全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 10期，2009年 10月 991
收稿 2009-08-29 修定 　2009-09-15
资助 国家自然基金项目(30 9 70 2 4 7)、湖南省高等学校科学
研究重点项目(09 A0 3 7)、作物种质创新与资源利用国
家重点实验室培育基地开放重点项目和湖南农业大学稳
定人才基金(0 7 WD 1 4 )。
* 通讯作者(E-mail: ltxiao@hunau.net; Tel: 0731-84635260)。
拟南芥复制因子C亚基 3在黄化苗下胚轴伸长生长中的作用
夏石头 1, 匡勇 2, 萧浪涛 1,*
湖南农业大学 1湖南省植物激素与生长发育重点实验室, 2科学技术处, 长沙 410128
提要: 拟南芥遮光培养 2.5 d时, rfc3-1突变体黄化幼苗的下胚轴平均长度约比野生型植株黄化幼苗的下胚轴长27.5%。观
察表明, 相对于野生型复制因子 C亚基 3 (replication factor C3, AtRFC3)基因突变体的下胚轴表皮细胞, 特别是上部靠近子
叶部分的表皮细胞, 单细胞长度变长。将野生型RFC3基因转染到 rfc3-1后, 突变体恢复野生型表型, 进一步说明RFC3在
黄化苗的下胚轴伸长生长中有作用。
关键词: 拟南芥; RFC3; 黄化苗; 下胚轴; 伸长生长
Arabidopsis Replication Factor C Subunit 3 Plays a Role in Hypocotyl Elonga-
tion of Etiolated Seedling
XIA Shi-Tou1, KUANG Yong2, XIAO Lang-Tao1,*
1Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development, 2Science and Technology Agency, Hunan Agricul-
tural University, Changsha 410128, China
Abstract: The average length of etiolated hypocotyl of rfc3-1 mutant was about 27.5% longer than that of the
wild type plants under dark culture conditions for 2.5 days. The main reason is that mutation in RFC3 (replication
factor C3) causes the length of single epidermal cell, especially the epidermal cell close to cotyledon becoming
longer than that of the wild type. Transformation of wild type AtRFC3 gene into rfc3 mutant rescued the mutant
phenotypes, suggesting that RFC3 plays a role in hypocotyl elongation of etiolated seedlings in Arabidopsis
thaliana.
Key words: Arabidopsis thaliana; RFC3; etiolated seedling; hypocotyl; elongation
复制因子 C (replication factor C, RFC)最初是
从人类 Hela 细胞提取物中纯化的, 是猿病毒 40
(simian virus 40, SV40) DNA体外复制的必需因子
(Tsurimoto和 Stillman 1989; Chen等 1992)。人类
复制因子C (human replication factor C, hRFC), 又称
激活子 1 (activator 1), 是一个多聚引物识别蛋白,
包括复制因子 C1 (RFC1)、复制因子 C2 (RFC2)、
复制因子 C3 (RFC3)、复制因子 C4 (RFC4)和复
制因子 C5 (RFC5) 5个独特亚基, 它们的分子量分
别为 145、40、38、37和 36.5 kDa (Tsurimoto
和 Stillman 1989; Chen等 1992; Okumura等 1995)。
1992年, 人类复制因子 C在酵母(Saccharomyces
cerecvisiae)中的功能类似物也已鉴定出来, 称为酵
母复制因子 C的 5个亚基(Fien和 Stillman 1992)。
一系列的研究结果(Luckow等 1994; Noskov等
1994; Gray和MacNeill 2000)表明, 复制因子C的５
个亚基, 包括 1个大亚基(RFC140/RFC1)和 4个小
亚基(RFC37/RFC2、RFC36/RFC3、 RFC40/RFC4
和 RFC38/RFC5), 在真核生物中普遍存在。
在DNA复制中, RFC复合物是增殖细胞核抗
原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的装配
器, 优先选择结合附着在模板上的DNA引物 3末
端(Tsurimoto和 Stillman 1990, 1991), 是结构特异
性DNA结合蛋白并对DNA多聚酶δ和 ε起着引物
识别因子的作用(Lee和Hurwitz 1990; Lee等1991)。
RFC在ATP存在的条件下将PCNA和DNA多聚酶
δ (Polδ)或 ε (Polε)装配到附有引物的模板上。附
有引物的DNA-RFC-PCNA-DNA多聚酶δ (或Polε)
复合物在有脱氧核糖核苷酸(dNTPs)存在的条件下
通过人类单链DNA结合蛋白(human single-stranded
DNA binding protein, hSSB)的作用而有效的延伸了
DNA复制链。
在动物系统中, RFC复合物在DNA复制和修
复以及细胞增生中的功能也逐渐被认识(Green等
植物生理学通讯 第 45卷 第 10期，2009年 10月992
2000; Mayer等 2001)。而植物中有关 RFC的研究
进展缓慢, 直到 2003年, Furukawa等(2003)才通
过同系物克隆在水稻中成功分离了OsRFC的 5个
亚基: OsRFC1、OsRFC2、 OsRFC3、OsRFC4和
OsRFC5, 分析了其分子特性和表达部位。但由于
未能得到相应的突变体植株, 难以进行RFC的功能
研究。原因可能是 RFC是DNA复制的必需因子,
其编码基因突变很可能会导致植株死亡。我们在
对拟南芥复制因子C亚基1编码基因的3个T-DNA
插入突变株系 rfc1-1、rfc1-2和 rfc1-3的研究(Xia
等 2007)中, 发现T-DNA在复制因子C亚基 1编码
基因外显子中的插入突变会引起胚胎发育异常, 并
导致胚胎和种子败育, 说明复制因子C亚基 1在拟
南芥胚胎发生中起作用。为了探讨拟南芥复制因
子C的其他 4个亚基是否具有类似功能, 继续进行
了深入的研究。通过EMS诱变获得了拟南芥复制
因子C亚基3编码基因的点突变体并命名为rfc3-1
(Xia等 2009)。与复制因子C亚基 1编码基因突变
体 rfc1-1、rfc1-2和 rfc1-3不同, rfc3-1叶型狭长,
生长发育受到的影响更明显。本文以 rfc3-1突变
体纯合子植株和野生型植株黄化幼苗为材料, 研究
RFC3在植株下胚轴生长发育中的作用。
材料与方法
取拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)哥伦比亚生
态型(Columbia, Col)种子用20 mmol·L-1甲基磺酸乙
酯(ethylmethane sulphonate, EMS)处理18 h, 取适量
处理后种子, 加经高温灭菌的0.1%琼脂糖溶液, 混
匀后置于 4 ℃冰箱中低温处理 4~5 d。将种子均
匀播于 18孔塑料栽培盘的培养土上, 在 16 h光照
(光照强度为 90 μmol·m-2·s-1, 温度为 23 ℃) / 8 h黑
暗 (21 ℃) 光照培养箱培养条件下培养幼苗和筛选
突变体。
在筛选突变体时, 发现一个个体小且叶片狭长
的突变体, 编号为 870。当 870植株长至 3片真叶
时, 将其移栽至新的培养钵中, 25 d后植株开始开
花结实, 40 d后收集种子。然后将种子置于室温
下风干 10 d, 再按照上述方法播种和幼苗培养, 观
察记录了后代分离情况, 并将突变体870与野生型
植株进行回交试验。在对突变基因进行物理定位
和克隆后, 命名此突变体为 rfc3-1, 并设计了特异
性引物对(5 tatggtcctcccggtactca 3和 5 cactcct-
ggacgaatatgtc 3)用来检测rfc3-1突变体纯合子植株
(Xia等 2007, 2009)。
分别取适量 rfc3-1突变体纯合子和生态型野
生型拟南芥种子表面消毒(Xia等2007)。用记号笔
将具氨苄抗性(Amp+)的圆形MS培养板划分成两
半, 其中一半播种 rfc3-1突变体, 另一半播种野生
型拟南芥种子, 作好标记, 然后用石蜡封口膜密封
培养板, 放入4 ℃冰柜中低温处理2~3 d。MS-Amp+
培养基配方为 4.4 g·L-1 MS+0.5%蔗糖 +0.8%琼脂,
Amp浓度为 100 mg·mL-1, pH为 5.6~5.8。
黄化幼苗培养试验参照Ullah等(2003)和Chen
等(2003)的方法, 将低温处理后的培养板放入培养
箱内, 16 h光照(23 ℃) /8 h黑暗(21 ℃)条件下发芽
1 d后, 用锡箔纸包裹整个培养板, 遮光培养 2.5 d
后揭去锡箔纸, 并从每个培养板取突变体和野生型
黄化苗各 10株, 作好标记, 快速测量黄化幼苗下胚
轴的长度, 共测 10个培养板。
将黄化幼苗浸泡在水合氯醛 /甘油 /水溶液(8:
1:2, W/V/V) (Ohad等 1996)中 1 d以上, 以清除细胞
内组织, 然后使用 ZEISS:Axiovert 200 M显微镜观
测黄化幼苗下胚轴表皮细胞, Axiocam HRM数码
相机照相, AxioVision 4.2 Rel软件进行细胞长度测
量。同时, 选取大小、长势和长相都具有代表性
的 rfc3-1突变体和Col野生型黄化幼苗各 2株用解
剖显微镜照相(Olympus SZH解剖显微镜和Olympus
DP12数码照相机)。以上试验均重复 3次。
用 PhusionTM高保真酶(high-fidelity PCR mas-
ter mix, NEB公司)和基因特异引物 5 cgcggatcc-
cgtcctgcaaatgctgatga 3和 5 cggggtaccacatggctg-
gaccagcagag 3从拟南芥 Col野生型基因组中扩增
出 RFC3的全序列(约 4.9 kb), 琼脂糖凝胶电泳检
测后用QIA凝胶DNA回收试剂盒(QIAGEN公司)
回收扩增产物, 在 22 ℃下用 KpnI和 BamHI双酶
切PCR产物, 用无水乙醇低温沉淀, 以70%乙醇洗
涤沉淀后将其溶解在 0.1×TE溶液中, 最后将基因
片段与用同样双酶切的pG229载体(该载体带有在
微生物中的Kan+抗性标记和植物中的Baster抗性
标记)回收片段连接, 构建成遗传互补重组质粒。
经过测序验证正确的野生型 RFC3基因阳性克隆,
以农杆菌介导花器浸渍遗传转化法转染到突变体
植株中, 以获得 rfc3-1突变体遗传互补植株。然
后将完全互补植株(rfc3-1/rfc3-1::RFC3)与野生型
植株种子按照前文所述方法播种在MS-Amp+培养
板进行黄化幼苗的培养, 并测量黄化幼苗下胚轴的
长度。
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结果与讨论
1 rfc3-1突变体的筛选
经 EMS诱变而得到突变体 rfc3-1, 个体小, 且
叶片狭长。在与哥伦比亚野生型植株回交后, 其回
交后代(F2)发生性状分离, 在总共获得的 173株后
代中, 野生型表型 131株, 突变体 42株, 野生型表
型 /突变体表型的理论比率为 3:1 (χ2=0.05, P>0.05)。
特异引物PCR结果表明, 42株突变体植物都含有突
变基因, 进一步证明 rfc3-1突变体是一个由单基因
控制的隐性突变体。
2 RFC3基因突变对拟南芥黄化幼苗下胚轴伸长生
长的影响
黄化幼苗下胚轴是指由子叶着生点到胚根的
一段组织, 其生长情况直接反映了植株的生长状
况。遮光培养 2.5 d后, 突变体和野生型黄化幼苗
生长差异明显。由图 1可以看出, rfc3-1突变体纯
合子植株黄化幼苗不仅比野生型植株黄化幼苗稍
高, 并且在遮光培养 2.5 d后, rfc3-1突变体纯合子
植株黄化幼苗的子叶弯钩已处于半开状态, 而此时
野生型植株黄化幼苗的子叶弯钩仍然紧密闭合。
为了量化两者之间的差异, 测定了培养板上遮光培
养 2.5 d的 rfc3-1突变体和野生型黄化幼苗各 100
株。结果显示, rfc3-1突变体黄化苗下胚轴的长度
为(5.113±0.089) mm, 而相应野生型黄化苗下胚轴
的长度为(4.005±0.153) mm, rfc3-1突变体黄化苗
下胚轴平均长度比野生型植株黄化幼苗下胚轴的长
1.1 mm (图 2), 暗示 RFC3基因突变对拟南芥黄化
幼苗下胚轴的生长具有重要影响。
3 RFC3基因突变对拟南芥黄化幼苗下胚轴表皮细
胞生长的影响
为了进一步研究引起 rfc3-1突变体黄化苗下
胚轴变长的内部原因, 在以水合氯醛/甘油/水溶液
清除黄化幼苗细胞内组织后, 观测了从根部开始到
下胚轴子叶接合部的下胚轴表皮细胞。结果表明,
rfc3-1突变体纯合子植株黄化幼苗下胚轴表皮细胞
数目并不比野生型植株的更多, 甚至还少了2~5个
细胞, 但单个细胞长度大于野生型植株, 特别是下
胚轴上部靠近子叶的部分更是如此(图 3)。这表明
rfc3-1突变体黄化苗下胚轴变长的主要原因可能是
突变体黄化苗下胚轴的细胞长度和体积变大, 是基
因突变影响细胞的增生并导致单个细胞体积增大的
结果。
4 野生型AtRFC基因对rfc3-1突变性状的遗传互补
用PhusionTM高保真酶(NEB公司)和基因特异
图 2 rfc3-1突变体、野生型和互补植株
黄化幼苗的下胚轴长度比较
Fig.2 Length comparison of etiolated hypocotyl of
rfc3-1 mutant, wild type, and genetically
complementary plant
rfc3-1/rfc3-1::RFC3为 rfc3-1突变体的遗传互补植株。图
中数值为至少 30 株暗培养 2.5 d的 rfc3-1、互补植株或野生型
植物黄化幼苗下胚轴长度的平均值。试验重复 3 次。
引物扩增野生型 R F C 3 基因及其启动子序列
(genomic DNA, 约 4.9 kb), 回收扩增片段并将其重
组到 Basta筛选标记的 pG229重组质粒中, 并将重
组质粒转染入 rfc3-1突变体。遗传互补植株(rfc3-
1/rfc3-1::RFC3)经过特异引物 PCR检测验证(另文
发表)后, 将互补植株与野生型植株种子播在同一培
图 1 rfc3-1突变体与野生型植株黄化幼苗
Fig.1 The etiolated seedlings of rfc3-1
mutant and wild type plant
图中为黑暗培养 2.5 d的典型的 rfc3-1和野生型植物黄化幼苗
解剖显微照片。wt: 野生型植物; rfc3-1: 突变体纯合子, 下图同此。
植物生理学通讯 第 45卷 第 10期，2009年 10月994
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化幼苗下胚轴的长度与野生型植株的相似(图2), 说
明野生型RFC3基因完全能够互补rfc3-1突变体纯
合子的遗传表型。r f c3 -1 的突变遗传表型是由
RFC3基因的点突变所引起的, 说明RFC3在下胚轴
伸长生长中有作用。遮光培养 2.5 d的 rfc3-1黄化
苗下胚轴变长的主要原因可能是 RFC基因突变造
成 rfc3-1突变体纯合子植株黄化幼苗下胚轴表皮细
胞长度大于野生型植株下胚轴表皮细胞长度, 但其
具体作用机制尚待进一步研究。
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图 3 rfc3-1突变体与野生型植株黄化幼苗
下胚轴表皮细胞特征比较
Fig.3 Epidermal cell comparison of etiolated hypocotyl in
rfc3-1 mutant and wild type plant
试验检测了 20株 rfc3-1或野生型植株黄化幼苗超过 400个
表皮细胞的长度, 图中各数值为 20个表皮细胞长度的平均值, 试
验重复 3 次。