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山葡萄果实发育过程中花色苷和非花色苷酚成分及其含量的变化



全 文 :植物生理学通讯 第 46 卷 第 1 期,2010 年 1 月8 0
收稿 2009-11-23 修定  2009-12-23
资助 黑龙江省留学归国人员科学基金(LC08 C0 7)。
* 通讯作者(E-mail: junwang1966@yahoo.com.cn; Tel:
0 45 1-82 1 91 82 9)。
山葡萄果实发育过程中花色苷和非花色苷酚成分及其含量的变化
赵权 1,3, 王军 1,2,*, 段长青 2
1 东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040; 2 中国农业大学食品科学与营养工程学院葡
萄与葡萄酒研究中心, 北京 100083; 3 吉林农业科技学院中药学院, 吉林 132101
Changes in Components and Content of Anthocyanin and Non-Anthocyanin
Phenolic Compounds during Fruit Development of Vitis amurensis Rupr.
ZHAO Quan1,3, WANG Jun1,2,*, DUAN Chang-Qing2
1Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University,
Harbin 150040, China; 2Center for Viticulture and Enology, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricul-
tural University, Beijing 100083, China; 3Traditional Chinese Medicine Department, Jilin Agriculturel Science and Technology
College, Jilin 132101, China
提要: 以 ‘双红 ’山葡萄果实为试材, 采用HPLC-MS/MS技术, 分析山葡萄果实发育过程中果皮中花色苷和非花色苷酚成
分及其含量的变化。结果表明, 转色期前果皮内没有花色苷积累, 随着果实的成熟, 花色苷含量逐渐增加, 成熟期的含量最
高;非花色苷酚自花后2周至成熟期间的含量变化呈下降趋势。在山葡萄果实发育过程中检测出花色苷 10种, 其中双糖
苷 5种、单糖苷 5种;非花色苷酚类物质检测到 14种, 其中苯甲酸类 2种、肉桂酸类 3种、黄烷 -3-醇类 2种、黄酮醇类 5
种、白藜芦醇类 2种。
关键词: 山葡萄;果皮;花色苷;非花色苷酚
酚类物质是葡萄浆果中一种次生代谢产物, 对
葡萄浆果和葡萄酒的感官质量有影响, 尤其是对红
葡萄酒的色泽、苦味、收敛性、澄清度和稳定
性等有作用(Picinelli 等2000; Gawel 1998; Hardie和
Considine 1976)。葡萄浆果中含有大量的酚类物
质, 主要分布在果皮、种子和果梗中, 在葡萄酒酿
造过程中这些物质均浸渍到葡萄酒内。葡萄中的
酚类物质主要包括花色苷和非花色苷酚两大类。
葡萄浆果中的花色素作为红葡萄的主要呈色物质,
常与葡萄糖结合, 以糖苷的形式存在于葡萄果皮中
(Barance 等 1996)。非花色苷酚类物质是指除花色
苷以外的酚类物质, 包括苯甲酸类、肉桂酸类、
黄烷 -3- 醇类、黄酮醇类、白藜芦醇类。山葡萄
(Vitis amuremsis Rupr.)原产我国东北、华北及朝
鲜、前苏联远东地区, 是葡萄属中最抗寒的一个
种, 是东北地区酿造葡萄酒的主要原料。目前有关
山葡萄在品种选育(宋润刚等 1999)、抗寒育种(林
兴桂 2007)、人工栽培及酿酒技术(沈玉杰和郭太
君 2000)、果实糖和酸遗传分析(宋润刚等 2007)等
方面的研究报道较多, 但对山葡萄果实发育过程中
花色苷和非花色苷酚成分及其含量变化的研究未见
报导。本文以‘双红’山葡萄果实为试材, 用HPLC-
MS/MS技术测定山葡萄果实发育过程中果皮中花
色苷和非花色苷酚成分及其含量的变化, 并探讨其
变化规律, 以期为确定山葡萄果实的最佳收获期、
提高山葡萄与山葡萄酒质量奠定一定的基础。
材料与方法
山葡萄(Vitis amuremsis Rupr.)品种为 ‘ 双红 ’,
两性花, ‘ 通化 3 号 ’ × ‘ 双庆 ’ ( S h u a ng h o ng ,
hermaphroditic, V. amurensis cv. Tonghua No.3×
Shuangqing)。2008 年 6~9 月采自中国农业科学院
特产研究所国家山葡萄种质资源圃。采样时期分
别为花后 2 周(6 月 19 日)、花后 4 周(7 月 3 日)、
花后 6 周(7 月 17 日)、花后 8 周(7 月 31 日)、转
色期(8 月 12 日)、20% 着色(8 月 20 日)、50% 着
色(8 月 26 日)、100% 着色(9 月 3 日)、成熟(9 月
1 4 日)。测定用的流动相甲醇( H P L C ) 、甲酸
(HPLC)、乙腈(HPLC)和冰醋酸(HPLC)均购于
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Fisher 公司(Fairlawn, NJ, USA), 采用 Milli-Q
(Milipore, Bedford, MA)系统制备的超纯水。标准
样品二甲花翠素 -3-O- 葡萄糖苷(malvidin-3-O-
glucoside)、没食子酸(gallic acid)、儿茶素[(+)-
catechin, C]、咖啡酸(caffeic acid)、白藜芦醇
(trans-resvereerol)、槲皮素(quercetin)均由 Sigma
公司(Chemical Co., St. Louis, USA)购买。仪器有:
KG2200B 型超声波清洗器; RE-52AA 型旋转蒸发
器; SHZ-III 型循环水真空泵。Agilent 1200 系列
LC/MSD离子阱液相色谱-质谱联用仪进行标准物
质以及样品的 LC-UV-MS分析, 包括在线G1379A
真空溶剂脱气机、G1311A四元高压梯度泵、G1313A
自动进样器、G1316A柱温箱、G1315A二极管阵
列检测器(DAD), 所有仪器均由 Agilent 5.3 版本的
化学工作站控制。
提取花色苷时, 将山葡萄皮于液氮中研磨, 冷
冻干燥后称取 2.000 g干葡萄皮粉, 加入 40 mL 1%
盐酸甲醇溶液, 于 30 ℃避光提取 2 h, 离心(4 000
r·min-1, 5 min), 重复提取 5次, 合并提取液, 35 ℃旋
转蒸发至干, 残留物用甲醇定容到 5 mL, 于-40 ℃
下保存待测。
提取非花色苷酚时, 将山葡萄皮于液氮中研磨,
冷冻干燥。称取 5.000 g 干葡萄皮粉, 加入 50 mL
90% (V/V)的丙酮水溶液, 在室温条件下, 水浴摇床
浸提 30 min, 离心(4 000 r·min-1, 5 min), 重复提取 5
次, 合并提取液, 30 ℃旋转蒸发至干, 残留物用甲
醇定容到 5 mL, 于-40 ℃下保存待测。
花色苷高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)仪的色
谱柱采用Zorbax Eclipse SB C-18 (250 mm×4.6 mm,
5 μm粒度色谱柱); 流动相A: 水:甲酸=90:10 (V/V);
流动相 B: 水:甲醇:甲酸 =40:50:10。洗脱程序为:
0~4 min, 6%~15% B (流动相 B); 4~13 min, 15%~
25% B; 13~20 min, 25%~50% B; 20~35 min, 50%~
80% B; 35~40 min, 80%~100% B; 40~45 min, 100%~
6% B; 流速: 1.0 mL·min-1; 柱温: 30 C; 检测波长: 525
nm; 进样量: 10 μL。MSD 参数: 质谱采用电喷雾
离子源(ESI), 正离子模式, 粒子扫描范围: 100~1 500
m·z-1; 雾化器压力为30 psi; 干燥气流速为12 L·min-1;
干燥气温度为 300 ℃。样品 0.45 μm 膜过滤后直
接进样分析, 每样品重复 2 次。用二甲花翠素 -3-
O- 葡萄糖苷的标样制作 9 点标准曲线。花色苷标
准曲线为峰面积=50.5674×浓度(mg·L-1)+6.3822, 相
关系数达 0.9998, 表明标样在 1~500 mg·L-1 内有良
好的线性关系, 可以满足花色苷的定量检测。
测定非花色苷酚用的高效液相色谱 - 质谱
(HPLC-MS)仪的色谱柱采用反相 250 mm×4.6 mm,
5 μm的Zorbax Eclipse SB C-18柱(agilent technologies),
流动相 A: 1.0% 的醋酸水溶液; 流动相 B: 1.0% 醋
酸甲醇溶液; 洗脱程序: 0~15 min, 10%~26% B;
15~30 min, 26%~40% B; 30~50 min, 40%~65% B;
50~60 min, 65%~95% B; 60~63 min, 95%~10% B;
63~66 min, 10% B isocratic; 流速: 1.0 mL·min-1; 柱温:
25 ℃; 检测波长: 280 nm; 进样量: 10 μL。MSD 参
数: 离子源为 ESI, 采用负离子模式; 雾化气压力为
30 psi; 干燥气流速为 10 mL·min-1; 干燥气温度为
325 ℃; 离子扫描范围为 100~1 500 m·z-1。CID 的
MS/MS 诱导碰撞能量为 1.0 V。
配制 8个浓度水平的 5种混标, 每个水平重复
3次, 以各组分的平均峰面积对浓度(mg·L-1)在工作
站中建立标准曲线。苯甲酸类采用没食子酸为标
准品, 标准曲线为峰面积 =6.04767× 浓度(mg·L-1)+
37.6951, 相关系数为0.99837; 肉桂酸类采用咖啡酸
为标准品, 标准曲线为峰面积 =6.94488× 浓度
(mg·L-1)+24.3721, 相关系数为 0.99875; 黄酮醇类采
用槲皮素为标准品, 标准曲线为峰面积=3.230747×
浓度(mg·L-1)+9.9427, 相关系数为 0.99885; 黄烷 -3-
醇类采用儿茶素为标准品, 标准曲线为峰面积 =
1.15779×浓度(mg·L-1)+4.85762, 相关系数为0.99878;
白藜芦醇类采用白藜芦醇为标准品, 标准曲线为峰
面积=9.97568×浓度(mg·L-1)+17.0442, 相关系数为
0.99876。5 种标准非花色苷酚类化合物在相应的
线性范围内相关系数均在 0.998 以上, 说明线性良
好, 可以满足定量的需要。
结果与讨论
1 花色苷种类及含量的变化
1.1 总花色苷的含量变化 葡萄与葡萄酒中的花色
苷种类很多, 但是可以利用的商业标样很少。目
前, 国际上对花色苷定性的方法主要是根据花色苷
的质谱信息对其进行进行鉴定。花色苷的定量分
析则主要是用二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷进行相对
定量分析, 即其他花色苷都用这一种花色苷定量。
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(Heier等2002; Han等2008; He等2006; Alcalde-Eon
等2006; García-Beneytez等2002)。应用HPLC-MS/
MS技术, 从山葡萄果皮中鉴定出10种花色苷, 分别
为花翠素 -3-O- 葡萄糖苷、花翠素 -3,5-O- 双葡萄
糖苷、花青素 -3,5-O- 双葡萄糖苷、甲基花翠素 -
3-O- 葡萄糖苷、甲基花翠素 -3,5-O- 双葡萄糖苷、
甲基花青素 -3-O- 葡萄糖苷、甲基花青素 -3,5-O-
双葡萄糖苷、甲基花青素 -3-O- 葡萄糖苷 - 丙酮
酸、二甲花翠素 -3,5-O- 双葡萄糖苷、二甲花翠
素 -3-O- 葡萄糖苷 - 乙醛。由图 1 可知, 从花后 2
周到花后 8 周未检测到花色苷类物质, 从花后 8周
开始有花色苷类物质积累, 但含量上升缓慢, 变化
不大;从果实 20% 着色起其含量开始急剧上升,
一直持续到果实成熟, 且在果实成熟期花色苷类物
质的含量最高达到 11.351 mg·g-1 (DW)。果实成
熟期双糖苷 5 种, 含量为 8.979 mg·g-1 (DW), 占总
花色苷的 79.09%, 单糖苷 5 种, 含量为 2.372 mg·g-1
(DW), 占总花色苷的 20.91%。
图 1 山葡萄果实发育过程中总花色苷含量的变化
1.2 不同种类花色苷含量变化 葡萄中的花色苷主
要是花翠素( D p ) 、花青素( C y ) 、甲基花翠素
(Pt)、甲基花青素(Pn)、二甲花翠素(Mv)的单糖
苷、双糖苷和酰化糖苷。花色素通过糖苷化、酰
化和甲基化形成聚合花色苷( 唐传核和杨晓泉
2003)。山葡萄果实发育过程 5 类花色苷的含量变
化见图 2 。
在果实整个发育过程中, 花翠素类物质检测到
2 种, 分别为花翠素 -3-O- 葡萄糖苷和花翠素 -3,5-
O-双葡萄糖苷。在果实50%着色时检测到花翠素-
图 2 山葡萄果实发育过程中不同种类花色苷含量变化
Dp: delphinidin, 花翠素; Cy: cyanidin, 花青素; Pt: petunidin, 甲基花翠素; Pn: peonidin, 甲基花青素; Mv: malvidin, 二甲花翠素。
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3,5-O-双葡萄糖苷, 含量为0.141 mg·g-1 (DW); 100%
着色时检测到花翠素 -3-O- 葡萄糖苷, 其含量为
1.273 mg·g-1 (DW)。在果实成熟时, 花翠素类物质
达到2.052 mg·g-1 (DW), 占果皮总花色苷的18.62%。
花青素类物质检测到1种, 为花青素-3,5-O-双葡萄
糖苷。花后 2 周至 20% 着色, 没有花青素的积累,
在 50% 着色时花青素的含量为 0.111 mg·g-1 (DW),
随着果实的成熟, 100%着色时含量最高达到0.482
mg·g-1 (DW), 而后含量呈下降的趋势, 至成熟时含
量降低到 0.317 mg·g-1 (DW), 占果皮总花色苷的
4.23%。甲基花翠素类物质共检测到 2 种, 分别为
甲基花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷和甲基花翠素-3-O-
葡萄糖苷。在果实 100% 着色时检测到甲基花翠
素 -3,5-O- 双葡萄糖苷, 含量为 1.194 mg·g-1 (DW),
甲基花翠素 -3-O- 葡萄糖苷含量为 0.465 mg·g-1
(DW)。果实成熟时, 甲基花翠素类物质含量达
1.763 mg·g-1 (DW), 占果皮总花色苷的 15.51%。甲
基花青素类物质检测到3种, 分别为甲基花青素-3-
O- 葡萄糖苷、甲基花青素 -3,5-O- 双葡萄糖苷和
甲基花青素 -3-O-葡萄糖苷 -丙酮酸。果实 50%着
色时, 检测到甲基花青素 -3,5-O-双葡萄糖苷, 含量
达 0.504 mg·g-1 (DW)。甲基花青素 -3-O- 葡萄糖
苷和甲基花青素 -3-O- 葡萄糖苷 - 丙酮酸在果实
100% 着色时被检测到, 含量分别为 0.051 mg·g-1
(DW)和 0.001 mg·g-1 (DW)。成熟期甲基花青素类
物质含量为 0.873 mg·g-1 (DW), 占果皮总花色苷的
7.66%。二甲花翠素类物质检测到 2 种, 分别为二
甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-葡
萄糖苷 - 乙醛。在果实 50% 着色, 检测到二甲花
翠素 -3,5-O- 双葡萄糖苷, 其含量为 1.813 mg·g-1
(DW)。果实成熟时, 检测到二甲花翠素 -3-O- 葡
萄糖苷 - 乙醛, 含量为 0.029 mg·g-1 (DW)。成熟期
二甲花翠素类物质含量为 6.875 mg·g-1 (DW), 占果
皮总花色苷的 60.53%, 在 5 类花色苷中含量最高。
2 非花色苷酚种类及含量变化
将葡萄果皮中所含的非花色苷酚类物质分为5
大类, 即苯甲酸类、肉桂酸类、黄烷 -3 - 醇类、
黄酮醇类和白藜芦醇类。非花色苷酚类物质主要
是用质谱定性, 根据 HPLC-MS/MS 定量分析结果,
归类计算含量(Pérez-Magarińo等 1999; La Torre等
2006)。
2.1 总非花色苷酚含量的变化 非花色苷酚类物质
总含量在果实整个发育过程中呈现下降趋势(图
3)。花后 2 周到花后 4 周含量急剧下降, 由 3.771
mg·g-1 (DW)下降到 0.772 mg·g-1 (DW)。花后 4 周
到花后 8 周下降较缓, 花后 8周到转色期出现缓慢
的上升趋势, 然后平缓下降至成熟, 含量为 0.413
mg·g-1 (DW)。
图 3 山葡萄果实发育过程中总非花色苷酚含量的变化
2.2 苯甲酸类含量的变化 苯甲酸类物质在果实整
个发育过程中的变化趋势见图 4。从花后2周至花
后6周未检测到苯甲酸类物质, 花后8周检测到对-
羟基苯甲酸、鞣花酸 2 种物质, 总含量达到 0.018
mg·g-1 (DW)。而从转色期到果实完全成熟只检测
到鞣花酸而未检测到对 -羟基苯甲酸。从花后8周
到 50% 着色其含量又缓慢下降, 含量下降到 0.008
mg·g-1 (DW), 而后又急剧上升, 在果实 100% 着色
时, 含量达到最大值 0.021 mg·g-1 (DW)。随着果
实的成熟含量又急剧下降, 果实完全成熟时, 含量
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图 4 山葡萄果实发育过程中苯甲酸类含量的变化
图 5 山葡萄果实发育过程中肉桂酸类含量的变化
达到 0.016 mg·g-1 (DW)。
2.3 肉桂酸类含量的变化 肉桂酸类物质的含量在
果实整个发育过程中呈现下降趋势(图 5)。花后 2
周到成熟 9 个时期均检测到反式 - 阿魏酰酒石酸、
反式 - 肉桂酸、反式 - 单咖啡酰酒石酸 3 种物质。
花后 2 周含量最高达 2.681 mg·g-1 (DW), 从花后 2
周至花后 4 周, 其含量急剧下降到 0.558 mg·g- 1
(DW)。从花后 8周至 50%着色呈现略微上升的变
化趋势, 而后又平缓下降, 成熟时含量达到 0.088
mg·g-1 (DW)。肉桂酸类物质的含量变化与非花色
苷酚的总含量变化规律基本上一致。
2.4 黄烷 -3-醇类含量的变化 葡萄果实中儿茶素、
表儿茶素等在内的黄烷-3-醇类物质主要存在于葡
萄果皮和种子中, 对葡萄酒的颜色、苦味和收敛感
等感官特性起作用(Adams 2006)。黄烷 -3- 醇类物
质的含量在果实整个发育过程中呈现先上升后下降
的变化趋势(图 6)。在果实整个发育过程中均检测
到儿茶素, 而表儿茶素在花后 8周才检测到。花后
2 周至转色期含量呈上升的趋势, 在转色期其含量
达到最大值 0.451 mg·g-1 (DW)。而后含量急剧下
降, 在果实完全成熟时, 含量达到最小值 0.082 mg·g-1
(DW )。
2.5 黄酮醇类含量的变化 黄酮醇类物质的含量在
果实发育过程中变化较大(图 7)。九个时期共检测
到槲皮苷、槲皮素 3-O- 葡萄糖苷、反式 - 杨梅酮
3-O- 葡萄糖苷、槲皮素 3-O- 半乳糖苷、槲皮素
3-O- 葡萄糖苷酸 5 种物质。花后 2 周黄酮醇类含
量最高为0.905 mg·g-1 (DW), 随后含量急剧下降, 从
花后 4 周到花后 6周含量又上升, 而后变化幅度较
小, 果实完全成熟时含量为 0.142 mg·g-1 (DW)。
2.6 白藜芦醇类含量的变化 白藜芦醇类物质的含
量在果实整个成熟过程中呈现上升趋势(图 8)。花
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图 6 山葡萄果实发育过程中黄烷 -3-醇类含量的变化
图 7 山葡萄果实发育过程中黄酮醇类含量的变化
图 8 山葡萄果实发育过程中白藜芦醇类含量的变化
后 2 周至花后 8 周未检测到白藜芦醇类物质。转
色期含量为 0.015 mg·g-1 (DW), 从转色期到果实
50% 着色, 上升趋势较缓, 果实 50% 着色到 100%
着色含量急剧上升, 在果实完全成熟时含量达到最
大值, 为 0.082 mg·g-1 (DW)。
采用 HPLC-MS/MS 技术, 分析山葡萄果实发
育过程中花色苷和非花色苷酚成分及其含量变化的
结果表明, 转色期前果皮内没有花色苷积累, 随着
果实的成熟, 花色苷含量逐渐增加, 成熟期的含量
最高; 非花色苷酚自花后2周至成熟期间的含量变
化呈下降趋势。在山葡萄果实发育过程中检测出
花色苷 10 种, 其中双糖苷 5 种、单糖苷 5 种;非
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花色苷酚类物质检测到 14种, 其中苯甲酸类 2种、
肉桂酸类 3种、黄烷 -3- 醇类 2种、黄酮醇类 5种、
白藜芦醇类 2 种。
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