全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 3期，2009年 3月244
拟南芥AtcpSecA基因表达的特异性
李金萍, 李鹏丽, 于蕴卿, 王宁宁 *
南开大学生命科学学院, 天津 300071
提要: 前期研究表明AtcpSecA基因的突变使叶绿体发育缺陷, 内部缺少正常类囊体片层结构, 叶片呈黄白色。在此基础上
我们进一步研究AtcpSecA基因的表达特异性, 并构建了AtcpSecA基因启动子与报告基因GUS的融合基因AtcpSecA::GUS,
以农杆菌介导方法转化获得转基因拟南芥。GUS组织化学染色结果表明, 在AtcpSecA::GUS转基因拟南芥的下胚轴、子叶、
叶片、果柄等绿色组织中有很强的GUS活性, 而在根、花序和种荚等非绿色组织中几乎没有GUS活性。降低培养基中琼
脂浓度转基因拟南芥中AtcpSecA::GUS基因的表达明显受抑制, 暗中则显著受到促进。
关键词: 拟南芥; AtcpSecA基因; 启动子; 表达特异性
Expressional Characterization of Arabidopsis AtcpSecA Gene
LI Jin-Ping, LI Peng-Li, YU Yun-Qing, WANG Ning-Ning*
College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China
Abstract: We identified an Arabidopsis mutant with a T-DNA insertion in AtcpSecA gene. The mutant of AtcpSecA
gene resulted in chloroplast development defects. The homozygous mutant lacked thylakoid lamella and showed
albino phenotype. In order to study AtcpSecA gene expression pattern, we cloned the promoter of AtcpSecA
gene and an expression vector containing the AtcpSecA::GUS fusion gene was constructed and introduced into
Arabidopsis by Agrobacterium-mediated floral dip method. The strong GUS expression were observed in
hypocotyls, cotyledon, leaves and pedicels, while weak GUS expression were observed in roots, inflorescence
and siliques. The expression of AtcpSecA::GUS was suppressed when agar concentration was decreased, and
dark treatment could increase the expression of AtcpSecA::GUS.
Key words: Arabidopsis; AtcpSecA gene; promoter; expression specificity
收稿 2008-12-01 修定 2009-01-12
资助 国家 “ 86 3” 项目(200 7AA10Z1 05)、国家自然科学基
金项目(3 06 70 19 3)和教育部 “ 新世纪优秀人才支持计
划 ” 项目(NCET-05 -0224)。
* 通讯作者(E-mail: wangnn@nankai.edu.cn; Tel: 022-
2 3 5 0 4 0 9 6 )。
叶绿体自身可以编码100多个蛋白, 其余绝大
多数的叶绿体蛋白则是由核基因编码的(Chi 等
2008)。核基因编码的叶绿体蛋白首先在胞质中合
成前体, 然后通过叶绿体被膜运输到叶绿体中。
SecA (cpSecA)是叶绿体蛋白转运 Sec途径中一个
重要组分(Di Cola等 2005)。细菌中 SecA在蛋白
转运中的作用已经有很多的研究报道(Duong和
Wickner 1997; van der Wolk等1997), 豌豆(Nakai等
1994)、菠菜(Berghfer等 1995)和玉米(Voelker等
1997)等植物中也已经鉴定出相应的 SecA编码基
因。
我们的前期研究中曾获得叶片呈黄白色表型
的拟南芥突变体, 并证明这是由于T-DNA插入造成
AtcpSecA基因(At4g01800)被破坏导致的(马媛媛
2006)。为深入研究拟南芥AtcpSecA基因的表达调
控模式、及其在叶片发育过程中的功能, 我们根据
ABRC国际数据库中已知的拟南芥序列信息, 从拟
南芥基因组DNA中克隆了AtcpSecA基因的启动子
及部分编码序列, 并构建了该序列与报告基因GUS
的融合基因双元表达载体。用农杆菌介导的花苞
浸泡法转化拟南芥, 并以GUS组织化学染色方法,
初步研究了拟南芥不同组织器官和不同发育阶段的
AtcpSecA基因的表达特异性, 以及琼脂浓度、黑暗
处理等外界环境因子对AtcpSecA基因表达的调控。
材料与方法
植物材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)生
态型‘Colombia’, 为我们实验室保存。生长条件: 温
度(22±1) ℃; 光周期 16 h光 /8 h暗; 光照强度 75
µmol·m-2·s-1。
大肠杆菌DH5α菌株用于基因克隆和感受态
植物生理学通讯 第 45卷 第 3期，2009年 3月 245
细胞的制作。根癌农杆菌GV3101菌株用于拟南
芥的遗传转化。以上菌株均为本实验室保存。
携带 G U S 和 h p t 基因的双元表达载体
pCAMBIA1301用于启动子与GUS融合基因的植物
表达载体构建。
限制性内切酶、T4 DNA连接酶、用于 PCR
的DNA聚合酶、高保真聚合酶 pfu及DNA回收
试剂盒均购自宝生物(TaKaRa)公司; 引物由上海生
物工程公司代为合成; 潮霉素(hygromycin)购自
Roche公司; 其他生化试剂均为国产分析纯。
以野生型拟南芥的基因组DNA为模版, 用引
物对SecA_Pro1(5-GAA TTC TGC GAA TGG ATG
AGG AGT TTG-3, 粗体部分为引入的 EcoRI酶切
位点)和 SecA_Pro2 (5-ATC CAT GGA TTC TCC
TTT CTG AGC-3, 粗体部分为引入的 NcoI酶切位
点)扩增 AtcpSecA启动子。PCR反应条件如下: 94
℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 30个循
环; 72 ℃ 10 min。将反应后的 PCR产物进行琼脂
糖凝胶电泳, 回收目的DNA片段。然后连入TA克
隆载体 pMD18-T Vector, 16 ℃, 连接反应 0.5~2 h
或过夜, 并转化大肠杆菌 DH5α。
将测序后正确的AtcpSecA基因启动子的TA克
隆质粒经 EcoRI/NcoI双酶切, 回收 1 kb AtcpSecA
基因启动子片段, 用 T4 DNA连接酶, 同经 EcoRI/
NcoI双酶切双元载体 pCAMBIA1301 DNA获得的
11 kb片段相连接, 并转化大肠杆菌DH5α, 在含有
50 mg·L-1卡那霉素的 LB培养基上筛选转化子。
提取阳性转化子的质粒进行酶切鉴定(参考内
切酶的使用说明书)。大肠杆菌质粒的提取采用
SDS碱裂解法, 药品的配置及具体操作步骤参考
《分子克隆试验指南》(第三版) ( S a mb r o ok 和
Russell 2002)。
大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101感受态细胞
的制备与转化采用氯化钙法, 转化分别采用热激法
和冻融法, 药品的配置及具体操作步骤参考《分子
克隆试验指南》(第三版) (Sambrook和 Russell
2002)。
采用农杆菌介导的花苞浸泡法(Tague 2001)转
化拟南芥, 获得的种子经过 40 mg·L-1潮霉素抗性
筛选, 抗性植株转土培养并进行分子检测与鉴定。
基因组DNA的提取和转基因植株的PCR鉴定
时, 取 50 mg拟南芥 T1代植物的叶片, 置于液氮中
速冻。采用 SDS法提取叶片核基因组DNA, 具体
操作参考Dellaporta等(1983)的方法。取 1 µL提
取的基因组DNA做为模板, 用AtcpSecA::GUS的特
异性引物 PGUS1 (5-TCG CGA TCC AGA CTG
AAT GCC-3)和 SecAF-1 (5-CTC GAG CCC GGG
ATG GTG TCT CCA CTC TGC GAC TCT-3)进行
PCR, 检测拟南芥基因组中外源片段的插入情况。
PCR反应程序: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s,
72 ℃ 60 s, 30个循环; 72 ℃ 10 min。
GUS组织染色参照Blume和Grierson (1997)文
中的方法进行。染色时间为 5 h, 脱色处理后使用
EPSON PERFECTION1260型扫描仪记录结果。
植物材料的总蛋白浓度的测定参考 Bradford
(1976)文中的方法; 采用 Jefferson和Wilson (1991)
文中的方法测定 AtcpSecA::GUS转基因拟南芥的
GUS荧光活性。
检测环境因子对转基因拟南芥中GUS表达影
响时, 将AtcpSecA::GUS转基因拟南芥种子用10%
的安提福明溶液表面消毒后, 均匀铺在1/2MS固体
培养基(30 mg·L-1潮霉素, 0.75%琼脂, pH 5.8)平板
上。萌发生长到 1 周苗龄后进行如下处理。
进行培养基的琼脂浓度变化处理时, 将1周苗龄
的转基因拟南芥幼苗分别转移到琼脂浓度 0.30%、
0.75%和1.00%的1/2MS固体培养基(pH 5.8)上, 在
光周期 16 h光 /8 h暗、光照强度 75 µmol·m-2·s-1
和温度(22±1) ℃的状态下生长48 h后进行GUS组
织化学染色和 GUS荧光活性测定。
持续黑暗处理(dark treatment, DT)时, 将 1周
苗龄的转基因拟南芥幼苗转移到 1/2MS固体培养
基(0.75%琼脂, pH 5.8)上, 持续黑暗 72 h处理后进
行GUS组织化学染色和GUS荧光活性测定。正常
光照下的相同生长状态的转基因幼苗作为对照。
实验结果
1 AtcpSecA::GUS融合基因表达载体的构建
将克隆到的 1 058 bp的拟南芥 AtcpSecA基因
5端上游序列(包含ATG上游653 bp启动子序列和
ATG下游399 bp的编码序列)引入到双元表达载体
pCAMBIA1301的 EcoRI和 NcoI位点之间, 替换
CaMV 35S启动子(见材料与方法)。提取阳性克隆
的DNA, 经EcoRI/NcoI双酶切, 酶切产物通过琼脂
糖凝胶电泳分析, 质粒被EcoRI和NcoI双酶切为 1
植物生理学通讯 第 45卷 第 3期，2009年 3月246
kb和 11 kb的 2条 DNA片段, 与预期结果吻合。
AtcpSecA::GUS融合基因序列经序列测定结果正
确, 将此表达载体命名为 pAtcpSecA::GUS (图 1)。
该载体带有潮霉素筛选标记, 用于转化过程中转基
因植株的筛选。采用冻融法将载体 pAtcpSecA::
GUS转入农杆菌GV3101中, 经卡那霉素、硫酸庆
大霉素和利福平筛选阳性转化子, 再经过菌裂解
PCR及质粒DNA酶切进行鉴定。
图 1 植物表达载体 pAtcpSecA::GUS基本结构示意
Fig.1 Diagram of the vector pAtcpSecA::GUS
TB (L)和 TB (R)分别表示 T-DN A的左、右边界。
2 AtcpSecA::GUS转基因植株的获得
采用农杆菌介导的花苞浸泡法, 以pAtcpSecA::
GUS转化拟南芥, 收获的种子经过潮霉素(40 mg·L-1)
抗性筛选, 抗性植株转土培养, 获得转化植株; 提取
这些转化植株的基因组DNA, 用AtcpSecA::GUS的
特异性引物 PGUS1和 SecAF-1进行 PCR检测, 扩
增产物经琼脂糖凝胶电泳分析, 能够确定外源基因
已经整合到拟南芥基因组中的有 7株。T1代再次
进行抗性筛选和PCR鉴定的结果表明, 外源基因能
够在转基因拟南芥中稳定遗传(图 2)。
图 2 AtcpSecA::GUS转基因拟南芥 T1代植株的 PCR鉴定
Fig.2 Identification of the T1 AtcpSecA::GUS transgenic plants
泳道M: DL2000 Marker; 泳道 1: AtcpSecA::GUS质粒为模版的 PCR的正对照; 泳道 2~8: AtcpSecA::GUS转基因拟南芥 T1代植
株的基因组 DNA为模板的 PCR 产物; 泳道 9: 用野生型拟南芥的基因组 DNA为模版的负对照。
3 AtcpSecA::GUS转基因拟南芥中AtcpSecA表达
的组织以及发育特性
为了研究AtcpSecA在转基因拟南芥中的表达
模式 , 利用 G U S 组织化学染色的方法 , 对
AtcpSecA::GUS转基因拟南芥中GUS报告基因的表
达进行了分析。分别选取 AtcpSecA::GUS转基因
拟南芥的黄化苗、1周苗、2周苗、成熟莲座叶、
花茎以及花苞进行GUS染色。染色结果表明: 在
AtcpSecA::GUS转基因拟南芥的黄化苗时期, 子叶
中有极微弱的GUS活性(图3-a); 在光周期16 h光 /
8 h暗条件下, 转基因拟南芥在子叶、叶片、下胚
轴、莲座叶以及茎生叶等绿色组织中都有很强的
GUS活性(图 3-b~e), 而在根、花瓣和种荚等非绿
色组织中没有 GUS活性(图 3-b~g)。
4 培养基中琼脂浓度对转基因拟南芥中GUS表达
的影响
我们在前期研究中曾发现: 在拟南芥AtcpSecA
基因的T-DNA插入突变体中, 叶片的气孔大多处于
关闭状态(马媛媛2006), 因此推测AtcpSecA基因可
能参与植物体的渗透调节过程。为了研究外界渗
透势变化对AtcpSecA基因的表达的影响, 我们将1
周苗龄的AtcpSecA::GUS转基因拟南芥幼苗分别转
到琼脂浓度为 0.30%、0.75%、1.00%的 1/2MS
培养基上培养 48 h。GUS组织化学染色(图 4-a)和
植物生理学通讯 第 45卷 第 3期，2009年 3月 247
图 3 不同苗龄苗中 AtcpSecA::GUS转基因拟南芥的GUS染色
Fig.3 GUS expression of AtcpSecA::GUS recombinant transgene in the developing transgenic plants
a: 黄化苗; b: 1周苗; c: 2周苗; d: 成熟莲座叶; e: 茎生叶; f: 花苞; g: 种荚; 图 b, c, d中的箭头指示处为根部的GUS染色情况。
图 4 不同浓度琼脂对 AtcpSecA::GUS转基因拟南芥中 AtcpSecA表达的影响
Fig.4 Effects of agar of different concentration on the AtcpSecA::GUS expression in the transgenic seedlings
a: GUS组织化学染色; b: GUS荧光活性。
图 5 暗处理对 AtcpSecA::GUS转基因拟南芥中 AtcpSecA表达的影响
Fig.5 Effect of dark treatment on the AtcpSecA::GUS expression in the transgenic seedlings
a: GUS组织化学染色; b: GUS荧光活性。
植物生理学通讯 第 45卷 第 3期，2009年 3月248
GUS荧光活性测定(图4-b)结果表明: 降低琼脂浓度
至 0.30%,可以明显的抑制 AtcpSecA::GUS转基因
拟南芥中 GUS基因的表达; 而增加琼脂浓度至
1.00%, 对GUS基因的表达影响不大(图 4)。
5 黑暗处理对转基因拟南芥中GUS表达的影响
将1周苗龄的AtcpSecA::GUS转基因拟南芥幼
苗黑暗处理 72 h, 可以观察到拟南芥叶片变黄, 下
胚轴明显伸长, 真叶生长缓慢。GUS组织化学染
色(图 5-a)和荧光活性测定的结果(图 5-b)表明, 暗
处理后转基因拟南芥中的GUS染色明显加深, 这暗
示暗中 AtcpSecA基因的表达显著受到促进(图 5)。
讨　　论
AtcpSecA::GUS转基因拟南芥GUS染色结果
证明我们克隆到的 AtcpSecA基因启动子序列具有
启动子活性, 因此可以采用GUS组织化学染色的方
法, 在转基因拟南芥中研究AtcpSecA基因的表达特
异性。
我们前期工作的研究结果表明, 在拟南芥
AtcpSecA基因的 T-DNA插入突变后, 叶绿体发育
会受阻、内部缺少正常的类囊体片层结构, 叶呈黄
白色(马媛媛 2006)。Voelker等(1997)在玉米中的
研究中也曾提到, SecA的编码基因Tha1突变后, 叶
绿体和叶的正常发育都受到影响。本文中 ,
AtcpSecA::GUS转基因拟南芥的叶片等绿色组织中
都有很强的 G U S 染色, 这些结果进一步说明
AtcpSecA在拟南芥的叶绿体和叶片的正常发育过程
中可能起作用。
光是影响叶绿体生长发育的重要的环境因子
(Apel等 1983; Chinn和 Silverthorne 1993), 本文中
AtcpSecA::GUS转基因拟南芥幼苗经暗处理后,
GUS基因的表达水平明显上调(图5), 表明AtcpSecA
是一个光响应基因, 这暗示AtcpSecA在叶绿体发
育过程中的调控功能可能是通过响应光信号变化而
实现的。
在我们前期研究中曾发现, 拟南芥AtcpSecA突
变体叶上的气孔大多处于关闭状态(马媛媛 2006),
因此我们推测 AtcpSecA基因可能在植物体的渗透
调节过程中也有作用。本文结果又进一步表明, 降
低培养基中的琼脂浓度, AtcpSecA::GUS转基因拟
南芥中GUS基因的表达会受到明显的抑制(图 4),
这暗示 AtcpSecA基因表达可能与植物细胞的渗透
调节有关。
参考文献
马媛媛(2006). 大豆 GmSARK基因的结构与功能分析及拟南芥
两个衰老相关突变体的初步鉴定[博士学位论文] . 天津: 南
开大学
Sambrook J, Russell DW. 黄培堂译(2002). 分子克隆实验指南
(第三版). 北京: 科学出版社
Apel K, Gollmer I, Batschauer A (1983). The light-dependent
control of chloroplast development in barley (Hordeum
vulgare L.). J Cell Biochem, 23 (1-4): 181~189
Berghfer J, Karnauchov I, Herrmann RG, Klsgen RB (1995). Iso-
lation and characterization of a cDNA encoding the SecA
protein from spinach chloroplasts. J Biol Chem, 270:
18341~18346
Blume B, Grierson D (1997). Expression of ACC oxidase pro-
moter-GUS fusions in tomato and Nicotiana plumbaginifolia
regulated by developmental and environmental stimuli. Plant
J, 12: 731~746
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. J Anal Biochem, 72:
248~254
Chinn E, Silverthorne J (1993). Light-dependent chloroplast de-
velopment and expression of a light-harvesting chlorophyll
a/b-binding protein gene in the gymnosperm Ginkgo biloba.
Plant Physiol, 103 (3): 727~732
Chi W, Ma JF, Zhang D, Guo J, Chen F, Lu C, Zhang L (2008).
The pentratricopeptide repeat protein DELAYED GREEN-
ING1 is involved in the regulation of early chloroplast de-
velopment and chloroplast gene expression in Arabidopsis.
Plant Physiol, 147: 573~584
Dellaporta SL, Wood J , Hicks JB (198 3). A plant D NA
minipreparation: version II. Plant Mol Biol Rep, 1 (4): 19~21
Di Cola A, Klostermann E, Robinson C (2005). The complexity
of pathways for protein import into thylakoids: it’s not easy
being green. Biochem Soc Trans, 33: 1024~1027
Duong F, Wickner W (1997) . The SecDFyajC domain of
preprotein translocase controls preprotein movement by
regulating SecA membrane cycling. EMBO J, 16 (16):
4871~4879
Jefferson RA, Wilson KJ (1991). The GUS gene fusion system.
Plant Mol Biol Manual, 14: 1~33
Nakai M, Goto A, Nohara T, Sugita D, Endo T (1994). Identifi-
cation of the SecA protein homolog in pea chloroplasts and
its possible involvement in thylakoidal protein transport. J
Biol Chem, 269: 31338~31341
Tague BW (2001). Germ-line transformation of Arabidopsis
lasiocarpa. Transgenic Res, 10: 259~267
van der Wolk JPW, de Wit JG, Driessen AJM (1997). The cata-
lytic cycle of the Escherichia coli SecA ATPase comprises
two distinct preprotein translocation events. EMBO J, 16
(24): 7297~7304
Voelker R, Mendel-Hartvig J, Barkan A (1997). Transposon-dis-
ruption of a maize nuclear gene, thal, encoding a chloroplast
SecA homologue: in vivo role of cp-Sed in thylakoid protein
targeting. Genetics, 145: 467~478