕后迅速将钟罩扣下并用医用凡
士林密封。熏蒸处理环境条件与拟南芥培养条件
一致。将只滴加25 μL甲醇的钟罩设为对照处理。
每个处理包含3个培养皿, 共计30~40棵幼苗。
2.2 拟南芥根长测定
将熏蒸处理24 h后的拟南芥放回培养箱内, 继
续生长3 d后取出并拍照。利用ImageJ软件(http://
rsbweb.nih.gov/ij/)测量每棵幼苗根长并记录, 每处
理共30~40个重复。
2.3 生长素流速测定
取生长6 d的幼苗置于玻璃钟罩内, 用终浓度1
μmol·L-1的反式-2-己烯醛熏蒸并设甲醇为对照处
理, 方法同上。熏蒸4 h后取出幼苗, 用滤纸条和透
明胶条固定根部于塑料皿底并向皿中加入3 mL离
子测试液, 25°C室温平衡30 min后测定。测试液成
分为: 0.1 mmol·L-1 KCl、0.1 mmol·L-1 CaCl2、0.1
mmol·L-1 MgCl2、0.5 mmol·L
-1 NaCl、0.2 mmol·L-1
Na2SO4和0.1 mmol·L
-1 MES, pH 5.8。
采用美国杨格公司生产的非损伤微测系统
(NMT, 型号: BIO-001A)测定拟南芥根尖生长素
流。测试前首先制备IAA电极, IAA电极为尖端直
径1~2 μm的Pt/Ir电极。依照前人的方法(McLamore
等2010), 首先利用电镀技术对电极表面进行铂黑
修饰, 之后对电极硅烷化处理, 最后短暂浸入多碳
纳米管溶液中, 取出并室温干燥备用。将制好的
IAA电极与参比电极同时放入5 mL PBS缓冲液(pH
7.4)中, 增加电压至700 mV极化IAA电极。待通路
电流稳定后, 向缓冲液中多次加入5 μL的IAA (购
自Sigma-Aldrich, ≥98%)溶液, 使缓冲液中IAA终
浓度依次达到20、40、60和80 μmol·L-1, 根据分别
测得的电流计算该电极的标准曲线, R2>0.95的电
极才可用于IAA测定。
将平衡好的的样品置于非损伤微测系统的载
物台上, 调节三维控制装置使电极垂直于根尖外
侧放置, 电极尖端在距离根尖外侧10与30 μm处往
复移动进行测定 , 并从距根冠0、100、200、
300、400、500、600、700、800、900、1 000、
1 100和1 200 μm处分别稳定测试2~3 min, 采样频
率为0.2 Hz。将采集的数据导入Excel表格, 根据
Fick第一扩散定律计算IAA流速: J=–D(∆C/∆X), 其
中, J表示IAA流速(fmol·cm-2·s-1), D代表IAA的扩
散系数7×10-6 cm2·s-1 (25°C), ∆C代表电极移动两点
间的IAA浓度差值, ∆X系数表示电极移动距离20
μm。每组处理均设4次重复。
整合离子流量可以直观反映在测量时间内,
某种离子进出细胞的总量情况。根据每一样品根
尖不同区域的生长素流速 , 利用OriginPro软件
的积分工具计算根尖各区域单位时间内的生长
素流量。
2.4 基因表达量测定
用反式-2-己烯醛熏蒸处理生长6 d的拟南芥
幼苗, 在熏蒸4和12 h后将幼苗取出, 剪取根尖部分
并置于–80°C保存。本实验采用TRIzol试剂盒(北
京全式金生物技术公司)提取根尖组织总RNA。提
取的RNA用1%琼脂糖凝胶电泳以检测完整性, 并
用NanoDrop ND-2000c测定其纯度与浓度, 采用
TaKaRa公司研制的反转录酶将500 ng·μL-1 RNA反
转录成cDNA。实时定量RT-PCR时, 以稀释5倍的
cDNA为模板, 加入TaKaRa公司的SYBRGreen Mix
及扩增引物(表1), 在Applied Biosystems公司的Ste-
pOnePlus Real-Time PCR仪上进行PCR扩增。两步
法PCR反应条件: 95°C预变性30 s; 95°C变性5 s,
60°C退火30 s, 共40个循环并生成溶解曲线。荧光
数据采集后, 用该仪器自带软件进行数据分析。
张婷等: 反式-2-己烯醛抑制拟南芥根尖生长素极性运输 211
各处理组与对照组均有3次独立重复和3次技术重
复, 选择ACTIN7为内参基因, 相对定量分析采用
2–∆∆CT法, 定义4 h对照组目的基因表达量为1, 由此
得到各处理组目的基因的相对表达量。
3 数据统计分析
采用Excel软件对试验数据进行分析, 利用
SPSS 19.0软件对各处理组的数据进行方差分析,
P<0.05表现为差异显著, P<0.01为差异极显著。结
果以平均值±标准差(或标准误)表示。
实验结果
1 反式-2-己烯醛熏蒸对拟南芥初生根生长的影响
反式-2-己烯醛熏蒸处理24 h后, 拟南芥幼苗
初生根生长减缓 (图 1 - A )。经 0 . 5、 1、 2和 4
μmol·L-1反式-2-己烯醛处理后的初生根长度分别
为(12.06±1.4) mm、(9.23±0.66) mm、(7.53±0.72)
mm和(5.76±0.42) mm, 与甲醇(MeOH)对照组根长
(15.77±2.19) mm相比均达到极显著差异(P<0.01)。
四种浓度处理下的根长生长较对照组分别减少了
23.52%、41.47%、52.25%和63.47%, 且反式-2-己
烯醛浓度越高抑制效果越显著(图1-B)。后续实验
中, 设置反式-2-己烯醛熏蒸处理的有效浓度为1
μmol·L-1。
2 反式-2-己烯醛对拟南芥根尖生长素流的影响
通过测定对照组拟南芥根尖生长素流发现,
生长素的转运方向及流速在根尖不同功能区存在
较大差异(图2)。根尖分生区(0~200 μm)及过渡区
(200~500 μm)的生长素表现为持续外流趋势, 且在
根尖300 μm处的外排流速达到最大值。根尖500
μm处开始的伸长区(500~900 μm)及成熟区(>900
μm)的生长素表现为内流趋势, 且内流流速较为平
稳。反式-2-己烯醛熏蒸处理并没有改变各功能区
表1 实时定量RT-PCR所用扩增引物
Table 1 Amplification primers for quantitative real-time PCR
基因名称 正向引物 反向引物
ACTIN7 5′-CCATTCAGGCCGTTCTTTC-3′ 5′-CGTTCTGCGGTAGTGGTGA-3′
PIN1 5′-GGTCGGAACTCTAACTTTGGTC-3′ 5′-CAGCTCCAGCAGCAGTTCCAGC-3
PIN2 5′-CCTCGCCGCACTCTTTCTTTGG-3′ 5′-CCGTACATCGCCCTAAGCAATGG-3′
PIN3 5′-AGCACCTGACAACGATCAAGGCG-3′ 5′-GTTCTCCTCCGAAATCTCCACT-3′
PIN4 5′-CCACTTCATCTCCACCAACGATCC-3′ 5′-CCGGACCAAAATTCGAAAGCCTCC-3′
AUX1 5′-GTTCGTATACGTGAAGGGAGTA-3′ 5′-CACACACTACATATTATCGACT-3′
TIR1 5′-CTTAACCGAGCTGTTCCAC-3′ 5′-AGTAAACATCTGGTCGCACT-3
图1 不同浓度反式-2-己烯醛熏蒸后对拟南芥初生根根长
生长的影响
Fig.1 The impact of E-2-hexenal exposure on primary root
growth of Arabidopsis
A: 不同处理后根长形态变化; B: 不同处理后根长统计结果。
浓度0 μmol·L-1表示甲醇对照处理; 数据为平均值±标准差(n=30~40);
经Tukey多重比较, 数据点上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
生长素进出根尖的方向, 但却显著抑制了根尖分
生区及过渡区的生长素外流, 根尖200 μm及300
μm处的生长素流速分别降低到对照组流速的
34.99%和23.19%。反式-2-己烯醛对根尖600 μm处
的生长素内流有微弱抑制, 但从总体来看, 反式-2-
己烯醛没有显著影响根尖伸长区及成熟区生长素
的内流幅度(图2)。
植物生理学报212
整合根尖生长素流量也有类似规律(图3)。反
式-2-己烯醛处理降低了根尖分生区及过渡区生长
素的外流量, 反式-2-己烯醛抑制过渡区生长素流
量的作用最为明显。两种处理的根尖伸长区与成
熟区生长素的内流量无显著差异。
3 反式-2-己烯醛对拟南芥根尖生长素转运基因表
达量的影响
为进一步揭示反式-2-己烯醛影响根尖生长素
转运的机理, 本实验检测了反式-2-己烯醛熏蒸处
理后生长素转运体基因的转录水平变化。在反
式-2-己烯醛处理4 h和12 h后, 生长素外输载体
PIN1基因的表达量与对照组相比分别降低了
88.22%和75.74% (图4-A), PIN2基因的表达量与对
照处理相比分别降低了32.82%和54.88% (图
4-B)。PIN3基因的表达量分别降低到对照组的
20.30%和28.28% (图4-C)。反式-2-己烯醛则诱导
了PIN4基因的表达量上调, PIN4基因在处理4 h和
12 h处的表达量分别为对照组的2.8和1.8倍(图
4-D)。反式-2-己烯醛并没有显著影响生长素内向
转运体基因AUX1的转录水平, 该基因在两个时间
点的表达量分别为对照处理的0.88和0.93倍(图
4-E)。除影响生长素转运基因的表达外, 反式-2-己
烯醛处理也下调了生长素感知基因TIR1的表达,
TIR1在处理4 h和12 h处的表达量分别降低到对照
处理的50.17%和55.23% (图4-F)。以上结果表明,
反式-2-己烯醛在转录水平上降低了根部生长素的
极性转运和感知过程。
讨　　论
近20年的研究表明, 包括反式-2-己烯醛在内
的GLVs是诱导植株间产生防御反应的重要气体信
号物质(Scala等2013)。除调控防御反应外 , 反
式-2-己烯醛还能对植物的形态建成过程产生影响,
尤其表现为抑制初生根生长。本研究证明, 经反
式-2-己烯醛熏蒸处理后, 拟南芥初生根生长明显
受抑制, 且反式-2-己烯醛的抑制效果具有浓度效
应, 这与前人的研究结果相一致(Bate和Rothstein
1998; Mirabella等2008)。
生长素是调控植物生长发育最重要的激素,
外界环境变化和外源信号物质通过影响植物体内
生长素的合成和转运过程从而影响生长素在植物
体内的分配, 最终表现为影响植物根部及其他部
位的形态建成(Vanneste和Friml 2009)。本研究通
过NMT技术直观证明了反式-2-己烯醛熏蒸处理对
图2 反式-2-己烯醛熏蒸对拟南芥根尖各功能区生长素
流速的影响
Fig.2 Effect of E-2-hexenal treatment on IAA net flux in
different functional regions of the root apex in
Arabidopsis seedlings
离子外流为正值 , 内流为负值。数据为平均值±标准误
(n=4)。甲醇和反式-2-己烯醛分别表示甲醇对照与1 μmol·L-1反
式-2-己烯醛熏蒸处理4 h。
图3 反式-2-己烯醛处理对拟南芥根尖各功能区整合
生长素流量的影响
Fig.3 Effect of E-2-hexenal treatment on integrated IAA flux
in different functional regions of the root apex in
Arabidopsis seedlings
离子外流为正值 , 内流为负值。数据为平均值±标准误
(n=4)。甲醇和反式-2-己烯醛分别表示甲醇对照与1 μmol·L-1反
式-2-己烯醛熏蒸处理4 h。**表示同一区域两组处理之间达到极
显著差异(P<0.01)。
张婷等: 反式-2-己烯醛抑制拟南芥根尖生长素极性运输 213
根尖生长素转运的影响 , 发现根尖过渡区对反
式-2-己烯醛的诱导作用最为敏感。Verbelen等
(2006)证明, 生长5 d左右的拟南芥幼苗距根冠200~
520 μm的区域为根尖过渡区, 该区域细胞生长缓
慢但有丝分裂旺盛, 处于细胞快速伸长的早期状
态。Mancuso等(2005)及McLamore等(2010)的研究
图4 反式-2-己烯醛处理对拟南芥生长素转运及感知相关基因表达量的影响
Fig.4 Analysis of transcript levels of the auxin transport and perception-related genes in Arabidopsis roots after
E-2-hexenal treatment
甲醇和反式-2-己烯醛分别表示甲醇对照与1 μmol·L-1反式-2-己烯醛熏蒸处理4和12 h。ACTIN7为内参基因, 定义4 h对照组目的基因
表达量为1, 根据2-∆∆CT法, 由各处理组目的基因及内参基因的CT值, 计算得到各处理组目的基因的相对表达量。相对表达量表示为平均值±
标准差(n=3)。*表示甲醇对照与反式-2-己烯醛处理组之间达到显著差异(P<0.05), **表示两组处理之间达到极显著差异(P<0.01)。
植物生理学报214
发现, 生长素在玉米根尖过渡区的流速最大, 表明
过渡区是根尖生长素流最活跃的部位。地上部分
合成的生长素向顶运输(根基向根尖运输)到根尖
分生组织后, 再经由过渡区向基运输(根尖向根基
运输)到伸长区细胞, 因此过渡区的生长素转运在
植物根长生长中起关键作用。许多外界刺激都可
以影响过渡区的生长素转运, 如铝抑制拟南芥根尖
过渡区细胞的生长素分泌从而抑制根尖生长(Shen
等2008)。最近的研究发现, MeJA显著降低了拟南
芥过渡区细胞的生长素外排, 表明该区域在MeJA
调控的根发育过程中起重要作用(Yan等2015)。本
研究中, 反式-2-己烯醛显著抑制了生长素从过渡
区向伸长区的转运, 可能导致伸长区生长素不足从
而影响根尖伸长生长, 表现为根生长减缓。
根尖生长素的极性运输依赖于生长素外输载
体PIN蛋白家族。在PIN蛋白作用下, 生长素形成
通过向顶运输和向基运输的“伞形”运输, 使根尖各
部位的生长素呈不对称分布(吴道铭等2014)。本
研究发现, 反式-2-己烯醛处理显著影响了几种PIN
蛋白基因的表达。PIN1主要调控生长素向顶性运
输至根尖的过程(Petrášek和Friml 2009), PIN2在生
长素根尖回流并向基性运输中发挥重要作用
(Baluška等2010), PIN3参与调控生长素在根尖细胞
的侧向分配过程(Friml等2002)。反式-2-己烯醛处
理下调了上述3种外输载体基因的表达, 表明反
式-2-己烯醛对于根尖生长素向顶及向基运输的抑
制作用, 进一步解释了反式-2-己烯醛抑制根尖过
渡区生长素转运的现象。有趣的是, 反式-2-己烯
醛激活了PIN4基因的表达, 考虑到PIN4主要参与
生长素向根尖静止中心的运输(邹纯雪和门淑珍
2013), 对于维持根中生长素浓度梯度发挥作用, 该
基因的表达上调可能是根尖向基性运输被抑制后
的代偿性反应。反式-2-己烯醛处理也抑制了生长
素感知基因TIR1在根尖的表达, 表明反式-2-己烯
醛降低了拟南芥幼苗对生长素的敏感性。
植物体内资源在不同功能间的分配存在“此
消彼长”的平衡关系, 防御反应的升高是以减少生
长发育为代价的。在逆境胁迫下, 植物倾向于减
慢生长速率以节约资源用于防御反应(Coley等
1985)。因此, 反式-2-己烯醛诱导根生长减缓的现
象可能是植物响应其诱导防御作用而采取的一种
资源调控机制。
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E-2-hexenal inhibit polar auxin transport in root of Arabidopsis thaliana
ZHANG Ting, YAN Su-Li, DONG Shan-Shan, JIAO Chun-Yang, ZHANG Xiao, SHEN Ying-Bai*
National Engineering Laboratory for Tree Breeding, College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University,
Beijing 100083, China
Abstract: In this study, primary root length of Arabidopsis thaliana seedlings was measured after E-2-hexenal
fumigation. Using non-invasive micro-test technique, IAA flux rate was detected in different functional regions
of the root apex with or without E-2-hexenal treatment. Furthermore, the expression levels of several polar aux-
in transport relevant genes were quantified by quantitative Real-time PCR. The result indicated that the primary
root growth of Arabidopsis seedlings was strongly inhibited after E-2-hexenal exposure, and the inhibition was
significant along with the increased concentrations of this aldehyde. E-2-hexenal significantly repressed the
auxin efflux rate in the meristem and transition zone of seedling roots. E-2-hexenal also down-regulated the
transcription expression level of auxin transport-related genes PIN1, PIN2, PIN3, and the IAA perception gene
TIR1. Therefore, E-2-hexenal has the negative effect on polar auxin transport in roots, which finally inhibited
the primary root elongation.
Key words: Arabidopsis thaliana; E-2-hexenal; IAA; polar auxin transport; non-invasive micro-test technique
Received 2015-12-16 Accepted 2016-01-13
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31270655) and the National “863” Project (Grant
No. 2011AA10020102).
*Corresponding author (E-mail: ybshen@bjfu.edu.cn).