全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (8): 821~827 821
收稿 2012-04-24　　修定 2012-06-25
资助 昆明学院引进人才项目(YJL11024)、公益性行业(农业)科
研专项经费项目(201003021)和NSFC项目(31160067)、云
南省引进高端人才项目(2010CI069)。
致谢 云南大学谭德勇教授在芯片制作中给予指导和帮助。
* 通讯作者(E-mail: czquan-99@163.com; Tel: 0871-
5140200)。
疣粒野生稻应答黄单胞杆菌水稻致病变种(Xoo)的基因芯片
罗玉1,3, 陈善娜3, 伍文婷2, 吕广磊2, 蒋春苗2, 程在全2,*
1昆明学院生命科学与技术系, 昆明650214; 2云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 昆明650223; 3云南大学生命科
学院, 昆明650092
摘要: 探讨疣粒野生稻应答黄单胞杆菌水稻致病变种(Xoo)的基因芯片制作, 通过芯片杂交筛选抗病相关基因。芯片含有2
436个片段, 来自于应答Xoo的疣粒野生稻差减文库和cDNA文库, 通过芯片杂交及微阵列分析基因表达, 选其中800个样品
点测序比对。其中, 35个无同源序列, 大部分有同源序列的功能未知, 已知功能的序列中明显上调表达的基因有: 富含脯氨
酸蛋白、泛素连接酶、伸展蛋白、谷胱甘肽S-转移酶II、脂类转移酶等, 明显下调表达的基因有: 细胞色素P450单加氧
酶、醛缩酶、金属硫蛋白、硫氧还蛋白、热激蛋白等, 表达无明显变化的基因有: 抗坏血酸过氧化物酶、转铜伴侣、脂酶、
花丝温敏H2A蛋白等。高通量基因芯片的利用及微阵列分析是筛选抗病相关基因、获取大量抗病相关信息的有效手段。
关键词: 芯片制备; 疣粒野生稻; 微阵列; 基因表达; 黄单胞杆菌水稻致病变种
Gene Chip of Oryza granulata Responsing to Xanthomonas oryzae pv. oryzae
(Xoo)
LUO Yu1,3, CHEN Shan-Na3, WU Wen-Ting2, LÜ Guang-Lei2, JIANG Chun-Miao2, CHENG Zai-Quan2,*
1Department of Life Science and Technology, Kunming University, Kunming 650214, China; 2Institute of Biotechnology & Genetic
Germplasm, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China; 3School of Life Sciences, Yunnan University,
Kunming 650092, China
Abstract: The manufacture of Oryza granulata gene chip responsing to Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)
was discussed. Disease resistance genes were screened by chip hybridization. cDNA microarrays containing 2
436 cDNA clones of O. granulata derived from suppression subtractive library and cDNA library were con-
structed. Using chip hybridization, gene expression patterns after inoculating Xoo were investigated. Approxi-
mately 800 clones were sequenced and BLAST searches were carried out. There are no homologous sequences
for 35 clones of them. The functions of the homologous sequences for most clones are unknown. Among the
genes of known function, significantly up-regulated genes were as follows: proline-rich protein, ubiquitin li-
gase, extended protein, glutathione S-transferase II, lipid transfer enzymes and so on. Significantly down-regu-
lated genes were cytochrome P450 monooxygenase, aldolase, metallothionein, thioredoxin, heat-shock protein
and so on. The genes of no significant changes were ascorbate peroxidase, copper chaperone, lipase, filament
sensitive protein H2A and so on. The use of high-throughput gene chip and microarray analysis is an effective
means to screen disease-related genes and get disease-related information.
Key words: gene chip manufacturing; Oryza granulata; microarray; gene expression; Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (Xoo)
野生稻保留了许多栽培稻已丢失的抗逆、抗
病虫害、特殊育性、广适性等优良基因, 是稻种
起源及演化研究的宝贵资源, 也是栽培稻育种克
服遗传基础狭窄的重要材料。疣粒野生稻是稻属
中唯一旱生的类群Padia组植物, 分布于东南亚国
家, 在中国只有云南省和海南省有分布(钱韦等
2001)。水稻白叶枯病的病原菌是黄单胞杆菌水稻
致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo), 疣
粒野生稻是其寄主之一。疣粒野生稻中含有抗白
叶枯病基因, 高抗白叶枯病(章琦等1994; 何光存等
1998; 朱永生等2004)。疣粒野生稻属GG基因组,
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学报822
与AA基因组的栽培稻亲缘关系远, 自然条件下很
难杂交, 个别杂交成活例子也是高度不育(黄艳兰
等2000), 难以通过常规杂交育种将疣粒野生稻中
的基因转入栽培稻。基因芯片技术已被应用于抗
病抗逆研究, 用微阵列技术分析基因表达谱, 能提
供大量信息, 有助于阐明防御应答网络, 可分析评
价多种防御途径之间的交流, 有利于对抗病机制
的了解和抗病候选基因的筛选。我们希望利用芯
片技术从疣粒野生稻中发掘、筛选出白叶枯病抗
性相关基因, 为水稻白叶枯病抗性育种提供新资
源。用微阵列技术分析栽培稻应答Xoo基因表达
谱已有文献报道(Kottapalli等2007; Li等2006;
Zhou等2002)。疣粒野生稻基因组大小为1 201
Mb, 约为栽培稻的2.7倍(Uozu等1997), 因此用水
稻芯片分析筛选不到疣粒野生稻特有的一些基
因。许多微阵列分析采用的是商品化的模式植物
芯片, 如水稻、拟南芥、番茄等模式植物的商品
化基因芯片已有出售, 而疣粒野生稻资源稀缺, 尚
未见其商品化的芯片出售。本文以高抗白叶枯病
的疣粒野生稻为材料, 以文库质粒为样品, 制作了
疣粒野生稻应答Xoo基因芯片, 通过芯片杂交及微
阵列分析, 筛选出系列白叶枯病抗性相关基因, 以
期为疣粒野生稻优良基因的发掘和利用提供帮助,
从而为探究疣粒野生稻抗白叶枯病机制奠定基
础。
材料与方法
1 材料
疣粒野生稻(Oryza granulata)植株采于云南景
洪曼丢, 于温室中培养繁殖。黄单胞杆菌水稻致
病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)菌种
C1为中国强致病生理小种, Y8为云南强致病生理
小种。疣粒野生稻应答Xoo的差减文库是以疣粒
野生稻叶片为材料, 用活化的C1和Y8菌株剪叶接
种孕穗期的疣粒野生稻叶片 , 接种后24、48、
72、96、120 h等量取材。以接种病原菌作为差减
杂交的试验方, 以接种蒸馏水作为驱动方, 构建的
差减文库含744个质粒, 平均插入片段500 bp。疣
粒野生稻应答Xoo的均一化cDNA文库包含正常情
况下和Xoo刺激下叶片中表达的cDNA。质粒插入
片段多在1 000 bp以上。
2 方法
2.1 芯片制备
2.1.1 样品的准备 微阵列芯片的样品DNA来自于
疣粒野生稻应答Xoo的均一化cDNA文库和差减文
库。用碱裂解法提取均一化后的cDNA文库质粒
1 692个, 编号1~1 692; 提取差减文库质粒共744个,
编号1 693~2 436。内参选择疣粒野生稻的看家基
因β-actin, 用RT-PCR扩增出β-actin, 作为阳性对
照。阳性对照8个, 编号2 437~2 444; 阴性对照
(20×SSC, 成分为88.2 g·L-1柠檬酸钠和175.3 g·L-1氯
化钠) 8个, 编号2 445~2 452。用SSC调整质粒及对
照溶液, 使盐离子终浓度为3 mol·L-1。按顺序上样
于384孔板上。
2.1.2 矩阵设计与点样 用英国RioRobotics公司的
MicroGrid II生物芯片点样仪点样, 一张芯片上点
完, 有2个大的矩阵; 32个小矩阵, 片基用的是美国
Erie Scientific公司的Superfrost Plus glass slides。选
用实心针, 4×4排列, 矩阵设计为9×9, 点间距0.5 mm。
图1显示了样品点在芯片上的排列分布情况。
2.1.3 芯片的交联与扫描 将芯片放于HW-8B型超
级微量恒温器上, 保湿10~30 s后放入Stratagene公
司的UV Stratalinker 2400紫外交联仪内, 交联10
min。交联后的基因芯片用Axon Instruments公司
的GenePix 4000B扫描仪进行荧光扫描, 该扫描仪
配有GenePix Pro生物芯片分析软件。
2.2 芯片杂交
2.2.1 RNA提取 分别以景洪疣粒野生稻接种Xoo
(C1和Y8)菌株24、48、72 h及接种蒸馏水(对照)
的叶片为材料, 采用TRIzol Reagent方法, 提取叶片
总RNA。采用紫外分光光度法测浓度, 并进行电
泳检测。
2.2.2 荧光标记 逆转录时进行荧光标记, 对照用
cy3标记, 3个处理等量混合用cy5标记, 反应体系为
40 µL。取对照RNA10 µL (7 µg)或接种处理24、
48、72 h的RNA各5 µL (共15 µg), oligo dT 3 µL,
70 ℃下放5 min后, 立即放置于冰上, 再加5×缓冲
液8 µL、10×low T dNTP mix 4 µL、cy3-dUTP (对
照)或cy5-dUTP (处理) 4 µL、RNasin 1.5 µL、
MMLV 1 µL, 加水补到40 µL, 37 ℃下放2 h, 70 ℃
下放10 min。
2.2.3 杂交与扫描 预杂交时, 将芯片放到有浸湿
罗玉等: 疣粒野生稻应答黄单胞杆菌水稻致病变种(Xoo)的基因芯片 823
滤纸的杂交盒中, 在芯片点阵位置滴加42 ℃预热
的杂交液, 完全覆盖住点阵, 盖上盖玻片, 将杂交
盒放入42 ℃的温箱中保温2 h; 在洗脱液中漂洗5
min, 用四蒸水漂洗后甩干。杂交时, cy3和cy5标记
的样品等量混合, 再与杂交液等量混合。将芯片
放到有浸湿滤纸的杂交盒上, 在芯片点阵位置滴
加42 ℃预热的混合液, 完全覆盖住点阵, 盖上盖玻
片, 将玻璃杂交盒放入42 ℃的温箱中保温4 h。洗
涤与扫描时, 将杂交好的芯片用洗液I (20×SSC:
10% SDS:ddH2O=5:1:100)和洗液II (20×SSC:10%
SDS:ddH2O=1:4:400)在30 ℃水浴(80 r·min-1)中各
洗5 min, 然后用四蒸水漂洗、甩干后扫描。
2.2.4 图像扫描数据的获取 采用GenePix Pro生物
芯片分析软件, 计算机生成32个小矩阵网格, 调节
确定网格在芯片扫描图像上的位置, 对样点进行识
别并读取数据, 弃除无效数据(flags≥0, 前景值-背
景值+2SD≥0), 对所有有效数据点的杂交信号作
散点图, 计算各点R值, 即先计算内参cy5/cy3值, 用
内参cy5/cy3平均值对所有有效数据点进行归一化
处理, 各点归一化处理后的cy5/cy3比值为R值。R
值≥1.5的为明显上调表达; R值≤0.5的为明显下调
表达; R值=0.5~1.5的为表达无明显变化。选取微阵
列点上的克隆测序, 在NCBI基因库上进行比对。
2.2.5 芯片杂交结果的RT-PCR验证 以半定量RT-
PCR方法验证微阵列上基因的表达情况, 内参为疣
粒野生稻的看家基因β-actin, 选取微阵列上的部分
点, 根据测序结果设计引物(表1)。采用TRIzol Re-
agent方法, 分别以景洪曼丢疣粒野生稻接种Xoo
表1 引物序列
Table 1 The sequence of primers
芯片编号 引物序列
β-actin F: 5 GCAGAAGGATGCCTATGTTG 3; R: 5 GGACCCTCCTATCCAGACAC 3
1 943 F: 5 CGCGGATCCAAGCTTATCGAT 3; R: 5 GCCTTGACATTCTCAAGGAAC 3
1 938 F: 5 ATTACCTACAACGTGGGAATGG 3; R: 5 ATTTCGGAGGCTTCTGGGTA 3
1 784 F: 5 CGCGGATCCAAGCTTATCGAT 3; R: 5 GCGTGAAGAAAGGAACCAGC 3
1 906 F: 5 ATGAGGTTGAAGGCAGAC 3; R: 5 GGGTGGAGGTAGAATAACAG 3
2 416 F: 5 AAACAATGTCAAAGCCCTAT 3; R: 5 TCTCACGCCTGAAGATACTG 3
图1 DNA微阵列的样品排列
Fig.1 The arrangement of samples on DNA microarray
A: 29号小矩阵中样品点的排列; B: 32个小矩阵在玻片上的排列。
植物生理学报824
(C1和Y8)菌株24、48、72、96、120 h及未接种
(接蒸馏水)叶片为材料提取总RNA, 取2 μg进行逆
转录合成cDNA, 用等量模板进行PCR扩增。以各基
因点与β-actin光密度值之比判定基因表达情况。
结果与讨论
1 芯片点制
交联后的基因芯片进行荧光扫描, 扫描结果未
出现漏点情况, 点大多圆而饱满, 排列较整齐(图2)。
3 杂交后芯片扫描
提取的总RNA在逆转录时标记荧光, 未接种
的对照用cy3标记, 接种Xoo的用cy5标记, 与点制
好的芯片杂交, 对杂交后的芯片进行扫描, 结果显
示20%左右的点差异表达明显, 但芯片下部背景值
偏高(图4)。
2 总RNA提取
总RNA的变性琼脂糖凝胶电泳检测结果显
示, 28S rRNA的量为18S rRNA的2倍以上, 总RNA
纯度和完整性较好(图3)。
图4 杂交后芯片的扫描图
Fig.4 Scanning map of the chip after hybridization
A: 整体; B: 局部放大。
4 图像采集及数据分析
从杂交数据看, R值偏低。根据各点杂交信号
生成杂交信号散点图(图5), 在斜率为1的线上的点
是表达无变化的基因, 越远离该线的点代表该基
因表达差异越明显。
5 RT-PCR验证
以β-actin为内参, 对芯片上编号为1 943、
1 938、1 784、1 906、2 416的基因点进行半定量
RT-PCR检测, 电泳结果见图6。芯片杂交数据显
示 , 上述编号基因点的R值分别为 : 1.37931、
图3 接种Xoo 24~72 h后抽提的总RNA
Fig.3 Extracted total RNA after inoculating Xoo 24~72 h
图5 微阵列杂交信号散点图
Fig.5 Scatterplot of hybridization signal intensity in microarray
图2 交联后未杂交芯片扫描图
Fig.2 Scanning map of the chip before hybridization
A: 整体; B: 局部放大。
罗玉等: 疣粒野生稻应答黄单胞杆菌水稻致病变种(Xoo)的基因芯片 825
2.382643、0.333038、1.574396、1.201795。可见
1 938号基因表达明显上调, 而1 784号基因表达下
调, 结果一致。
们比对无同源序列的35个克隆应属于这78 Mb中
的序列。
比对的大部分插入片段能查到同源序列, 未
知功能的多为水稻的同源序列 , 也有普通野生
稻、药用野生稻、玉米的同源序列。比对的功能
已知基因中明显上调表达的基因有: 富含脯氨酸
蛋白、泛素连接酶、伸展蛋白、谷胱甘肽S-转移
酶II、脂类转移酶等, 明显下调表达的基因有: 细
胞色素P450单加氧酶、醛缩酶、金属硫蛋白、硫
氧还蛋白、热激蛋白等, 表达无明显变化的基因
有: 抗坏血酸过氧化物酶、转铜伴侣、脂酶、花
丝温敏H2A蛋白等。另外, 10个未知功能的序列上
传NCBI基因库注册。
测序比对结果中应答基因的主要类型有 :
NBS-LRR型基因、蛋白质降解相关基因、热激蛋
白基因、金属硫蛋白基因、转铜伴侣基因、查尔酮
合酶基因、酯类相关基因、磷酸化相关基因等。根
据芯片比对结果, 编号为1 734、2 225、2 350、2 325
的4个序列属于脂质转运蛋白(lipid transfer pro-
teins, LTPs)基因, R值分别为1.07094、1.483213、
1.539210、0.870633, 多为上调表达。脂质转运蛋
白是病程相关蛋白, 属于PR-14家族, 与角质层和
蜡质层的形成有关, 离体条件下有抗真菌和细菌
的特性。在烟草和拟南芥中, LTP的表达增强都提
高了植物对病原菌的抗性(Molina和García-Olmedo
1997; Chassot等2007)。LTP有类似激发子的作用,
能启动植物过敏反应和非特异性系统抗性(Buhot
等2001)。在葡萄中LTP和茉莉酸被认为是系统获
得性抗性中可以移动的信号物(Girault等2008)。
编号为2 398、2 393、2 432、1 943的4个序列
属于泛素类物质基因(有泛素连接酶基因和泛素
结合酶基因), R值分别为2.382643、0.19578、
0.838338、1.37931。其中1 943号同源基因登录号
为NM-001036151, 被病原菌诱导上调表达。根据
测序结果设计引物, 用cDNA末端快速扩增技术
6 测序比对
芯片上2 436个样品点中, 选取近800个点的克
隆进行测序, 测序有效片段为783个, 将其在NCBI
基因库中比对, 结果见表2。有35个点无同源序列,
由于水稻基因组测序已完成, 因此比对无同源序
列的克隆可能是疣粒野生稻特异的, 应答Xoo接种
在叶中表达的基因, 值得关注。栽培稻基因组大
小为450 Mb, 疣粒野生稻基因组大小为1 201 Mb,
蓝伟侦等(2006)对水稻和几种野生稻基因组研究
后发现, 中度和高度重复序列占栽培稻和疣粒野
生稻基因组比例为(47.10±0.16)%和(44.38±0.13)%,
栽培稻和疣粒野生稻基因组各有365和591 Mb是
基因组中的单拷贝和低拷贝序列, 可能是基因, 或
者是非编码序列。栽培稻基因组DNA在疣粒野生
稻基因组中的覆盖率约为93.6%, 被栽培稻基因组
覆盖的疣粒野生稻基因组大小约为1 123 Mb, 另有
78 Mb的序列为疣粒野生稻有而栽培稻没有。我
表2 基因表达和测序比对结果统计
Table 2 Summary of gene expression and the results of sequencing and BLAST
芯片样品数 明显上调表达的片段数 表达无明显变化的片段数 明显下调表达的片段数
2 436 (数据有效2 282) 383 1 063 836
测序有效片段中无同源序列的35 4 13 18
测序有效片段中有同源序列的748 100 296 352
图6 疣粒野生稻应答Xoo基因表达的RT-PCR验证
Fig.6 RT-PCR confirmation of O. granulata gene
expression in response to Xoo
植物生理学报826
(RACE)扩增出全长, 包含1 496个核苷酸, 编码148
个氨基酸。推导出的蛋白质理论等电点(PI)为
8.07, 分子量为16.51 kDa。利用DAS跨膜预测服务
站对该蛋白进行跨膜域预测的结果显示, 该序列
有明显的跨膜区域(图7)。采用SMART软件对其
进行结构域分析, 发现在4~147位氨基酸残基之间
存在一个泛素结合蛋白共有的保守UBCc结构域,
属于泛素结合酶E2类基因。植物可通过泛素活化
酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)等泛素
分子的联合作用将靶蛋白泛素化降解而建立起植
物防御, 包括基因对基因抗性、早期防御反应和
诱导疾病抗性等不同防御(Delaure等2008)。如
RAR1和SGT1是R基因介导的抗病反应途径的早
期信号成员, 它们可与E3结合而被泛素化(Aze-ve-
do等2002; Liu等2002)。R蛋白完成功能后, 也会被
泛素化降解(Kim和Delaney 2002)。
如Wang等(2005)用来自于差减文库的cDNA微阵
列分析了接种晚疫病菌后马铃薯晚疫病数量抗性
相关基因表达模式, 获得了114个应答晚疫病菌的
未知功能新基因; 庄晓峰等(2005)用水稻cDNA微
阵列检测水稻近等基因系H7R/H7S受稻瘟病菌诱
导的表达谱差异, 获137条未知基因, 其中发现一
个新的抗稻瘟病的OsBTB基因。另外, 基因芯片所
含EST的数量对筛选结果影响很大。储朝晖等
(2004)在构建水稻全生育期均一化cDNA文库时发
现, 分别用孕穗期的叶片、接种了白叶枯病原菌
的叶片、抽穗期全株水稻建成的cDNA文库所含
的EST有很大差别。本实验的芯片样品来源的两
个文库都是用疣粒野生稻的叶片构建的, 只有在
叶中表达的基因才有可能被筛选到, 而在其他器
官特异表达的基因用该芯片筛选不到。除植物基
因芯片外, 病原菌的基因芯片也已被用于植物的
抗病研究中(张新建2006)。相信随着微阵列上基
因样品达到一定的数目, 高通量的cDNA微阵列能
成为研究植物抗病机制和克隆新的抗病基因的重
要研究手段。
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编号为2 150、1 926、2 430、2 288的4个序列
属于热激蛋白(heat-shock protein, HSP)基因, R值
分别为0.857391、0.926755、0.489434、0.838338。
热激蛋白HSP90有分子伴侣功能, 多种R蛋白要完
成其功能需要HSP90帮助其正确折叠(Shirasu和
Schulze-Lefert 2003)。
基因芯片技术在植物抗细菌(Naidoo等2007;
Kim等2006)、真菌(Myburg等2006; Coram和Pang
2005)、病毒(Pompe-Novak等2006)病害的研究中
得到广泛运用, 由此筛选到许多抗病相关基因。
图7 芯片上1 943号基因的蛋白跨膜域预测
Fig.7 Transmembrane-segment prediction of the protein of
No. 1 943 gene on the chip
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